Ein Kreislauf von Neurotensin-Neuronen des lateralen Septums zum Tuberkulosekern steuert die hedonische Ernährung

Molecular Psychiatry Band 27, Seiten 4843–4860 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Das Fressverhalten wird sowohl durch die homöostatischen Bedürfnisse des Körpers als auch durch die hedonischen Werte der Nahrung reguliert. Der einfache Zugang zu schmackhaften, energiereichen Lebensmitteln und die daraus resultierende Fettleibigkeitsepidemie unterstreichen die dringende Notwendigkeit eines besseren Verständnisses neuronaler Schaltkreise, die die hedonische Ernährung regulieren. Hier berichten wir, dass Neurotensin-positive Neuronen im lateralen Septum (LSNts) eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der hedonischen Ernährung spielen. Die Stummschaltung von LSNts fördert gezielt die Nahrungsaufnahme von schmackhaften Nahrungsmitteln, wohingegen die Aktivierung von LSNts die allgemeine Nahrungsaufnahme unterdrückt. LSNts-Neuronen projizieren über GABA-Signale zum Tuberkulosekern (TU), um die hedonische Nahrungsaufnahme zu regulieren, während das Neurotensinsignal von LSNts→dem supramammillären Kern (SUM) ausreicht, um die allgemeine Nahrungsaufnahme zu unterdrücken. In-vivo-Kalziumbildgebung und optogenetische Manipulation zeigen zwei Populationen von LSNts-Neuronen, die während der Nahrungsaufnahme aktiviert und gehemmt werden und zur Nahrungssuche bzw. Nahrungsaufnahme beitragen. Die chronische Aktivierung von LSNts oder LSNts→TU reicht aus, um durch fettreiche Ernährung verursachte Fettleibigkeit zu reduzieren. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass LSNts→TU ein Schlüsselweg bei der Regulierung der hedonischen Ernährung ist.

Die Häufigkeit von Fettleibigkeit und damit verbundenen Stoffwechselerkrankungen hat in den letzten Jahrzehnten rapide zugenommen und ist weltweit zu einem großen Gesundheitsproblem geworden [1]. Ein Hauptgrund für die Adipositas-Pandemie ist übermäßiges Essen, das durch die überwältigende Verfügbarkeit von äußerst schmackhaften, kalorienreichen Nahrungsmitteln in der modernen Gesellschaft verursacht wird. Die Nahrungsaufnahme kann durch den Energiebedarf gesteuert werden, was ein evolutionär konservierter Mechanismus zur Aufrechterhaltung der metabolischen Homöostase ist. Diese homöostatische Ernährung wird streng durch die Aktivität von Gehirnnetzwerken und zirkulierenden Hormonen kontrolliert [2,3,4]. Andererseits basiert die hedonische Ernährung auf der Freude am Verzehr schmackhafter Nahrung ohne Stoffwechselbedarf, was ein wesentlicher Faktor für übermäßiges Essen und Fettleibigkeit ist [5].

Obwohl die neuronalen Schaltkreise, die die homöostatische Ernährung vermitteln, ausführlich untersucht wurden, ist viel weniger über die neuronalen Substrate bekannt, die die hedonische Ernährung regulieren [6,7,8]. Homöostatische und hedonische Ernährung könnten durch separate und unterschiedliche neuronale Schaltkreise verarbeitet werden [6]. Die hypothalamischen Kerne, einschließlich des Nucleus arcuatus (ARC) und des lateralen Hypothalamusbereichs (LHA), sind bekannt dafür, die homöostatische Nahrungsaufnahme zu vermitteln, die Hungersignale in Nahrungssuche und -konsum umwandelt [9]. Im Allgemeinen wird angenommen, dass die hedonische Nahrungsaufnahme durch das mesolimbische dopaminerge Belohnungssystem vermittelt wird, einschließlich des ventralen Tegmentalbereichs (VTA) und seines Ziels, des Nucleus accumbens (NAc) [2, 10, 11]. Allerdings hören gentechnisch veränderte Mäuse mit Dopaminmangel innerhalb weniger Wochen nach der Geburt auf zu fressen und sterben [12], was darauf hindeutet, dass das VTA-Dopaminsystem auch eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Verhaltensweisen spielt, die für das Überleben der Tiere wichtig sind, wie z. B. die homöostatische Fütterung. Darüber hinaus sind Agouti-verwandte Peptide (AGRP) exprimierende Neuronen im ARC bei der Steuerung der homöostatischen Ernährung gut charakterisiert [13]. Die Ablation von AGRP-Neuronen macht den Verzehr von normalem Futter unmöglich, hatte jedoch keinen Einfluss auf die durch Ghrelin induzierte schmackhafte Nahrungsaufnahme [14]. Laut einer aktuellen Studie fördert die Aktivierung des Inputs des anterioren paraventrikulären Thalamus (aPVT) in den NAc die hedonische Fütterung fettreicher Nahrung, hat jedoch keinen Einfluss auf die Futteraufnahme über Nacht [15]. Diese Studien legten nahe, dass unterschiedliche neuronale Schaltkreise unterschiedlich zur homöostatischen und hedonischen Ernährung beitragen könnten.

Das laterale Septum (LS) empfängt Hippocampus-Eingaben und sendet massive Projektionen an den Hypothalamus; Daher eignet es sich besonders gut für die Integration von Kontextinformationen wie der Schmackhaftigkeit von Nahrungsmitteln, um das Fressverhalten zu steuern. Frühere Studien deuteten auf eine mögliche Rolle des LS bei der Regulierung sowohl der allgemeinen Ernährung als auch der stressbedingten Angst hin [4, 16]. Es ist jedoch wenig darüber bekannt, wie LS-Zelltypen und -Schaltkreise zur hedonischen Ernährung beitragen.

Wir untersuchten die Beteiligung des LS an der Regulierung der hedonischen Nahrungsaufnahme, indem wir die Gehirnaktivierung während des Verzehrs von schmackhaften Nahrungsmitteln ohne Energiedefizit untersuchten und dann die LS-Aktivierung während des Verzehrs von normalem Futter mit denen von schmackhaften Nahrungsmitteln verglichen. Mit diesem Ansatz identifizierten wir eine Untergruppe von Neurotensin-exprimierenden GABAergen Neuronen im lateralen Septum (LSNts), die während der hedonischen Ernährung spezifisch aktiviert wurden. Die Stummschaltung von LSNts durch Tetanus-Neurotoxin-vermittelte synaptische Inaktivierung oder optogenetische Ansätze fördert gezielt die Nahrungsaufnahme mit schmackhafter Nahrung. Die Aktivierung von LSNts unterdrückt jedoch die allgemeine Nahrungsaufnahme. Sowohl der kanonische Neurotransmitter GABA als auch das Neuropeptid Neurotensin tragen zu den modulierenden Wirkungen von LSNts-Neuronen auf die Nahrungsaufnahme bei. LSNts projizieren über GABA zum Tuberalkern (TU), um die hedonische Nahrungsaufnahme zu regulieren, während das Neurotensinsignal in LSNts → dem supramammillären Kern (SUM) ausreicht, um die allgemeine Nahrungsaufnahme zu unterdrücken. Die Identifizierung präziser Moleküle, Zelltypen und Schaltkreise kann dazu beitragen, neuartige Therapeutika zu entwickeln, die auf die hedonische Ernährung zur Behandlung von Fettleibigkeit und damit verbundenen Stoffwechselerkrankungen abzielen.

Alle Haltungs- und Versuchsverfahren in dieser Studie wurden von den Animal Care and Use Committees des Shenzhen Institute of Advanced Technology (SIAT) der Chinesischen Akademie der Wissenschaften (CAS) genehmigt. Erwachsener (3–5 Monate alter) männlicher C57BL/6 J (Guangdong Medical Laboratory Animal Center, Guangzhou, China), Nts-ires-Cre (Jax-Nr. 017525), Rosa26-LSL-Cas9 (Jax-Nr. 024857) In dieser Studie wurden Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden bei 22–25 °C in einem zirkadianen Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit gehalten.

Wir haben AAV2/9-hSyn-mCherry-P2A-TetTox-WPRE-pA, AAV2/9-hEF1a-DIO--hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA, AAV2/9-hSyn-DIO-hChR2(H134R) gekauft. -mCherry-WPRE-pA, AAV2/9-hEF1a-DIO-eNpHR3.0-EYFP, AAV2/9-hSyn-FLEX-GCamP6s-WPRE-pA, AAV2/2Retro-hSyn-DIO-GCaMP6s-WPRE-pA, AAV2 /9-hEF1a-DIO-EYFP-WPRE-pA, AAV2/9-hEF1a-DIO-mCherry-WPRE-pA, AAV2/9-hSyn-FLEX-tdTomato-T2A--synaptophysin-EGFP-WPRE-pA, scAAV2/ 2Retro-hsyn-FLEX-Flpo-pA, AAV2/9-hEF1a--fDIO-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA von Tailtool. AAV-U6-sgRNA(LacZ)-pCbh-DIO--hM3D(Gq)-mCherry, AAV-U6-sgRNA(vGAT)-pCbh-DIO-hM3D(Gq)-mCherry und AAV--U6-sgRNA(Nts) -CAG-DIO-hM3D(Gq)-mCherry wurden von BrainCase unter Verwendung von Konstrukten hergestellt, die von Y. Dan von der University of California Berkeley bereitgestellt wurden. Das Clozapin-N-oxid (BML-NS105-0025) wurde von Enzo bezogen. CTB-488 (C34775), CTB-555 (C34776) und CTB-647 (C34778) wurden von Thermo Fisher gekauft. Der c-fos-Antikörper (2250) wurde von Cell Signaling Technology erworben. Die Antikörper GFP (ab13970) und mCherry (ab167453, ab205402) wurden von Abcam erworben. Die RNA-Sonden und RNAScope-In-situ-Hybridisierungsreagenzkits wurden von ACDbio erworben.

Mäuse wurden durch intraperitoneale Injektion von Pentobarbital (80 mg/kg) anästhesiert. Es wurde eine Standardoperation durchgeführt, um die Gehirnoberfläche über LS, POA, AHN, TU oder SUM freizulegen. Die für die LS-Injektion verwendeten Koordinaten waren: Bregma +0,75 mm, lateral ±0,35 mm und Dura –2,85 mm. Die für die POA-Injektion verwendeten Koordinaten waren: Bregma +0,62 mm, lateral ±0,25 mm und Dura –4,25 mm. Die für die AHN-Injektion verwendeten Koordinaten waren: Bregma –0,80 mm, lateral ±0,40 mm und Dura –5,0 mm. Die für die TU-Injektion verwendeten Koordinaten waren: Bregma –1,94 mm, lateral ±1,20 mm und Dura –5,10 mm. Die für die SUM-Injektion verwendeten Koordinaten waren: Bregma –3,0 mm, lateral ±0,25 mm und Dura –4,4 mm. Die AAV-Vektoren und CTB-488/594/633 wurden stereotaktisch mit einer Glaspipette, die an einen Nanoliter-Injektor (Drummond Scientific Company) angeschlossen war, mit einer langsamen Flussrate von 60 nl/min injiziert, um eine mögliche Schädigung des lokalen Hirngewebes zu vermeiden. Die Pipette wurde mindestens 10 Minuten nach der Virusinjektion entnommen.

Für Experimente zur synaptischen Inaktivierung und chemogenetischen Aktivierung sind alle Injektionen (AAV-DIO-EGFP-2A-TeNT, AAV-DIO-EYFP, AAV-DIO-hM3D-mCherry, AAV-DIO-mCherry, AAV-Retro-Flex-FlpO, AAV -fDIO-hM3D-mCherry, AAV-sgRNA(LacZ/ vGAT / Nts)-DIO-hM3D-mCherry) waren bilateral. Verhaltenstests wurden 3 Wochen nach der Virusinjektion durchgeführt. Für Pathway-Tracing-Experimente erfolgten die AAV- (AAV-DIO-tdTomato-T2A-Synaptophysin-EGFP) und CTB-Injektionen einseitig auf derselben Seite. Histologische Analysen wurden 1 Woche (für CTB) bzw. 3 Wochen (für AAV) nach der Injektion durchgeführt. Für optogenetische Manipulation, Faserphotometrie und Calcium-Imaging-Experimente wurden die AAV-Injektionen (AAV-DIO-ChR2-mCherry, AAV-DIO-mCherry, AAV-DIO-eNpHR-EYFP, AAV-DIO-EYFP, AAV-DIO-GCaMP6m) verwendet einseitig durchgeführt und anschließend eine Glasfaser- oder Miniaturmikroskopimplantation durchgeführt, wie unten beschrieben.

Dreißig Minuten nach den AAV-Injektionen wurde eine Keramikhülse mit einer optischen Faser (200 µm Durchmesser, NA 0,37) implantiert, wobei die Faserspitze oben auf dem LS lag (Bregma +0,75 mm, lateral +0,35 mm und Dura –2,70 mm). , TU (Bregma –1,94 mm, lateral +1,20 mm und Dura –4,80 mm) oder SUM (Bregma –3,0 mm, lateral ±0,25 mm und Dura –4,1 mm). Anschließend wurde die Zwinge mit lichthärtbarem Kunstharz am Schädel befestigt. Nach der Implantation wurde die Haut vernäht und Antibiotika auf die Operationswunde aufgetragen. Die optogenetischen und faserphotometrischen Experimente wurden mindestens 3 Wochen nach der Glasfaserimplantation durchgeführt.

Das Verfahren der Miniaturmikroskopie-Operation war wie zuvor beschrieben (Resendez et al., 2016). Drei Wochen nach der AAV-DIO-GCaMP6-AAV-Injektion wurde eine GRIN-Linse (Go!Foton, Kat.-Nr. CLHS050GFT009) mit der Linsenspitze oben auf dem LS implantiert (Bregma +0,75 mm, lateral +0,35 mm und Dura –2,70 mm). . Anschließend wurde die Linse mit lichthärtbarem Kunstharz am Schädel befestigt. Die Grundplatte wurde 3 Wochen nach der Implantation der GRIN-Linse angebracht. Verhaltensexperimente wurden mindestens eine Woche nach der Genesung von der Befestigung an der Grundplatte begonnen.

Nach der Virusinjektion oder der Faserimplantation wurden die Mäuse vor den Verhaltenstests mindestens drei Wochen lang in Gruppen (3 bis 5 Tiere pro Käfig) gehalten. Sie wurden vor den Verhaltenstests mindestens drei Tage lang täglich von den Experimentatoren angefasst. Alle Verhaltensweisen wurden von den Experimentatoren bewertet, die keine Ahnung von der Behandlung der Tiere hatten. Alle Verhaltensexperimente wurden im Labor mindestens dreimal wiederholt.

Die Mäuse wurden mindestens 3 Tage vor den Tests zur Aufnahme fester Nahrung einzeln gehalten. Während der Experimente zum Fressverhalten wurden die verschiedenen Futterarten (Standardfutter, Futter mit hohem Saccharosegehalt oder Futter mit hohem Fettgehalt, ca. 20 g) täglich ausgetauscht und die Käfige täglich gewechselt, um zu verhindern, dass sich Futterreste am Boden ansammeln. Die Futteraufnahme wurde manuell im Heimkäfig während der frühen Dunkelphase (20:00–22:00 Uhr) berechnet, indem das Futter kurzzeitig aus den Käfigen genommen und sein Gewicht gemessen wurde. Und die Kalorienaufnahme wurde gemäß Lastenblatt berechnet. Um mögliche Auswirkungen von Stress durch eine Ernährungsumstellung zu vermeiden, wurden die Mäuse mindestens drei Tage lang an die neue Ernährung gewöhnt.

Für das c-fos-Kartierungsexperiment wurde das Fütterungsexperiment mit oder ohne Energiedefizit durchgeführt. In der Kontrollfütterungsgruppe wurden die Mäuse ad libitum mit Standard-Laborfutter gefüttert. In der hedonischen Fütterungsgruppe hatten die Mäuse uneingeschränkten Zugang zu Standardfutter, während 7 aufeinanderfolgende Tage lang täglich 2 Stunden lang Futter mit hohem Saccharosegehalt bereitgestellt wurde. Die Nahrungsaufnahme während dieses 2-Stunden-Zeitraums wurde überwacht. Bei der Fütterung aufgrund eines akuten Energiedefizits wurde die Nahrung für 22 Stunden entfernt (Gruppe ohne Nahrung) und dann mit Standardnahrung (Gruppe ohne Nahrung + Nahrung) oder Nahrung mit hohem Saccharosegehalt (Gruppe ohne Nahrung + HSF) versorgt. Das Experiment wurde im Labor dreimal wiederholt.

Für TeNT-induzierte synaptische Inaktivierungs- und CRISPR/Cas9-vermittelte Knockdown-Experimente wurde die Aufnahme verschiedener Nahrungsmittel nacheinander im gesättigten oder nüchternen Zustand gemessen, wie oben beschrieben.

Für chemogenetische Aktivierungsexperimente wurde die Nahrungsaufnahme 30 Minuten nach intraperitonealen Injektionen von Kochsalzlösung (0,9 %; 200 μl) oder CNO (Katalog-Nr. BML-NS105-0025, Enzo, 2 mg/kg Körpergewicht in Kochsalzlösung) gemessen. Die Aufnahme verschiedener Nahrungsmittel wurde nacheinander im gesättigten bzw. nüchternen Zustand gemessen.

Für die Tests zur Nahrungsaufnahme mit freier Flüssigkeit wurden die Mäuse vor dem Experiment einzeln mit Ad-libitum-Nahrung und Wasser in Käfigen gehalten. Während des Experiments wurden die Mäuse in die operante Konditionierungskammer (22 cm × 16 cm × 15 cm, AniLab) gebracht. Alle 10 s wurde ein Tropfen (10 μl) Flüssigkeit (Wasser, 10 % Saccharoselösung, Consider oder Stärkelösung) abgegeben, wobei die Sequenz 180 Mal wiederholt wurde. Die Flüssigkeit wurde durch eine Pumpe herausgedrückt, die die flüssigkeitshaltige Spritze enthielt. Das Lecken wurde mit einem speziell angefertigten Leckmesser mit kapazitivem Berührungssensor (Sparkfun MPR121) und einem Mikrocontroller (Arduino) überwacht. Von Tag 1 bis Tag 3 wurde den Mäusen beigebracht, den Auslauf zu lecken. Für TeNT-induzierte Experimente zur synaptischen Inaktivierung wurde nach dreitägigem Training der Verbrauch der verschiedenen Flüssigkeiten am Tag 4 gemessen. Für Experimente zur chemogenetischen Aktivierung wurden Mäuse am Tag 4 nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen aufgeteilt und mit Kochsalzlösung oder CNO (2 mg) behandelt /kg Körpergewicht in Kochsalzlösung, IP) 30 Minuten vor dem Test. Am nächsten Tag (Tag 5) wurden die Mäuse mit CNO oder umgekehrt mit Kochsalzlösung behandelt und erneut getestet. Für Experimente zur optogenetischen Hemmung wurde ein diodengepumptes Festkörperlasersystem mit 593 nm verwendet, um den blauen 593-nm-Laser zur Lichtstimulation zu erzeugen. Ein FC/PC-Adapter wurde verwendet, um den Ausgang des Lasers mit der implantierten Ferrule für die intrakranielle Lichtabgabe zu verbinden. Am vierten Tag wurden die Mäuse in die Verhaltenskammer gesetzt und der Verzehr von flüssigem Futter wurde gemessen, während das Licht ausgeschaltet war. Am 5. Tag wurden die Mäuse zur Untersuchung der Nahrungsaufnahme in die gleiche Kammer gebracht, während während der gesamten Fütterungssitzung konstant eine Stimulation mit gelbem Licht (593 nm) abgegeben wurde.

Für die anreizbedingte Zufuhr von Flüssigkeiten (sicherstellen, regelmäßige flüssige Nahrung, Wasser) wurde alle 20–24 Sekunden nach Beginn des Versuchs ein 1-sekündiger akustischer Hinweis (20 kHz) präsentiert. Unmittelbar nach der Präsentation des Hinweises wurde ein Tropfen (10 μl) flüssiger Nahrung durch eine Pumpe herausgedrückt, die die flüssigkeitshaltige Spritze hielt. Das Lecken wurde mit einem speziell angefertigten Leckmesser mit kapazitivem Berührungssensor (Sparkfun MPR121) und einem Mikrocontroller (Arduino) überwacht.

Für die selbstgesteuerte, freie Fütterung von flüssigem Futter hatten die Mäuse in jeder selbstgesteuerten Fütterungssitzung 30 Minuten lang über den Lickometer-Auslauf freien Zugang zu „Sicherstellen“. Sobald ein Lecken festgestellt wurde, wurde ein Tropfen (10 μl) von Consider abgegeben. Jede Konsumsitzung im eigenen Tempo umfasste normalerweise mehrere Konsumanfälle. Jeder Kampf wurde als kontinuierliches Lecken mit einem Intervall zwischen den Lecks von weniger als 6 Sekunden definiert. Die neuronale Dynamik wurde zur weiteren Analyse auf den ersten Schlag jedes Kampfes ausgerichtet.

Für die optogenetische Manipulation während verschiedener Fütterungsphasenexperimente in Abb. 5D – F wurde das blaue Licht (473 nm) mit 20 Hz (20 ms Pulsdauer) während der Annäherungs- oder Verbrauchsphase abgegeben, während das gelbe Licht (593 nm) angewendet wurde ständig während der Annäherungs- oder Verbrauchsphase.

Am Tag des Verhaltenstests wurden die Mäuse in den Testraum gebracht und vor Beginn der Experimente drei Stunden lang an die Raumbedingungen gewöhnt. Das Gerät wurde mit 20 % Ethanol gereinigt, um den Geruch anderer Mäuse zu beseitigen. Die Mäuse wurden in eine offene Feldkammer aus Kunststoff (40 × 40 cm) gebracht. Die Standorte der Mäuse wurden mithilfe einer benutzerdefinierten MATLAB-Tracking-Software bei einer Abtastfrequenz von 30 Hz überwacht. Die Kammer wurde konzeptionell in ein zentrales Feld (25 × 25 cm) und ein peripheres Feld zur Analyse unterteilt. Die gesamte Fortbewegung und das Verhältnis der im Zentrum verbrachten Zeit wurden analysiert.

Für akute chemogenetische Aktivierungsexperimente wurden Mäuse nach dem Zufallsprinzip in zwei Gruppen eingeteilt und 30 Minuten vor dem Test mit Kochsalzlösung oder CNO (2 mg/kg Körpergewicht in Kochsalzlösung, IP) behandelt. Den Mäusen wurde erlaubt, sich 10 Minuten lang frei zu bewegen. Am nächsten Tag wurden die Mäuse mit CNO oder umgekehrt mit Kochsalzlösung behandelt und erneut getestet. Für Experimente zur chronischen chemogenetischen Aktivierung wurden Mäuse vor dem Test nicht mit CNO behandelt.

Für Experimente zur optogenetischen Hemmung wurden Mäuse in die Kammer gesetzt und 20 Minuten lang mit gelbem Licht stimuliert (593 nm, kontinuierliches Licht mit 5 Minuten EIN und 5 Minuten AUS im Wechsel).

Nach der Virusinjektion wurden die Mäuse in Gruppen (3–5 Tiere pro Käfig) gehalten und mit Standardfutter gefüttert. Nach 3 Wochen wurde das Körpergewicht täglich gemessen. Für TeNT-induzierte Experimente zur synaptischen Inaktivierung wurden Mäuse mit Standardfutter gefüttert oder auf fettreiches Futter umgestellt. Für chemogenetische Aktivierungsexperimente wurden die verschiedenen Gruppen mit Standardfutter gefüttert oder auf fettreiche Nahrung umgestellt. CNO (1 mg/kg in Kochsalzlösung, IP) wurde zweimal täglich injiziert.

Der Energieverbrauch wurde mit einem indirekten Kalorimetriesystem (Oxymax, Columbus Instruments) gemessen, das bei einer konstanten Umgebungstemperatur (22–25 °C) und einem 12-Stunden-Hell-/12-Stunden-Dunkel-Zyklus installiert wurde. In jeder Kammer hatten die Mäuse freien Zugang zu Futter und Wasser.

Um den Blutzucker zu messen, wurde der Mäuseschwanz am Ende mit einer Rasierklinge horizontal durchtrennt und ein kleiner Blutstropfen gesammelt. Anschließend wurde der Glukosespiegel mit einem Blutzuckermessgerät (Bayer) gemessen. Für chemogenetische Aktivierungsexperimente wurden die basalen Blutzuckerspiegel zunächst zu Beginn der Dunkelphase der Photoperiode gemessen. Nach Injektionen von CNO (2 mg/kg Körpergewicht in Kochsalzlösung, IP) wurden die Blutzuckerwerte 30 Minuten später gemessen. Während des Blutzuckermesszeitraums wurde keine Nahrung zugeführt. Für TeNT-induzierte Experimente zur synaptischen Inaktivierung wurde der Nüchternblutzucker nach einem Fasten über Nacht (16 Stunden) gemessen. Anschließend erhielten diese nüchternen Mäuse per Sonde eine orale Dosis (1,5 g/kg) einer 30 %igen D-Glucose-Lösung (Katalog-Nr. G6125, Sigma-Aldrich). Blut wurde zu Studienbeginn und 10, 30, 60, 90 und 120 Minuten nach der Glukoseverabreichung gesammelt.

Zur Blutdruck- und Herzfrequenzmessung wurde das BP-2000 Blood Pressure Analysis System™ (Visitech-System) eingesetzt und die Bedienungsanleitung befolgt. Das BP-2000 verwendet Transmissionsphotoplethysmographie, bei der Schwankungen der durch den Schwanz durchgelassenen Lichtmenge analysiert werden, um den Blutdruck und die Pulsfrequenz zu bestimmen. Die Tiere wurden zunächst drei Tage lang an die Blutdruckmessung gewöhnt, bevor mit dem formalen Experiment begonnen wurde. Die Messungen wurden jeden Tag zwischen 14 und 16 Uhr durchgeführt. Die Mäuse wurden ein bis zwei Stunden vor der Messung in einen ruhigen Messraum gebracht. Mäuse wurden sanft behandelt, um sie so ruhig wie möglich zu halten. Platzieren Sie das Tier mit der Manschette um seinen Schwanz in einer Halterung und legen Sie den Schwanz am Boden der V-förmigen Rille im Sensor an. Um es den Tieren zu ermöglichen, sich ausreichend aufzuwärmen, um eine gute Durchblutung des Schwanzes zu erzeugen und sich an den Aufenthalt in den Probenhaltern zu gewöhnen, wurden vor Beginn der eigentlichen Messungen in jeder Sitzung mindestens 5 Vormessungen durchgeführt. In jeder Sitzung wurden zehn bis zwanzig tatsächliche Messungen durchgeführt.

Für chemogenetische Aktivierungsexperimente wurden der Basalblutdruck und die Herzfrequenz nach 3-tägiger Gewöhnung gemessen. Zur gleichen Zeit am nächsten Tag wurden nach Injektionen von CNO (2 mg/kg Körpergewicht in Kochsalzlösung, IP) erneut Blutdruck und Herzfrequenz gemessen.

Zur Messung der Rektaltemperatur wurde ein Thermometer (TH-5 Thermalert, Physitemp) verwendet. Tragen Sie zunächst Vaseline auf das Ende der Sonde des Thermometers auf. Während der rektalen Temperaturerfassung wurde die Schwanzbasis der Maus mit zwei Fingern fixiert und dann vorsichtig angehoben, während das Tier mit seinen Vorderpfoten einen Metallstab am Käfigdeckel festhielt und so die Freilegung des Anogenitalbereichs ermöglichte. Die Exkremente und der Urin wurden gereinigt, um störende Auswirkungen durch Urinieren oder Stuhlgang zu minimieren. Dann wurde die Sonde mit Vaseline darauf 1,5 Zentimeter in den Analkanal eingeführt und die Temperatur abgelesen, als sie sich stabilisierte. Die Rektaltemperatur wurde mindestens an drei aufeinanderfolgenden Tagen gemessen, bevor die formellen Daten erhoben wurden. Für chemogenetische Experimente wurde die Rektaltemperatur 30 Minuten nach der Injektion von CNO (Enzo, Katalog-Nr. BML-NS105-0025, 2 mg/kg Körpergewicht in Kochsalzlösung, IP) gemessen.

Faserphotometrische Experimente wurden mindestens 3 Wochen nach der Injektion von AAV-GCaMP6s durchgeführt. Die implantierte Faser wurde über ein Glasfaser-Patchkabel (200 μm, 0,37 NA, Inper, Hangzhou, China) mit dem Fiber Optic Meter (ThinkerTech, Nanjing, China) verbunden. Um Fluoreszenzsignale aufzuzeichnen, wurde ein Strahl einer 480-LED mit einem dichroitischen Spiegel reflektiert und mit einer Linse fokussiert, die an einen CMOS-Detektor (Thorlabs, Inc. DCC3240M) gekoppelt war. Die LED-Leistung an der Spitze des Patchkabels betrug weniger als 50 μW.

Die neuronale Kalziumaktivität von LSNts wurde von Mäusen aufgezeichnet, die während der Cue-konditionierten oder selbstgesteuerten Fütterung mit GCaMP6s infiziert waren. Die Lecksignale wurden mit einem selbstgebauten Leckmesser erfasst und vom Glasfasermessgerät erfasst. Die Analyse des Signals wurde mit maßgeschneiderten MATLAB-Codes durchgeführt. Die Fluoreszenzänderung (ΔF/F) wurde als (F-F0)/F0 berechnet, wobei F0 das Basisfluoreszenzsignal ist (–6 bis –4 s vor dem ersten Lick- oder Cue-Beginn). Die Fläche unter der Kurve (AUC) wurde als mittlerer ΔF/F des Ereignisses berechnet, der für die Nahrungsannäherungsphase –6 bis 0 s und für die Nahrungsaufnahmephase 0 bis 8 s betrug.

Um Ca2+ von LSNts→TU oder LSNts→SUM aufzuzeichnen, wurden AAV-Retro-DIO-GCaMP6s in TU oder SUM injiziert und optische Fasern wurden in LS in Nts-ires-Cre-Mäusen implantiert. Um die Auswirkungen der Basisliniendrift zu eliminieren, wurde die Rohfluoreszenzspur wie von Xiao et al. beschrieben korrigiert. (Xiao et al., 2020). Nach der Korrektur der Basisliniendrift wurden die Fluoreszenzsignale relativ zum Mittelwert und zur Standardabweichung der Signale in einem Zeitfenster von –6 bis –4 s vor Beginn des ersten Leckens z-bewertet.

Mäuse mit Grundplatte und angeschlossenem Miniaturmikroskop (UCLA Miniscope V4, Open Ephys) wurden vor den Bildgebungssitzungen mindestens drei Tage lang an die Bildgebungsverhaltenskammer (35 cm × 30 cm) gewöhnt. Bilddaten wurden mit einer Bildrate von 30 Hz und einer LED-Leistung von 15–35 % erfasst. Die Calciumbilddaten wurden mit der UCLA Miniscope-DAQ-DT-Software erfasst. Die Synchronisation zwischen dem Miniaturmikroskop und verhaltensbezogenen Ereignissen (Lick- und Pump-Ereignisse) wurde durch ein maßgeschneidertes Arduino-Board erreicht.

Die Analyse der Zeitreihen der Kalziumbildgebung wurde in Python und MATLAB durchgeführt. Die Bilddaten wurden räumlich verkleinert (zweifach in xy) und zeitlich verkleinert (vierfach). Die eingeschränkte nicht-negative Matrixfaktorisierung (CNMF-E) für die Mikroendoskopie wurde verwendet, um mit einzelnen Neuronen assoziierte GCaMP-Fluoreszenzreaktionen aus den verarbeiteten Daten zu extrahieren (Zhou et al., 2018). Kurz gesagt, wir haben die Reaktion einzelner Neuronen mithilfe von CNMF-E geschätzt und die offensichtlichen nicht-neuralen Objekte, die normalerweise unrealistisch kleine (1–5 Pixel) oder große (über 100 Pixel) Somagrößen hatten, manuell entfernt.

Bei der konventionellen Kalziumbildgebung werden Fluoreszenzsignale als ΔF/F verglichen. Für die anschließende Analyse verwendeten wir die untersuchte Rohausgabe von CNME-F als ΔF. Um durchschnittliche Fluoreszenzreaktionen über Neuronen innerhalb einer Sitzung zu berichten, wurde das normalisierte ΔF als (ΔF – ΔFbaseline)/(ΔFmax – ΔFmin) berechnet. ΔFbaseline war der Mittelwert der Reaktionen eines Versuchs von –6 bis –4 s.

Die Halbwertsbreite der Ca2+-Reaktion und die Kampfdauer wurden zunächst anhand einer linearen Kurvenanpassung in MATLAB geschätzt. Der Korrelationskoeffizient zwischen der Antworthalbwertsbreite und der Kampfdauer wurde mit der MATLAB-Funktion „corrcoef“ berechnet.

Um die Reaktionen auf verschiedene Nahrungsmittel innerhalb einer Sitzung zu vergleichen, wurde ΔF für jedes Neuron über mehrere Versuche gemittelt. Anschließend wurde der Z-Score aus dieser durchschnittlichen Antwort berechnet.

Um die Ca2+-Reaktionen während des Verzehrs entweder als „erregt“ oder „gehemmt“ zu klassifizieren, wurde zunächst der Basiswert aus dem durchschnittlichen Fluoreszenzsignal des ROI von –6 bis –4 Sekunden jedes Versuchs berechnet. Die Spitzenreaktion wurde aus dem durchschnittlichen Fluoreszenzsignal ±1 s um den Spitzenwert jedes Versuchs herum berechnet. Für alle Studien wurde ein statistischer Vergleich (Wilcoxon-Signed-Rank-Test) zwischen den Ausgangswerten und den Spitzenreaktionen durchgeführt. Die Zelle wurde als erregende Reaktion klassifiziert, wenn p < 0,05 und eine positive Spitzenreaktion aufwies. Die Zelle wurde als inhibitorische Reaktion eingestuft, wenn p < 0,05 und eine negative Spitzenreaktion aufwies. Die Zelle wurde als keine Reaktion eingestuft, wenn p > 0,05.

Die Verfahren zur Vorbereitung akuter Hirnschnitte und zur Durchführung von Ganzzellaufzeichnungen mit optogenetischer Stimulation ähnelten den zuvor beschriebenen (Zhu et al., 2016). Koronale 250–300 μm-Schnitte, die LS oder TU enthielten, wurden mit einem Vibratom (VT-1000S, Leica) in einer eiskalten Lösung auf Cholinbasis hergestellt, die (in mM) 110 Cholinchlorid, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 7 MgCl2 enthielt. 1,3 NaH2PO4, 1,3 Na-Ascorbat, 0,6 Na-Pyruvat, 25 Glucose und 25 NaHCO3, gesättigt mit 95 % O2 und 5 % CO2. Die Schnitte wurden in sauerstoffhaltiger künstlicher Liquor cerebrospinalis (in mM: 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1,3 MgCl2, 1,3 NaH2PO4, 1,3 Na-Ascorbat, 0,6 Na-Pyruvat, 25 Glucose und 25 NaHCO3) bei 32 °C für mindestens 1 inkubiert h vor der Aufnahme. Die Schnitte wurden in eine Aufzeichnungskammer überführt und mit 2 ml min-1 künstlicher Liquor cerebrospinalis superfundiert. Patchpipetten (2–5 MΩ) aus Borosilikatglas (PG10150-4, World Precision Instruments) wurden mit einer Cs-basierten internen Lösung mit niedrigem Cl–-Gehalt gefüllt, die (in mM) 135 CsMeSO3, 10 HEPES, 1 EGTA, 3,3 QX- enthielt. 314, 4 Mg-ATP, 0,3 Na-GTP, 8 Na2-Phosphokreatin, 290 mOsm kg−1, eingestellt auf pH 7,3 mit CsOH. Die Ganzzell-Voltage-Clamp-Aufzeichnung wurde bei Raumtemperatur mit einem Multiclamp 700B-Verstärker und einem Digidata 1440 A (Molecular Devices) durchgeführt. Die Daten wurden mit 10 kHz abgetastet und mit Clampfit (Molecular Devices) oder MATLAB (MathWorks) analysiert. Zur Photostimulation wurde eine blaue Leuchtdiode (470 nm, Thorlabs) verwendet, die durch digitale Befehle vom Digidata 1440 A gesteuert wurde. Um durch Licht hervorgerufene IPSCs aufzuzeichnen, wurde ein blauer Lichtimpuls (473 nm, 1 ms, 0,5–2 mW) durch eine Glasfaser geleitet, um das gesamte Sichtfeld zu beleuchten. Die IPSCs wurden bei einem Haltepotential von 0 mV in Gegenwart von CNQX (10 μM) aufgezeichnet. Um IPSCs zu blockieren, wurde Picrotoxin über das Perfusionssystem in die Aufzeichnungskammer gegeben und mindestens 5 Minuten lang inkubiert.

Für das c-fos-Immunfärbungsexperiment wurden die Mäuse 90 Minuten nach Beginn der Fütterung getötet. Für das In-situ-Hybridisierungsexperiment mit c-fos RNAScope wurden die Mäuse 30 Minuten nach Beginn der Fütterung getötet. Zur Überprüfung des chemogenetischen Aktivierungsexperiments wurde CNO (2 mg/kg Körpergewicht in Kochsalzlösung, IP) 0,5 Stunden vor der Tötung des Tieres verabreicht. Mäuse wurden mit einer Überdosis Pentobarbital-Natrium eingeschläfert und transkardial mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) perfundiert, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Die Gehirne wurden 16–24 Stunden lang in 4 % PFA in PBS nachfixiert und 24–48 Stunden lang in 30 % Saccharose dehydriert, bis sie auf den Boden sanken. Das Gewebe wurde vor dem Schneiden in Tissue-Tek OCT-Compound (Sakura) auf Trockeneis eingebettet. Gehirne wurden mit einem Kryostaten (Leica) in 40-μm-Schnitte geschnitten. Frei schwebende Kryoschnitte wurden in PBS gesammelt. Gehirnschnitte wurden zunächst in PBS gewaschen (3 × 10 Minuten), dann bei Raumtemperatur mit 10 % normalem Ziegenserum (GS)/0,3 % Triton X-100 (PBST) blockiert und dann mit Primärantikörper (Rabbit Anti-c-) inkubiert. fos, Zellsignalisierung) über Nacht bei 4 °C. Gehirnschnitte wurden in PBST gewaschen (3 × 10 Minuten), gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation mit Fluorophor-konjugiertem Sekundärantikörper (1:1000 in 5% GS PBST, Invitrogen) und schließlich mit DAPI (1:3.000) gegengefärbt.

Für die In-situ-RNA-Hybridisierung wurde das Gehirn von Mäusen mit einem Kryostat (Leica) in 18-μm-Schnitte geschnitten und auf SuperFrost Plus-Objektträger montiert. Die Sonden zielen auf c-fos (Advanced Cell Diagnostics, # 316921-C3), Nts (Advanced Cell Diagnostics, # 420441), Penk (Advanced Cell Diagnostics, # 318761), Crhr2 (Advanced Cell Diagnostics, # 413201), vGAT (Advanced Cell Diagnostics, Nr. 319191-C3) und vGluT2 (Advanced Cell Diagnostics, Nr. 319171-C3) wurden von Advanced Cell Diagnostics entwickelt und validiert. Der RNAscope v2 Assay (Advanced Cell Diagnostics, Nr. 323100) wurde für alle FISH-Experimente gemäß dem Protokoll des Herstellers verwendet (Ref.: Wang et al., 2002). Kurz gesagt, Gehirnschnitte wurden 2 Stunden lang bei 39 °C getrocknet, in 1x PBS gespült, 15 Minuten lang mit 3 % Wasserstoffperoxid in Methon und TR-Puffer behandelt und 15 Minuten lang bei 40 °C mit RNAScope-Protease III behandelt. Die Gehirnschnitte wurden mit mRNA-Sonden 2 Stunden lang bei 40 °C inkubiert. Die spezifischen Signale wurden dann mit Multiplex-Implikationspuffer verstärkt und mit dem TSA Plus Flucerence Kit (Advanced Cell Diagnostics, Nr. 322809) nachgewiesen.

Die Bilder wurden mit einem Olympus Virtual Slide Microscope (VS120-S6-W) aufgenommen und von einer Person analysiert, die keine Ahnung von der Identität der Versuchsgruppen hatte. Die Zellzählung wurde mit der maßgeschneiderten MATLAB-Software durchgeführt, wie unten beschrieben.

Um die Anzahl der c-fos+-, Nts+-, Penk+-, Crhr2+- und CTB+-Zellen zu zählen, haben wir für jede Maus 40 μm koronale Schnitte der Zielhirnregionen gesammelt. Die Bilder wurden mit einem Objektträgerscanner (Olympus Virtual Slide Microscope, VS120-S6-W) aufgenommen und anschließend wurde die Zellzählung mit der speziell entwickelten MATLAB-Software durchgeführt.

Statistische Analysen wurden mit GraphPad Prism (GraphPad Software V8) oder Matlab (2017a, Mathworks) durchgeführt. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine Statistiken verwendet.

Wir verwendeten ein Fütterungsprotokoll für schmackhafte Nahrungsmittel mit eingeschränktem Zugang, das zu einem starken Verzehr von schmackhaften Nahrungsmitteln ohne Fasten führte. Dieses Fütterungsprotokoll bestand aus dem täglichen intermittierenden Zugang zu Futter mit hohem Saccharosegehalt für 2 Stunden, während immer Standard-Laborfutter zur Verfügung gestellt wurde [15, 17]. Mäuse entwickelten in diesem 2-Stunden-Zeitraum eine stabile Nahrungsaufnahme, während Kontrollmäuse mit ad libitum-Zugang zu Standardfutter in diesem Zeitraum wenig aßen (Abb. 1A und Abb. S1A, B). Die Nahrungsaufnahme beschränkte sich hauptsächlich auf schmackhafte Nahrung (Abb. S1C), was darauf hindeutet, dass die Nahrungsaufnahme hauptsächlich von der Schmackhaftigkeit der Nahrung abhängt – ein Kennzeichen der hedonischen Ernährung.

A Der LS wurde während der Aufnahme von Nahrungsmitteln mit hohem Saccharosegehalt ohne Energiedefizit aktiviert. Linkes Feld: Futteraufnahme gemessen in 2 Stunden für Kontrollmäuse (Zugang zu Standardfutter nach Belieben, n = 10) und Mäuse mit hedonischer Fütterung (intermittierender Zugang zu Futter mit hohem Saccharosegehalt zusammen mit Zugang zu Standardfutter nach Belieben, n = 10). Mann-Whitney-U-Test. ****P < 0,0001. Mittleres Feld: Anzahl der c-fos+-Neuronen im LS von Kontrollmäusen (n = 10) und hedonisch fressenden Mäusen (n = 10). Mann-Whitney-U-Test. ****P < 0,0001. Rechtes Feld: Repräsentative Bilder der c-fos-Immunfärbung im LS von Kontrollmäusen und hedonisch gefütterten Mäusen. Maßstabsbalken: 100 μm. B Der LS zeigte eine bevorzugte Aktivierung, wenn Mäuse nach dem Fasten Nahrung mit hohem Saccharosegehalt (HSF) im Vergleich zu normalem Futter zu sich nahmen. Linkes Feld: Nahrungsaufnahme, gemessen in 2 Stunden für Standardfutter (n = 8) oder Nahrung mit hohem Saccharosegehalt (n = 8) nach einer Fastennacht über Nacht. Mann-Whitney-U-Test. ****P < 0,0001. Mittleres Feld: Anzahl der c-fos+-Neuronen im LS der nüchternen, nüchternen + Chow- und nüchternen + HSF-Gruppen. Einfaktorielle ANOVA (F(2, 21) = 6,558, P < 0,01), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. ns, kein signifikanter Unterschied, *P < 0,05 und **P < 0,01. Rechtes Feld: Repräsentative Bilder der c-fos-Immunfärbung im LS der nüchternen, nüchternen + Chow- und nüchternen + HSF-Gruppen. Maßstabsbalken: 100 μm. C Repräsentative Bilder von Doppel-in-situ-Hybridisierungsexperimenten für c-fos (grün) und Nts (rot). Maßstabsbalken: 100 μm. D Repräsentative Bilder von Doppel-in-situ-Hybridisierungsexperimenten für c-fos (grün) und Penk (rot). Maßstabsbalken: 100 μm. E Repräsentative Bilder von Doppel-in-situ-Hybridisierungsexperimenten für c-fos (grün) und Crhr2 (rot). Maßstabsbalken: 100 μm. F Prozentsätze der Penk+-, Crhr2+- und Nts+-Zellen in der c-fos+-Population: Penk+/c-fos+ = 19,7 ± 2,5 %, Crhr2+/c-fos+ = 13,5 ± 1,3 % und Nts+/c-fos+ = 57,6 ± 2,5 %. Einfaktorielle ANOVA (F(2,14) = 43,71, P < 0,01), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. ***P < 0,001 und ****P < 0,0001. Mittelwerte ± SEM G Repräsentative Bilder von Doppel-in-situ-Hybridisierungsexperimenten für Nts (rot) und vGAT (grün). Maßstabsbalken: 100 μm. H Prozentsatz der Nts+-Zellen in der vGAT+-Population und Prozentsatz der vGAT+-Zellen in der Nts+-Population: (Nts+ & vGAT+)/vGAT+ = 21,3 ± 3,8 %, (Nts+ & vGAT+)/Nts+ = 100 % und (Nts+ & vGluT2+)/ Nts+ = 1,38 ± 0,5 %.

Wir führten eine Immunfärbung für c-fos durch, einen Marker für die aktuelle neuronale Aktivität, um durch hedonische Nahrungsaufnahme aktivierte Neuronen im gesamten Gehirn zu untersuchen. Mehrere Hirnregionen wurden durch hedonische Ernährung aktiviert, darunter der paraventrikuläre Kern des Thalamus (PVT), LS, cingulärer Kortex (Cg), SUM, Insula, Hippocampus (Hipp), periaquäduktales Grau (PAG), ventraler tegmentaler Bereich (VTA), ventraler lateraler Kniehöcker (VLGMC), TU und Zona incerta (ZI) (Abb. S1D und Abb. 1A). Hypothalamische Kerne, einschließlich des paraventrikulären Kerns des Hypothalamus (PVN) und des lateralen Hypothalamusbereichs (LHA), zeigten eine erhöhte c-fos-Expression, was mit ihrer Rolle bei der Regulierung der Nahrungsaufnahme übereinstimmt (Abb. S1D). Unter ihnen zeigten PVT und LS die höchste c-fos-Expression (Abb. S1D).

Neuronen, die an der hedonischen Nahrungsaufnahme beteiligt sind, sollten aktiver sein, wenn Tiere schmackhafte Nahrung zu sich nehmen. Anschließend verglichen wir die c-fos-Expressionsniveaus im PVT und LS von Mäusen, die nach einer Fastennacht über Nacht schmackhafte Nahrung zu sich nahmen, mit denen von normalem Futter. Der PVT zeigte ähnliche Werte der c-fos-Expression, wenn Mäuse Nahrung mit hohem Saccharosegehalt und normales Futter zu sich nahmen, wohingegen der LS eine bevorzugte Aktivierung zeigte, nachdem Mäuse schmackhafte Nahrung zu sich genommen hatten (Abb. 1B und Abb. S1E, F). Somit könnte der LS eine einzigartige Rolle bei der Regulierung der hedonischen Ernährung spielen.

Das LS enthält verschiedene neuronale Populationen, die durch unterschiedliche molekulare Marker definiert sind. Um die molekulare Identität von LS-Neuronen zu bestimmen, die durch hedonische Fütterung aktiviert wurden, führten wir eine RNAScope-Doppelfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (dFISH) für die mRNAs durch, die für c-fos und die neuronalen LS-Marker Neurotensin (Nts), Proenkephalin (Penk) und Corticotropin kodieren. Freisetzungsfaktor (Crhr2). RNAScope ergab, dass 57,6 % ± 2,5 % der durch hedonische Fütterung aktivierten LS-Neuronen Nts-positiv waren, wohingegen nur 19,7 % ± 2,5 % Penk-positiv und 13,5 % ± 1,3 % Crhr2-positiv waren (Abb. 1C–F). Die durch hedonische Fütterung aktivierten c-fos+-Zellen wurden vom rostralen zum kaudalen LS verteilt, was dem Expressionsmuster von Nts ähnelt (Abb. S1G, H). Wir führten auch dFISH mit Sonden für Neurotensin und dem vesikulären GABA-Transporter (vGAT), einem Marker für GABAerge Neuronen, oder dem vesikulären Glutamattransporter 2 (vGluT2), einem Marker für glutamaterge Neuronen im Septumbereich, durch. Ungefähr alle Nts-positiven Neuronen waren auch vGAT-positiv, während Nts-positive Neuronen ~21 % der GABAergen Neuronen im LS ausmachten (Abb. 1G, H).

Wir verwendeten eine Cre-abhängige Adeno-assoziierte Virus (AAV)-vermittelte Expressionsstrategie, um die Aktivität von LSNts-Neuronen gezielt zu manipulieren und die Funktion von LSNts-Neuronen bei der hedonischen Ernährung zu untersuchen. Durch die Injektion von AAVs, die doppelt gefloxtes EGFP (AAV-DIO-EGFP) tragen, in den LS von Nts-ires-Cre-Mäusen [18] konnten wir bestätigen, dass die Expression auf Nts-positive Neuronen im LS beschränkt war (Abb. S2A, B ). Anschließend verwendeten wir Tetanus-Neurotoxin (TeNT), eine Protease, die die Freisetzung von Neurotransmittern durch Spaltung von Synaptobrevin-2 blockiert, das häufig als molekulares Werkzeug zur synaptischen Stummschaltung eingesetzt wird [19]. Um die Effizienz der TeNT-induzierten synaptischen Stummschaltung zu überprüfen, injizierten wir Cre-abhängige AAVs, die Channelrhodopsin-2 (ChR2) exprimieren, zusammen mit verstärktem grün fluoreszierenden Protein (EGFP) als Kontrolle oder Tetanus-Neurotoxin (TeNT) zur synaptischen Stummschaltung in den LS von Nts-ires-Cre-Mäuse (Abb. 2B). In LS-Schnitten, die aus EGFP-exprimierenden Kontrollmäusen hergestellt wurden, rief die Lichtstimulation von ChR2-exprimierenden LSNts-Neuronen robuste Picrotoxin-empfindliche inhibitorische postsynaptische Ströme (IPSCs) in allen benachbarten ChR2-negativen LS-Neuronen hervor (7/7) (Abb. 2C, D) . Die Expression von TeNT blockierte die synaptische Übertragung von LSNts-Neuronen fast vollständig (Abb. 2C, D). Bemerkenswerterweise förderte die Stummschaltung der synaptischen Ausgänge von LSNts-Neuronen den Verzehr von schmackhafter Nahrung mit hohem Saccharose- und Fettgehalt, jedoch nicht von Standardfutter unter Ad-libitum-Bedingungen (Abb. 2E, oberes Feld). Dieser orexigene Effekt wurde sowohl in der 2- als auch in der 24-stündigen Fütterungsperiode beobachtet (Abb. 2E und Abb. S3A – C). Bei nüchternen Mäusen jedoch, als homöostatische Bedürfnisse zum Hauptfaktor der Nahrungsaufnahme wurden, hatte die TeNT-Expression unabhängig von der Nahrungsart keinen Einfluss auf die Nahrungsaufnahme (Abb. 2E, unteres Feld). Wir untersuchten auch die Auswirkung der TeNT-Expression auf die Aufnahme flüssiger Nahrung während der freien Abgabe eines kleinen, festen Volumens (10 μl) einer schmackhaften Saccharoselösung oder stellten sicher, dass ein motorisierter Leckauslauf verwendet wurde, der mit einem Leckmesser ausgestattet war (Abb. S1I– K). Die TeNT-Expression förderte auch erheblich die Aufnahme von schmackhafter flüssiger Nahrung, sowohl Saccharoselösung als auch Consider, jedoch nicht von Wasser (Abb. 2F). Wir verwendeten auch einen optogenetischen Ansatz, der eine überlegene zeitliche Präzision aufwies, um LSNts-Neuronen zum Schweigen zu bringen. In Übereinstimmung mit der TeNT-vermittelten synaptischen Stummschaltung erhöhte die optogenetische Stummschaltung von LSNts-Neuronen die Aufnahme von schmackhaftem „Ensure“ erheblich, was unmittelbar nach dem Einschalten des Lichts erfolgte (Abb. S3G–K). Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass LSNts-Neuronen eine wichtige Rolle bei der Regulierung der hedonischen Nahrungsaufnahme spielen.

Ein linkes Feld: Schematische Darstellung der Injektion von AAV-DIO-TeNT in den LS zur synaptischen Stummschaltung von LSNts-Neuronen. Rechtes Feld: repräsentatives Bild der Injektionsstelle und der Virusexpression im LS von Nts-ires-Cre-Mäusen. Maßstabsbalken: 500 μm. B Repräsentatives Bild, das die Expression von ChR2 (rot) und TeNT (grün) in LSNts-Neuronen zeigt. Maßstabsleiste: 500 μm (oberes Feld), 20 μm (unteres Feld). C Schematische Darstellung des Experiments zur Aufzeichnung postsynaptischer Ströme in LS-Schnitten, die durch optogenetische Stimulation von LSNts-Neuronen induziert werden. In dem Schnitt, in dem ChR2 mit EYFP koexprimiert wurde, rief die Stimulation mit blauem Licht robuste IPSCs hervor (graue Spur), die durch Picrotoxin (rote Spur) blockiert wurden. In dem Schnitt, in dem ChR2 mit TeNT koexprimiert wurde, konnte die Stimulation mit blauem Licht keine IPSCs hervorrufen (grüne Spur). D Statistik für die Amplituden lichtinduzierter IPSCs in TeNT-exprimierenden (n = 6 Zellen) und EYFP-exprimierenden (n = 7 Zellen) Mäusen. Zweifaktorielle ANOVA (F(1,11) = 53,46, P < 0,0001), gefolgt von Sidaks Post-hoc-Test. ***P < 0,0001. Mittelwerte ± SEM E Quantifizierung der 2-stündigen festen Nahrungsaufnahme bei EYFP- (grauer Balken, n = 6) und TeNT-exprimierenden Mäusen (grüner Balken, n = 8). Oberes Feld: Die TeNT-Expression erhöhte die Aufnahme von Lebensmitteln mit hohem Saccharose- und Fettgehalt, jedoch nicht von Standardfutter unter Ad-libitum-Bedingungen. Unteres Feld: Die TeNT-Expression hatte keinen Einfluss auf die Nahrungsaufnahme unter nüchternen Bedingungen. Mann-Whitney-U-Test. ***P < 0,001. Mittelwerte ± SEM F Quantifizierung der 2-stündigen flüssigen Nahrungsaufnahme durch EYFP- (grauer Balken, n = 6) und TeNT-exprimierende Mäuse (grüner Balken, n = 8). Die TeNT-Expression erhöhte die Aufnahme von schmackhafter flüssiger Nahrung, jedoch nicht von Wasser. Repräsentatives Leckverhalten (linkes Feld), kumulatives Lecken (mittleres Feld) und Gesamtaufnahme (rechtes Feld) von Wasser (oberes Feld), Saccharoselösung (mittleres Feld) und „Security“ (unteres Feld) in EYFP- (grau, n = 6) und TeNT-exprimierende Mäuse (grün, n = 8). Mann-Whitney-U-Test. **P < 0,01 und ****P < 0,0001. Mittelwerte ± Standardabweichung G Quantifizierung der Veränderungen im Körpergewicht von EYFP- (grauer Balken, n = 7) und TeNT-exprimierenden (grüner Balken, n = 7) Mäusen. Linkes Feld: Repräsentative Bilder, die die EYFP- und TeNT-exprimierenden Mäuse nach 6-wöchiger Fütterung mit einer fettreichen Diät zeigen. Rechtes Feld: Die TeNT-Expression förderte ein erhöhtes Körpergewicht von Mäusen, die mit einer fettreichen Diät, aber nicht mit Standardfutter gefüttert wurden. Mann-Whitney-U-Test. ns, kein signifikanter Unterschied, *P < 0,01 und ***P < 0,001. Mittelwerte ± Sem

Die starke Wirkung der LSNts-Stummschaltung auf die Aufnahme schmackhafter Nahrung lässt darauf schließen, dass das Energiegleichgewicht gestört sein könnte; Anschließend untersuchten wir die Bewegungsaktivität und den Energieverbrauch. Optogenetisch vermittelte neuronale Hemmung oder TeNT-vermittelte synaptische Stummschaltung von LSNts hatten im Freilandtest keinen Einfluss auf die allgemeine Bewegungsaktivität von Mäusen (Abb. S2G und 3D). Die TeNT-Expression veränderte den Energieverbrauch von Mäusen in Stoffwechselkäfigen nicht (Abb. S3E, F). In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen erhöhte die TeNT-Expression das Körpergewicht von Mäusen, die drei Wochen lang eine fettreiche Diät erhielten, signifikant (Abb. 2G). Dieser Anstieg des Körpergewichts wurde jedoch bei Mäusen, die mit normalem Futter gefüttert wurden, nicht beobachtet (Abb. 2G). Diese Ergebnisse bestätigen die entscheidende Rolle von LSNts-Neuronen bei der Regulierung der hedonischen Ernährung und des Körpergewichts.

Als nächstes untersuchten wir die Auswirkungen der Aktivierung von LSNts-Neuronen auf die Nahrungsaufnahme. Wir injizierten Cre-abhängige AAVs, die die exzitatorischen Designerrezeptoren exprimieren, die ausschließlich durch Designerdrogen (DREADDs) hM3D (20) oder mCherry aktiviert wurden, in den LS von Nts-ires-Cre-Mäusen (Abb. 3A). Drei Wochen später führte eine intraperitoneale (IP) Injektion von Clozapin-N-oxid (CNO, 2 mg/kg), jedoch nicht von Kochsalzlösung, zu einer robusten c-fos-Expression in hM3D-exprimierenden LS-Neuronen (Abb. 3B). Unter Ad-libitum-Bedingungen verringerte die chemogenetische Aktivierung von LSNts-Neuronen die Nahrungsaufnahme unabhängig von der Art der Nahrung erheblich (Abb. 3C, oberes Feld). Im nüchternen Zustand verringerte die Aktivierung der LSNts-Neuronen jedoch nur die Aufnahme von schmackhafter Nahrung mit hohem Fett- und Saccharosegehalt, nicht aber von Standardfutter (Abb. 3C, unteres Feld). Die Aktivierung von LSNts-Neuronen unterdrückte auch die Aufnahme schmackhafter flüssiger Nahrung, sowohl der Saccharoselösung als auch von Consider (Abb. 3D–E). Die chemogenetische Aktivierung von LSNts hatte keinen Einfluss auf die allgemeine Bewegungsaktivität der Mäuse (Abb. S2D). Die Manipulation der Aktivität von LSNts-Neuronen hatte im Freilandtest keine Auswirkung auf angstbezogenes Verhalten (Abb. S2E und 2H) und hatte keinen Einfluss auf Blutdruck, Körpertemperatur, Blutzuckerspiegel oder Herzfrequenz (Abb. S4), was darauf hindeutet eine spezifische Rolle für LSNts-Neuronen bei der Regulierung der Nahrungsaufnahme.

A Linkes Feld: Schematische Darstellung der Injektion von AAV-DIO-hM3D in den LS zur chemogenetischen Aktivierung von LSNts-Neuronen. Rechtes Feld: Repräsentatives Bild der Injektionsstelle und der Virusexpression im LS von Nts-ires-Cre-Mäusen. Maßstabsbalken: 500 μm. B Linkes Feld: Repräsentatives Bild, das zeigt, dass die CNO-Injektion (2 mg/kg) eine robuste c-fos-Expression von LSNts-Neuronen in hM3D-exprimierenden Mäusen induzierte. Maßstabsbalken: 100 μm. Rechtes Feld: Prozentsatz der c-fos+-Zellen unter LSNts-Neuronen aus den Gruppen „hM3D + Kochsalzlösung“ (n = 4), „EYFP + CNO“ (n = 4) und „hM3D + CNO“ (n = 4). Einfaktorielle ANOVA (F(2,9) = 684,5, P < 0,001), gefolgt von Dunnetts Post-hoc-Test. ****P < 0,0001. C Quantifizierung der 2-stündigen Aufnahme fester Nahrung nach Injektion von Kochsalzlösung (grauer Balken) und CNO (roter Balken) bei mCherry- und hM3D-exprimierenden Mäusen. Oberes Feld: CNO-Injektion reduzierte die Nahrungsaufnahme unter Ad-libitum-Bedingungen bei hM3D-exprimierenden (n = 6), aber nicht bei mCherry-exprimierenden Mäusen (n = 5). Zweifaktorielle ANOVA (Standardfutter, F(1,18) = 8,202, P < 0,05; Lebensmittel mit hohem Saccharosegehalt, F(1,18) = 9,941, P < 0,01; Lebensmittel mit hohem Fettgehalt, F(1,18) = 19,27, P < 0,001), gefolgt von Sidaks Post-hoc-Test. **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001. Unteres Feld: Die CNO-Injektion reduzierte die Nahrungsaufnahme mit hohem Saccharose- und Fettgehalt unter nüchternen und nüchternen Bedingungen bei hM3D-exprimierenden (n = 6), aber nicht bei mCherry-exprimierenden Mäusen (n = 5). Zweifaktorielle ANOVA (Standardfutter, F(1,18) = 0,9784, P > 0,05; Lebensmittel mit hohem Saccharosegehalt, F(1,18) = 5,234, P < 0,05; Lebensmittel mit hohem Fettgehalt, F(1,18) = 6,420, P < 0,05), gefolgt von Sidaks Post-Hoc-Test, ***P < 0,001, bedeutet, dass die Injektion von ± sem D CNO die Gesamtaufnahme von Saccharoselösung (oberes Feld) und „Security“ (unteres Feld) durch hM3D-Expression reduzierte (n = 7), aber keine mCherry-exprimierenden Mäuse (n = 5). Saccharoselösung: Zweifaktorielle ANOVA (F(1,20) = 7,96, P < 0,05), gefolgt von Sidaks Post-hoc-Test. ***P < 0,001. Stellen Sie sicher: Zweifaktorielle ANOVA (F(1,20) = 15,70, P < 0,001), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. ****P < 0,0001. Mittelwerte ± Sem

Unsere Ergebnisse zeigten, dass die Stummschaltung von LSNts-Neuronen gezielt die hedonische Nahrungsaufnahme förderte, während die Aktivierung von LSNts-Neuronen die allgemeine Nahrungsaufnahme unterdrückte. Wir haben uns gefragt, ob unterschiedliche Signale von LSNts-Neuronen die hedonistische spezifische und allgemeine Ernährung unterschiedlich regulieren könnten. Auf der Ebene der basalen physiologischen Aktivität wurde GABA freigesetzt und wirkte auf postsynaptische Neuronen, da wir nach kurzer optogenetischer Stimulation (1 ms) von LSNts Picrotoxin-empfindliche IPSCs in lokalen postsynaptischen Neuronen aufzeichneten (Abb. 2C). Bei starker chemogenetischer Aktivierung wurde das Neurotensinpeptid nach einer CNO-Injektion in stromabwärts gelegenen Regionen nachgewiesen (Patterson CM et al., 2015). Wir stellten daher die Hypothese auf, dass die GABA-Freisetzung auf der Basisaktivitätsebene die hedonische Nahrungsaufnahme unterdrückt, während Neurotensin bei starker LSNts-Aktivierung weiter rekrutiert wurde, um die Gesamtfütterung zu unterdrücken.

Um diese Hypothese zu untersuchen, verwendeten wir die CRISPR/Cas9-vermittelte Genombearbeitung [21], um die GABA- oder Neurotensinfreisetzung in LSNts-Neuronen zu unterdrücken. Wir haben eine einzelne Leit-RNA (sgRNA) entwickelt, die auf den vesikulären GABA-Transporter (vGAT) abzielt, der für die Verpackung von GABA in synaptische Vesikel verantwortlich und für die GABAerge synaptische Übertragung unverzichtbar ist [22], um die GABA-Freisetzung zu reduzieren. Nachdem wir Nts-ires-Cre-Mäuse mit Cre-induzierbaren Cas9-Knock-in-Mäusen gekreuzt hatten (21), injizierten wir ein AAV, das sowohl vGAT-Targeting (sgRNA) als auch Cre-induzierbares hM3D-mCherry trug, in den LS, um hM3D im vGAT-Knockdown zu exprimieren Zellen (Abb. 4A). Um die Effizienz des vGAT-Knockdowns zu überprüfen, injizierten wir auch AAV-DIO-ChR2 in den LS von vGAT-Knockdown-Tieren und zeichneten IPSCs von postsynaptischen Neuronen auf. Eine kurze Blaulichtstimulation (1 ms) rief robuste IPSCs in allen aufgezeichneten Neuronen (8/8) von LacZ-sgRNA-Kontrolltieren hervor (Abb. 4B – D, graue Linie). Die gleiche Lichtstimulation konnte jedoch in allen aufgezeichneten Neuronen (0/8) von vGAT-Knockdown-Tieren keine IPSCs hervorrufen (Abb. 4C, D, rote Linie). Diese Ergebnisse zeigten die hohe Effizienz unserer CRISPR/Cas9-Strategie zur Unterbrechung der GABA-Signalisierung.

Ein Schema, das den experimentellen Aufbau für den CRISPR/Cas9-vermittelten Abbau von vGAT und Nts zeigt. Das AAV, das für vGAT-Targeting, Nts-Targeting oder Kontroll-LacZ-Targeting-sgRNA und Cre-induzierbares hM3D kodiert, wurde in Nts-ires-Cre-Mäuse injiziert, die mit Cre-induzierbarem Cas9-Knock in Mäusen gekreuzt wurden. B Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus zur Verifizierung des vGAT-Knockdowns. In LacZ-Kontrollmäusen oder vGAT-Knockdown-Mäusen wurde ChR2 in LSNts-Neuronen exprimiert, und an benachbarten Nts-negativen Neuronen wurden Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen durchgeführt. C Repräsentative Spuren lichtinduzierter IPSCs für LacZ-Kontrollmäuse (grau) und vGAT-Knockdown-Mäuse (rot) bei unterschiedlichen Lichtleistungen (von links nach rechts: 0,5 mW, 1,0 mW, 1,5 mW, 2,0 mW). D Statistik für die Amplituden der durch Licht hervorgerufenen IPSCs in den LacZ-Kontrollmäusen (grau, n = 8 Zellen) und vGAT-Knockdown-Mäusen (rot, n = 8 Zellen). Zweifaktorielle ANOVA (F(1,14) = 50,87, P < 0,0001), gefolgt von Sidaks Post-hoc-Test. **P < 0,01 und ***P < 0,0001, Mittel ± SEM , n = 9) und Nts-Knockdown-Mäuse (blau, n = 13). Einfaktorielle ANOVA (Standardfutter, F(2,230) = 1,716, P > 0,05; schmackhaftes Essen, F(2,30) = 6,563, P < 0,01), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. ns, kein signifikanter Unterschied und *P < 0,05. Mittelwerte ± Standardabweichung F Auswirkungen der chemogenetischen Aktivierung von LSNts-Neuronen auf die Nahrungsaufnahme (linkes Feld: Standardfutter, rechtes Feld: schmackhafte Nahrung) durch LacZ-Kontrolle (n = 11), vGAT-Knockdown (n = 9) und Nts-Knockdown (n = 13). ) Mäuse. Zweifaktorielle ANOVA (Standardfutter, F(2,60) = 4,661, P < 0,05; schmackhaftes Essen, F(2,60) = 5,583, P < 0,01), gefolgt von Sidaks Post-hoc-Test. ns, kein signifikanter Unterschied, *P < 0,05, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001, Mittel ± Standardabweichung G Repräsentative Bilder, die zeigen, dass die CNO-Injektion (2 mg/kg) eine robuste c-fos-Expression induzierte in LSNts-Neuronen in LacZ-Kontroll-, vGAT-Knockdown- und Nts-Knockdown-Mäusen. Maßstabsbalken: 100 μm. H Statistische Analyse des Verhältnisses von c-fos+-Zellen nach Injektion von Kochsalzlösung und CNO in LacZ-Kontrollmäusen (n = 3), vGAT-Knockdown-Mäusen (n = 3) und Nts-Knockdown-Mäusen (n = 3). Einfaktorielle ANOVA (F(5,12) = 854,6, P < 0,0001), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. ****P < 0,0001. Mittelwerte ± Sem

Der vGAT-Knockdown in LSNts-Neuronen hatte keinen Einfluss auf die Aufnahme von Standardfutter, erhöhte jedoch die Aufnahme von schmackhafter Nahrung mit hohem Saccharosegehalt signifikant (Abb. 4E), was darauf hindeutet, dass GABA die hedonische Nahrungsaufnahme unter Basalbedingungen spezifisch unterdrückt. Mit einem ähnlichen Ansatz haben wir eine Nts-zielende sgRNA entwickelt, um das Neurotensinpeptid abzubauen. Der Abbau von Neurotensin hatte keinen Einfluss auf die Nahrungsaufnahme, unabhängig von der Art der Nahrung (Abb. 4E). Diese Ergebnisse legen nahe, dass unter physiologischen Grundbedingungen die GABA-Signalübertragung, nicht jedoch die Neurotensin-Signalübertragung, die unterdrückende Wirkung von LSNts-Neuronen auf die hedonische Ernährung vermittelt.

Als nächstes untersuchten wir die Wirkung von vGAT oder Neurotensin-Knockdown auf die chemogenetische Aktivierung von LSNts-Neuronen. Die chemogenetische Aktivierung von LSNts durch eine CNO-Injektion induzierte eine robuste c-fos-Expression in allen drei Mäusegruppen (Abb. 4G, H). Bei LacZ-Kontrollmäusen unterdrückte die chemogenetische Aktivierung von LSNts-Neuronen die Nahrungsaufnahme unabhängig von der Art der Nahrung (Abb. 4F), was mit unserem vorherigen Ergebnis übereinstimmt. Bei vGAT-Knockdown-Mäusen unterdrückte die Verabreichung von CNO auch die Nahrungsaufnahme erheblich (Abb. 4F), was darauf hindeutet, dass eine GABAerge Übertragung nicht erforderlich ist, wenn LSNts-Neuronen stark aktiviert waren. Bei Nts-Knockdown-Mäusen unterdrückte die CNO-Injektion immer noch die Aufnahme schmackhafter Nahrung, konnte jedoch die Futteraufnahme nicht unterdrücken, was ein weiterer Hinweis auf eine spezifische Rolle der GABA-Signalübertragung bei der Unterdrückung der hedonischen Nahrungsaufnahme ist. (Abb. 4F).

Zusammengenommen deuten diese CRISPR/Cas9-Knockdown-Experimente darauf hin, dass sowohl die GABA- als auch die Neurotensin-Signalübertragung von LSNts-Neuronen die Nahrungsaufnahme regulieren, jedoch auf unterschiedlichen Aktivitätsniveaus wirken. Aus LSNts-Neuronen freigesetztes GABA sorgt für eine tonische Hemmung, um die hedonische Nahrungsaufnahme auf der Grundebene zu unterdrücken, während Neurotensin bei starker Aktivierung weiter rekrutiert wird, um die allgemeine Nahrungsaufnahme zu unterdrücken.

Wir verwendeten Faserphotometrie [23], um die Dynamik der neuronalen Aktivität von LSNts beim Nahrungsaufnahmeverhalten und die Beteiligung dieser Neuronen an der hedonischen Nahrungsaufnahme zu beurteilen. Wir transduzierten LSNts-Neuronen mit einem Cre-abhängigen AAV, das einen genetisch kodierten Ca2+-Indikator (GCaMP6s) exprimierte [24] und implantierten optische Fasern in den LS von Nts-ires-Cre-Mäusen. Mittels Faserphotometrie haben wir Populations-Ca2+-Signale von LSNts-Neuronen während der Nahrungssuche und des Nahrungskonsums aufgezeichnet. Wir untersuchten zunächst die Aktivität von LSNts-Neuronen während der reizbedingten Abgabe eines kleinen, festen Volumens schmackhafter Sicherstellung (Abb. S5A). LSNts-Neuronen zeigten während der Fütterung eine robuste Ca2+-Dynamik (Abb. S5B). Allerdings wurde die Aktivität nicht durch ernährungsvorhersagende akustische Signale oder Nahrungsabgabe moduliert, wenn das Ca2+-Signal auf den Beginn des Signals ausgerichtet war (Abb. S5C). Im Gegensatz dazu beobachteten wir einen Anstieg der LSNts-Aktivität vor dem ersten Lecken, wenn das Tier sich dem Futterschnabel näherte, wenn das Ca2+-Signal auf das erste Lecken nach dem Signal ausgerichtet war. Auf diese erhöhte Aktivität folgte ein stärkerer Rückgang der Aktivität, als die Tiere begannen, das Futter zu verzehren (Abb. S5D).

Wir haben auch Ca2+-Signale während eines frei zugänglichen, selbstgesteuerten Fütterungsprotokolls aufgezeichnet [25], bei dem akustische Hinweise fehlten und Futterschnäbel immer verfügbar waren. In Übereinstimmung mit der reizbedingten Fütterung beobachteten wir eine biphasische neuronale Ca2+-Dynamik von LSNts, die während der Nahrungsannäherungsphase eine erregende Reaktion und während der Nahrungsaufnahmephase eine hemmende Reaktion zeigte (Abb. 5A, linkes Feld). Die erregende Reaktion während der Annäherungsphase wurde nur beobachtet, wenn das Tier mit schmackhaftem, aber nicht mit normalem oder verdünntem Futter gefüttert wurde (Abb. S6A–C), was darauf hindeutet, dass diese Aktivität nicht durch Laufen oder andere motorische Artefakte verursacht wurde. Die während der Verzehrphase beobachtete Hemmreaktion war jedoch bei verschiedenen Lebensmitteltypen ähnlich (Abb. S6A–C und 6E, F). Sowohl erregende als auch hemmende Reaktionen ließen nach, wenn die Nahrung durch Wasser ersetzt wurde (Abb. S6D).

A Linkes Feld: Populations-Ca2+-Aktivität von LSNts-Neuronen während der freien Fütterung von Indeed. Mittleres Feld: Populations-Ca2+-Aktivität von LSNts-Neuronen, wenn auf Nahrung verzichtet wurde. Rechtes Feld: Populations-Ca2+-Aktivität von LSNts-Neuronen, wenn das Tier am Kopf fixiert und gefüttert wurde. Gestrichelte vertikale Linie: erster Leck. B Fläche unter der Kurve der Ca2+-Aktivität während der Nahrungsannäherungsphase (n = 8). Einfaktorielle ANOVA (F(2, 21) = 5,49, P < 0,01), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. *P < 0,05. Mittelwerte ± SEM C Fläche unter der Kurve der Ca2+-Aktivität während der Nahrungsaufnahmephase (n = 8). Einfaktorielle ANOVA (F(2, 21) = 11,05, P < 0,01), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. **P < 0,01 und ***P < 0,001. Mittelwerte ± Standardabweichung D Oberes Feld: Schematische Darstellung der Injektion von AAV-DIO-ChR2 oder AAV-DIO-eNpHR in den LS zur optogenetischen Manipulation von LSNts-Neuronen. Mittleres Feld: Repräsentatives Bild, das die Expression von ChR2-mCherry in LSNts-Neuronen zeigt. Unteres Feld: Repräsentatives Bild, das den Ausdruck von eNpHR-EYFP zeigt. E Die Auswirkung der optogenetischen Aktivierung (blau, n = 4) oder Hemmung (gelb, n = 6) von LSNts-Neuronen während der Nahrungsannäherungsphase auf die Nahrungssuche und den Nahrungskonsum. Wilcoxon-Signed-Rang-Test. *P < 0,05. F Die Auswirkung der optogenetischen Aktivierung (blau, n = 4) oder Hemmung (gelb, n = 6) von LSNts-Neuronen während der Nahrungsaufnahmephase auf Nahrungssuche und Nahrungsaufnahme. Wilcoxon-Signed-Rang-Test. *P < 0,05 und **P < 0,01.

Basierend auf diesen Beobachtungen stellten wir die Hypothese auf, dass die erregenden Reaktionen von LSNts-Neuronen während der Annäherungsphase die Motivation zur Aufnahme schmackhafter Nahrung darstellen könnten und daher wichtig seien, um die Nahrungssuche und das Annäherungsverhalten voranzutreiben, während die hemmenden Reaktionen während der Verzehrphase entscheidend sein könnten allgemeines Konsumverhalten. Um diese Hypothese zu testen, verzichteten wir in einigen Versuchen auf die Nahrungszufuhr und stellten fest, dass die hemmenden Reaktionen nach dem ersten Lecken verschwanden, während die erregenden Reaktionen während der Annäherungsphase erhalten blieben (Abb. 5A, mittleres Feld). Wir untersuchten auch die Aktivität von LSNts in einem am Kopf fixierten, am Körper fixierten Fütterungsverfahren, bei dem die Möglichkeit zur Nahrungssuche entfernt wurde; Wir fanden heraus, dass die erregenden Reaktionen vor dem ersten Lecken verschwanden, die hemmenden Reaktionen während des Verzehrs jedoch erhalten blieben (Abb. 5A, rechtes Feld).

Die biphasischen Reaktionen sagen voraus, dass die Aktivierung der LSNts-Neuronen während der Annäherungsphase die Nahrungssuche erleichtern würde, während die Hemmung der LSNts-Neuronen während der Konsumphase für die Nahrungsaufnahme erforderlich ist. Unsere bisherige synaptische Inaktivierung und chemogenetische Aktivierung von TeNT unterschied nicht zwischen der annäherungs- und verbrauchsgesperrten neuronalen Dynamik, die wir in vivo gemessen haben. Unter Ausnutzung der Millisekunden-Zeitauflösung der optogenetischen Methode manipulierten wir gezielt die Aktivität von LSNts-Neuronen während der Annäherungsphase im Vergleich zur Konsumphase und untersuchten ihre Auswirkungen auf die Nahrungssuche und den Nahrungskonsum.

Anschließend exprimierten wir das exzitatorische Opsin ChR2 [26] in LSNts-Neuronen zur optogenetischen Aktivierung und untersuchten den Effekt einer zeitlich präzisen optogenetischen Aktivierung während verschiedener Fütterungsphasen (Abb. 5D). Lichtstimulation während der Nahrungsannäherungsphase verkürzte die Latenzzeit erheblich und erhöhte die Geschwindigkeit bis zur Nahrungszone (Abb. 5E), was darauf hindeutet, dass die Aktivierung von LSNts-Neuronen während der Nahrungsannäherungsphase das Nahrungssuchverhalten erleichterte. Diese optogenetische Manipulation hatte jedoch keinen Einfluss auf die Nahrungsaufnahme (Abb. 5E). Im Gegensatz dazu unterdrückte die optogenetische Aktivierung von LSNts-Neuronen während der Verzehrphase die Nahrungsaufnahme erheblich, veränderte jedoch nicht die Eintrittszeiten in die Nahrungszone, sondern verkürzte die in der Nahrungszone verbrachte Zeit (Abb. 5F). Als nächstes exprimierten wir das inhibitorische Opsin eNpHR [27] in LSNts-Neuronen, um eine zeitlich präzise optogenetische Stummschaltung zu erreichen (Abb. 5D). Konsequenterweise hatte die optogenetische Hemmung von LSNts-Neuronen während der Annäherungsphase keinen Einfluss auf das Konsumverhalten, während die optogenetische Hemmung während der Konsumphase die gesamte Nahrungsaufnahme stark förderte (Abb. 5E, F).

Da die Faserphotometrie die summierte Ca2+-Aktivität mehrerer LSNts-Neuronen aufzeichnet, könnten zwei mögliche Szenarien die biphasischen Reaktionen der LSNts-Neuronen während der Nahrungsaufnahme erklären. Zunächst wurden bestimmte Subpopulationen von LSNts-Neuronen aktiviert oder gehemmt. Zweitens wurde eine einzelne Population von LSNts-Neuronen zunächst während der Nahrungsaufnahme aktiviert und dann während der Nahrungsaufnahme gehemmt. Um diese beiden Möglichkeiten zu unterscheiden, führten wir eine In-vivo-Ca2+-Bildgebung einzelner LSNts-Neuronen in sich frei bewegenden Mäusen unter Verwendung eines am Kopf montierten Miniaturmikroskops und einer implantierten Gradientenindexlinse (GRIN) durch [28] (Abb. 6A, B).

Ein Schema, das die Ca2+-Bildgebung einzelner LSNts-Neuronen mit einem am Kopf montierten Miniaturmikroskop zeigt. B Ca2+-Dynamik von 10 repräsentativen LSNts-Zellen während der Fütterung. Maßstabsleiste: 1 Z-Score. C Ca2+-Antworten von 290 LSNts-Zellen, ausgerichtet auf den ersten Leckpunkt während der freien Fütterung von Consider. Ungefähr 31 % der Zellen wurden aktiviert und 32 % der Zellen wurden gehemmt. D Die Zeit bis zum Höhepunkt der aktivierten Zellen (n = 88) war kürzer als die Zeit bis zum Tiefpunkt der gehemmten Zellen (n = 86). Mann-Whitney-U-Test. ***P < 0,001. E Die Reaktionshalbwertsbreite der aktivierten Zellen (n = 88) war kürzer als die der gehemmten Zellen (n = 86). Mann-Whitney-U-Test. ***P < 0,001. F. Ca2+-Reaktionen von 130 LSNts-Zellen, die unter der Bedingung eines Nahrungsmangels auf den ersten Leckpunkt ausgerichtet waren. Ungefähr 40 % der Zellen wurden aktiviert und 11 % der Zellen wurden gehemmt. G. Prozentsätze der aktivierten, gehemmten und nicht reagierenden Zellen unter den Bedingungen der freien Fütterung (linkes Feld) und des Verzichts auf Nahrung (rechtes Feld). H Fläche unter der Kurve der Ca2+-Aktivität für aktivierte (linkes Feld) und inhibierte (rechtes Feld) Zellen während der freien Fütterung von Secure- und Nahrungsauslassungsversuchen. Mann-Whitney-U-Test. Ns, kein signifikanter Unterschied. I. Korrelation zwischen der Halbwertsbreite der Reaktion und der Kampfdauer für gehemmte (linkes Feld) und aktivierte Neuronen (mittleres Feld). Rechtes Feld: Der Korrelationskoeffizient zwischen der Reaktion und dem Verhalten gehemmter Zellen war größer als der aktivierter Zellen. Mann-Whitney-U-Test. ***P < 0,001. J Ca2+-Reaktion aktivierter (rechtes Feld) und inhibierter (linkes Feld) Zellen bei Ausrichtung auf den letzten Leckpunkt während der freien Fütterung von Consider. K. Ca2+-Reaktion von LSNts-Neuronen auf die Saccharoselösung und „Security“ (n = 143 Neuronen aus 4 Mäusen), gruppiert nach k-Means-Clustering. Vertikale gestrichelte Linie: erster Leck. L Ca2+-Reaktion von LSNts-Neuronen auf „Security“ und regelmäßige Nahrung (n = 124 Neuronen von 4 Mäusen), gruppiert nach k-Means-Clustering. Vertikale gestrichelte Linie: erster Leck. M Ca2+-Reaktion von LSNts-Neuronen auf „Ensure“ und „Wasser“ (n = 161 Neuronen aus 4 Mäusen), gruppiert nach k-Means-Clustering. Vertikale gestrichelte Linie: erster Leck. N Prozentsätze der aktivierten, gehemmten und nicht reagierenden Zellen, die während der kostenlosen Fütterung von Consider, Saccharoselösung, normaler Nahrung und Wasser identifiziert wurden.

Wir exprimierten GCaMP6s in LSNts-Neuronen und bildeten die Ca2+-Aktivität einzelner Zellen durch ein am Kopf montiertes Miniaturmikroskop während der frei zugänglichen, selbstgesteuerten Fütterung von schmackhaftem Consider ab. LSNts-Neuronen reagierten am stärksten, wenn sich Tiere näherten und mit der Nahrungsaufnahme begannen (beim ersten Lecken); 31 % der Neuronen wurden signifikant aktiviert und 32 % wurden signifikant gehemmt (Abb. 6C, G). Die aktivierten Neuronen reagierten tendenziell schneller; Sie erreichten ihren Höhepunkt 0,3 ± 0,1 Sekunden vor dem ersten Lecken, während die gehemmten Zellen ihren Tiefpunkt 3,6 ± 0,3 Sekunden nach dem ersten Lecken erreichten (Abb. 6D). Die aktivierten Zellen zeigten auch ein engeres Reaktionsfenster mit einer deutlich kleineren Halbwertsbreite (3,7 ± 0,3 s) als die gehemmten Zellen (6,8 ± 0,4 s) (Abb. 6E und Abb. S6G). Diese Unterschiede in der zeitlichen Kinetik der beiden neuronalen Populationen könnten zu der zweiphasigen Reaktion beitragen, die wir bei unserer Faserphotometrie-Aufzeichnung beobachtet haben. Um diese Möglichkeit zu testen, normalisierten wir die Reaktion jeder Zelle und addierten sie; Wir fanden heraus, dass die summierte Bevölkerungsreaktion eine zweiphasige Reaktion aufwies (Abb. S7H), die an die photometrische Reaktion erinnert.

Wir untersuchten die genaue Rolle der aktivierten und gehemmten LSNts-Neuronenpopulationen bei der Nahrungsaufnahme, indem wir während Versuchen zum Weglassen von Nahrung bildgebende Verfahren durchführten. Bei Weglassen der Nahrungsaufnahme sank der Anteil der gehemmten LSNts-Neuronen auf 11 % (Abb. 6F, G), während der Anteil der aktivierten Neuronen hoch blieb (40 %), was darauf hindeutet, dass die gehemmten Neuronen hauptsächlich an der Konsumphase der Nahrungsaufnahme beteiligt waren Verhaltensweisen. Die mittlere Antwortamplitude sowohl der aktivierten als auch der gehemmten Neuronen unter Bedingungen ohne Nahrung war ähnlich der unter Bedingungen mit freier Nahrungsaufnahme (Abb. 6H). Als nächstes untersuchten wir, ob die Reaktion gehemmter Neuronen konsumierendes Verhalten verfolgen kann. Wir analysierten in jedem Versuch den Zusammenhang zwischen der Ca2+-Reaktion und dem konsumtiven Leckverhalten und beobachteten eine signifikante Korrelation zwischen der Dauer des Anfalls und der Reaktionsdauer der gehemmten Neuronenpopulation (Abb. 6I). Der zwischen der Kampfdauer und der Halbwertsbreite der Reaktion berechnete Korrelationskoeffizient war für die gehemmte Population signifikant höher (0,69 ± 0,05) als für die aktivierte Population (0,28 ± 0,05) (Abb. 6I), was auf eine Rolle der gehemmten LSNts-Population bei der Konsumierung schließen lässt Verhalten. Um weiter zu untersuchen, ob die gehemmten Neuronen die Nahrungsaufnahme beenden können, richteten wir die Reaktionen auf das letzte Lecken aus und stellten fest, dass die Reaktion unmittelbar nach dem letzten Lecken auf den Ausgangswert zurückkehrte (Abb. 6J). Somit tragen gehemmte LSNts-Neuronen hauptsächlich zur Nahrungsaufnahme bei.

Als nächstes überwachten wir die Aktivität von LSNts-Neuronen während der Fütterung von Nahrungsmitteln mit unterschiedlichem Geschmack. Zu den getesteten Lebensmitteln gehörten schmackhafte Sure- oder Saccharoselösungen, neutrale normale Lebensmittel oder Wasser. Wir lieferten nacheinander zwei verschiedene Lebensmittel in derselben Sitzung und verwendeten unbeaufsichtigtes K-Means-Clustering von Reaktionen auf zwei verschiedene Lebensmittel, um die Reaktionen derselben Zellen auf verschiedene Lebensmittel genau zu identifizieren [25]. Wir verglichen die Reaktionen bei freier Fütterung von Indeed und Saccharoselösung und beobachteten ähnliche Reaktionen. Sowohl Indeed als auch Saccharose aktivierten und inhibierten einen ähnlichen Anteil an LSNts-Neuronen (Abb. 6K). Bei den LSNts-Neuronen, die durch Consider und Saccharose aktiviert und gehemmt wurden, handelte es sich weitgehend um dieselbe Subpopulation. Allerdings war der Anteil aktivierter Zellen bei der Fütterung von normalem Futter (11 %) oder Wasser (9 %) deutlich geringer (Abb. 6L–N). Diese Ergebnisse zeigten, dass die aktivierten LSNts-Neuronen enger mit der Schmackhaftigkeit der Nahrung korrelieren.

Um die Schaltkreismechanismen der Nahrungsregulierung durch LSNts-Neuronen weiter zu untersuchen, haben wir die Projektionen von LSNts-Neuronen systematisch kartiert, indem wir SynaptoTag AAV verwendet haben, das das rot fluoreszierende Protein tdTomato und das verstärkte grün fluoreszierende Protein (EGFP), fusioniert mit dem synaptischen Vesikelprotein Synaptophysin, koexprimiert [19]. . Wir injizierten AAV-FLEX-tdTomato-T2A-synaptophysin-EGFP in den LS von Nts-ires-cre-Mäusen (Abb. 7A). Mit SynaptoTag AAV infizierte Neuronen wurden in ihrem Zytoplasma und ihren Axonfasern mit tdTomato gefüllt und lokalisierten grün fluoreszierendes Synaptophysin an efferenten Synapsen. Mit dieser Verfolgungsstrategie stellten wir fest, dass LSNts-Neuronen wichtige synaptische Verbindungen mit mehreren Gehirnregionen herstellten, darunter dem lateralen und medialen präoptischen Bereich (POA), dem Tuberalkern (TU), dem vorderen Hypothalamuskern (AHN) und dem supramammillären Kern (SUM). Abb. 7B, C). Wir exprimierten ChR2 in LSNts-Neuronen und führten eine Ganzzellaufzeichnung von TU-Neuronen in Scheiben durch, um funktionelle synaptische Verbindungen zu überprüfen. Eine kurze Blaulichtstimulation der axonalen Terminals von LSNts in der TU rief robuste Picrotoxin-empfindliche IPSCs von ~ 50 % der aufgezeichneten TU-Neuronen hervor (Abb. S7C–E), was funktionelle GABAerge synaptische Verbindungen zwischen LSNts und TU-Neuronen bestätigte.

Ein Schema, das die SynaptoTag-AAV-Strategie zur Kartierung der Projektionen von LSNts-Neuronen zeigt. B Repräsentatives Bild der Injektionsstelle und der Virusexpression im LS von Nts-ires-Cre-Mäusen. C Repräsentative Bilder, die tdTomato-exprimierende Axone und GFP-exprimierende Axonterminals in verschiedenen Regionen zeigen. Maßstabsbalken: 200 μm. D Schematische Darstellung der viralen Strategie zur Aktivierung von LSNts-Neuronen, die durch einen chemogenetischen Ansatz auf ein bestimmtes nachgeschaltetes Ziel projizieren. Quantifizierung der Aufnahme von Standardfutter (E), Lebensmitteln mit hohem Saccharosegehalt (F) und Lebensmitteln mit hohem Fettgehalt (G) nach chemogenetischer Aktivierung jeder LSNts-Projektion. Kontrollgruppe, n = 7; LSNts→POA-Gruppe, n = 6; LSNts→AHN-Gruppe, n = 6; LSNts→TU-Gruppe, n = 7; LSNts→SUM-Gruppe, n = 8. Zweifaktorielle ANOVA (Standardfutter, F(4,68) = 2,854, P < 0,05; Lebensmittel mit hohem Saccharosegehalt, F(4,58) = 9,145, P < 0,0001; Hoch- fetthaltige Nahrung, F(4,58) = 4,541, P < 0,0001), gefolgt von Sidaks Post-hoc-Test. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001. Mittelwerte ± SEM H Oberes Feld: Schematische Darstellung der viralen Strategie zur Hemmung der LSNts-Neuronen, die zur TU projizieren, durch einen optogenetischen Ansatz. Unteres Feld: Repräsentative Bilder, die die Expression von eNpHR-EYFP in LSNts-Neuronen zeigen, die zur TU projizieren. Maßstabsbalken: 200 μm. I Die optogenetische Hemmung von TU-projizierenden LSNts-Neuronen hatte keinen Einfluss auf die regelmäßige Nahrungsaufnahme. EYFP-Kontrollgruppe, n = 5; eNpHR-Gruppe, n = 6. Zweifaktorielle ANOVA (F(1,18) = 0,2096, P > 0,05). Mittelwerte ± SEM J. Optogenetische Hemmung von TU-projizierenden LSNts-Neuronen erhöhte die Aufnahme von Consider deutlich. EYFP-Kontrollgruppe, n = 5; eNpHR-Gruppe, n = 6. Zweifaktorielle ANOVA (F(1,18) = 5,341, P < 0,05), gefolgt von Sidaks Post-hoc-Test. **P < 0,01. Mittelwert ± Standardabweichung K Repräsentative Bilder, die die In-situ-Hybridisierungsergebnisse für das mRNA-Signal des Neurotensinrezeptors 1 (NtsR1) im SUM zeigen. L Schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus für die lokale Infusion des Nts-Peptids in das SUM. M Quantifizierung der 2-stündigen Aufnahme von Standardfutter nach Verabreichung von Kochsalzlösung (grauer Balken, n = 8) oder Nts (blauer Balken, n = 8) an die SUM. Wilcoxon-Signed-Rang-Test. ***P < 0,001. N Quantifizierung der 2-stündigen Aufnahme fettreicher Nahrung nach Verabreichung von Kochsalzlösung (grauer Balken, n = 8) oder Nts (blauer Balken, n = 8) an die SUM. Wilcoxon-Signed-Rang-Test. **P < 0,01. O Durchschnittliche Ca2+-Aktivität von LSNts→TU, aufgezeichnet durch Faserphotometrie während der freien Fütterung von normalem Futter (linkes Feld) oder „Security“ (rechtes Feld). Oberes Feld: Populationsdurchschnitt von 5 Mäusen. Unteres Feld: Ca2+-Aktivität bei einzelnen Mäusen. P Durchschnittliche Ca2+-Aktivität des LSNts→SUM-Schaltkreises, aufgezeichnet durch Faserphotometrie während der freien Fütterung von normalem Futter (linkes Feld) oder „Security“ (rechtes Feld). Oberes Feld: Populationsdurchschnitt von 3 Mäusen. Unteres Feld: Ca2+-Aktivität bei einzelnen Mäusen.

Um die anatomische Organisation von LSNts-Projektionen aufzudecken, injizierten wir die retrograden Tracer CTB555 und CTB647/488 in die TU und andere LSNts-Downstream-Ziele und untersuchten die Überlappung zwischen CTB-markierten LSNts-Neuronen, die auf verschiedene Ziele projizierten (Abb. S9). Nur 6,0 % der TU-projizierenden LSNts-Neuronen projizierten auf die POA, 8,3 % der TU-projizierenden LSNts-Neuronen projizierten auf die AHN und 11,3 % der TU-projizierenden LSNts-Neuronen projizierten auf die SUM (Abb. S9B–E), was auf eine geringe Überlappung schließen lässt zwischen TU-projizierenden und POA-projizierenden, AHN-projizierenden, SUM-projizierenden LSNts-Neuronen. Wie erwartet führte die gemeinsame Injektion von CTB555 und CTB647 in die TU zu einem hohen Prozentsatz an Colabeling (92,9 % für CTB555 und 66,0 % für CTB647) (Abb. S9F). Mit einer ähnlichen Methode beobachteten wir eine geringe Überlappung zwischen jedem zweiten Paar von LSNts-Downstream-Projektionen (Abb. S9B), was ein Eins-zu-eins-Projektionsmuster von LSNts-Neuronen unterstützt.

Wir untersuchten, welche LSNts-Projektion für die Regulierung der hedonischen Fütterung von entscheidender Bedeutung ist, indem wir retroAAV-FLEX-FlpO in eines der nachgeschalteten Projektionsziele und AAV-fDIO-hM3D in den LS von Nts-ires-Cre-Mäusen injizierten (Abb. 7D). Diese Strategie führte zur selektiven Expression von hM3D in LSNts-Neuronen, die auf ein bestimmtes nachgeschaltetes Ziel projizieren, und die Anzahl der hM3D-exprimierenden LSNts-Neuronen war zwischen verschiedenen Signalwegen vergleichbar (Abb. S7A, B). Die Aktivierung der Schaltkreise LSNts→POA, LSNts→AHN und LSNts→SUM durch CNO-Injektion unterdrückte die Nahrungsaufnahme unabhängig von der Nahrungsart erheblich (Abb. 7E – G). Die Aktivierung des LSNts→TU-Signalwegs unterdrückte jedoch gezielt den Verzehr von schmackhaften Lebensmitteln mit hohem Fett- und Saccharosegehalt, jedoch nicht von Standardfutter (Abb. 7E – G). Die Aktivierung des LSNts →TU-Signalwegs hatte im Freilandtest keinen Einfluss auf die allgemeine Bewegungsaktivität und das angstähnliche Verhalten (Abb. S7H–J). Aufgrund der spezifischen Rolle des LSNts→TU-Signalwegs bei der hedonischen Nahrungsaufnahme haben wir dann getestet, ob die Stummschaltung dieses Signalwegs die hedonische Nahrungsaufnahme steigert. Wir verwendeten eine wegspezifische optogenetische Strategie, um den LSNts→TU-Weg zu hemmen (Abb. 7H). Tatsächlich förderte die Hemmung des LSNts→TU-Signalwegs die Fütterung mit schmackhaftem, jedoch nicht mit Standardfutter (Abb. 7I, J). Kürzlich wurde berichtet, dass die Somatostatin (SST)-positiven Neuronen in der TU eine kontextbedingte übermäßige Nahrungsaufnahme, meist hedonische Nahrungsaufnahme, vermitteln [8]. Wir untersuchten auch die Verteilung der axonalen Terminals von LSNts in der TU und stellten eine umfangreiche Überlappung zwischen Synaptophysin-positiven synaptischen Boutons von LSNts und SST-positiven Neuronen in der TU fest (Abb. S7F, G).

Wir untersuchten, ob stromabwärts gelegene Projektionsbereiche von LSNts-Neuronen Neurotensinrezeptoren exprimieren und somit möglicherweise die anorektische Wirkung der Neurotensinsignalisierung vermitteln, indem wir eine In-situ-Hybridisierung durchführten, um die mRNA des Neurotensinrezeptors 1 (NtsR1) in den vier Hauptprojektionszielen nachzuweisen. Wir beobachteten ein robustes NtsR1-mRNA-Signal in der SUM, während in POA, AHN und TU wenig oder keine NtsR1-mRNA nachgewiesen wurde. (Abb. 7K und S8A). Die lokale Infusion von Neurotensinpeptid (1 μg) in das SUM unterdrückte die Nahrungsaufnahme, unabhängig von der Nahrungsart, was darauf hindeutet, dass das Neurotensinsignal im SUM ausreicht, um die Nahrungsaufnahme insgesamt zu unterdrücken (Abb. 7L – N). Im Gegensatz dazu hatte die Infusion von Neurotensin in die TU keinen Einfluss auf die Nahrungsaufnahme (Abb. S8A–C), was mit dem Fehlen einer Neurotensinrezeptorexpression übereinstimmt. Um zu untersuchen, wie Neurotensin die neuronale Aktivität beeinflusst, führten wir eine Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnung von TU- und SUM-Neuronen durch. Bei der Schnittvorbereitung erhöhte die Anwendung von Neurotensin (2 μM) das Auslösen des Aktionspotentials in 3/6 aufgezeichneten Neuronen in SUM (Abb. S8H). Allerdings zeigten keine Neuronen in TU (0/7) eine Reaktion auf die Anwendung von Neurotensin im Schnitt (Abb. S8G). Wir haben in vivo auch lokal Neurotensin (1 μg) in SUM infundiert und eine robuste c-fos-Expression beobachtet (Abb. S8D – F), was weiter bestätigt, dass das Neurotensinsignal SUM-Neuronen aktiviert.

Um die Möglichkeit zu untersuchen, dass erregende und hemmende Reaktionen von LSNts-Neuronen ausgehen, die auf verschiedene nachgeschaltete Ziele projizieren, haben wir die Ca2+-Dynamik von LSNts→TU- und LSNts→SUM-Pfaden aufgezeichnet, indem wir GCaMP in LSNts-Neuronen exprimierten, die TU oder SUM projizieren. Ähnlich wie die LSNts-Population zeigten LSNts→TU biphasische Reaktionen während der freien Fütterung (Abb. 7O). Allerdings zeigte LSNts→SUM eine reine Hemmungsreaktion und die Reaktionsamplitude war größer, wenn Mäuse „Security“ konsumierten, als wenn sie normale Nahrung zu sich nahmen (Abb. 7P).

Die Aktivierung von LSNts-Neuronen unterdrückte die Nahrungsaufnahme, während die Manipulation von LSNts-Neuronen keinen Einfluss auf den Energieverbrauch hatte. Wir fragten uns, ob eine Verbesserung der neuronalen Aktivität von LSNts durch fettreiche Ernährung verursachte Fettleibigkeit verhindern würde, und aktivierten LSNts-Neuronen chronisch mit einem chemogenetischen Ansatz (Abb. 8A). Bei Kontrollmäusen stieg das Körpergewicht nach Einführung der fettreichen Diät schnell an und erhöhte sich nach 6 Wochen um 37 % ± 4 % (Abb. 8B, rote Linie), während das Körpergewicht der Mäuse nur bei einer Standard-Futterdiät gehalten wurde um 14 % ± 1 % erhöht (Abb. 8B, graue Linie). Die chemogenetische Aktivierung von LSNts-Neuronen durch eine tägliche IP-Injektion von CNO kehrte die Zunahme des Körpergewichts um (10 % ± 1 %) (Abb. 8B, grüne Linie). Unter Verwendung einer intersektionalen viralen Strategie transduzierten wir hM3D selektiv in TU-projizierenden LSNts-Neuronen, indem wir retroAAV-FLEX-FlpO in die TU und AAV-fDIO-hM3D in die LS von Nts-ires-Cre-Mäusen injizierten. Die chemogene Aktivierung von LSNts→TU reduzierte auch die durch eine fettreiche Ernährung induzierte Zunahme des Körpergewichts signifikant (21 % ± 3 %) (Abb. 8B, orange Linie). Die chronische Aktivierung des LSNts→TU-Signalwegs hatte in einem Freilandtest keinen Einfluss auf die Bewegungsaktivität oder das angstbedingte Verhalten (Abb. 8D, E). Basierend auf diesen Ergebnissen reicht die Aktivierung von LSNts-Neuronen oder des LSNts→TU-Schaltkreises aus, um durch fettreiche Ernährung verursachte Fettleibigkeit zu reduzieren.

Ein Schema, das den experimentellen Aufbau für die chronische chemogenetische Aktivierung von LSNts-Neuronen in einem durch fettreiche Ernährung induzierten Fettleibigkeitsmodell zeigt. B Veränderungen im Körpergewicht von Kontrollmäusen, die mit Standardfutter gefüttert wurden (grau, n = 5), Kontrollmäusen, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden (rot, n = 5), LSNts::hM3D-Mäusen, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden (grün, n = 7) und LSNts→TU::hM3D-Mäuse erhielten über mehrere Wochen hinweg eine fettreiche Diät (orange, n = 9). Zweifaktorielle ANOVA (F(3,22) = 13,74, P < 0,0001). Mittelwerte ± SEM C Veränderungen im Körpergewicht von Kontrollmäusen, die mit Standardfutter gefüttert wurden (grau, n = 5), Kontrollmäusen, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden (rot, n = 5), und LSNts::hM3D-Mäusen, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden (grün, n = 7) und LSNts→TU::hM3D-Mäuse erhielten nach 6 Wochen eine fettreiche Diät (orange, n = 9). Zweifaktorielle ANOVA (F(3,22) = 11,4, P < 0,001), gefolgt von Tukeys Post-hoc-Test. *P < 0,05 und ***P < 0,001. Mittelwerte ± Standardabweichung D Die durchschnittliche Bewegungsaktivität von Kontrollmäusen, denen Standardfutter verabreicht wurde (grau, n = 5), Kontrollmäusen, denen eine fettreiche Diät verabreicht wurde (rot, n = 5), LSNts::hM3D-Mäusen, denen eine fettreiche Diät verabreicht wurde ( grün, n = 7) und LSNts→TU::hM3D-Mäuse, denen eine fettreiche Diät verabreicht wurde (orange, n = 9). Einfaktorielle ANOVA (F(3,22) = 0,15, P > 0,05). Mittelwerte ± Standardabweichung E Die Dauer in der Mitte des Freilandtests für Kontrollmäuse, die mit Standardfutter gefüttert wurden (grau, n = 5), Kontrollmäuse, die mit einer fettreichen Diät gefüttert wurden (rot, n = 5), und LSNts::hM3D-Mäuse, die gefüttert wurden eine fettreiche Diät (grün, n = 7) und LSNts→TU::hM3D-Mäuse erhielten eine fettreiche Diät (orange, n = 9). Einfaktorielle ANOVA (F(3,22) = 1,19, P > 0,05). Mittelwerte ± SEM F Arbeitsmodell des molekularen und Kreislaufmechanismus, durch den LSNts-Neuronen die hedonische Ernährung und das Körpergewicht regulieren.

In der vorliegenden Studie haben wir eine Gruppe Neurotensin-exprimierender GABAerger Neuronen im LS identifiziert, die eine entscheidende Rolle bei der Regulierung der hedonischen Ernährung spielen. Die Stummschaltung von LSNts-Neuronen förderte die hedonische Nahrungsaufnahme, die durch GABAerge Projektionen auf die TU vermittelt wurde. Die Aktivierung von LSNts-Neuronen unterdrückte die gesamte Nahrungsaufnahme, was durch Projektionen auf SUM, AHN und POA vermittelt wurde. Die Neurotensin-Signalisierung im SUM reicht aus, um die allgemeine Nahrungsaufnahme zu unterdrücken. Die Identifizierung der genauen Moleküle, Zelltypen und Schaltkreise, die an der Regulierung der hedonischen Ernährung beteiligt sind, könnte angesichts der unerwünschten Nebenwirkungen aktueller Medikamente, die auf homöostatische Schaltkreise abzielen, zur Entwicklung besserer Medikamente gegen Fettleibigkeit beitragen.

Der LS ist an verschiedenen physiologischen Prozessen beteiligt, darunter Stress und Angst [16, 29, 30, 31]. Das LS enthält viele molekular unterschiedliche Zelltypen [32]. Eine interessante Hypothese ist, dass verschiedene Zelltypen zu unterschiedlichen physiologischen Funktionen beitragen. Es wurde gezeigt, dass eine Untergruppe von LS-Neuronen, die Crhr2 exprimieren (LSCrhr2), anhaltendes stressinduziertes Angstverhalten vermittelt [16]. Unsere Ergebnisse zeigen, dass LSNts-Neuronen eine entscheidende Rolle bei der Modulation der hedonischen Nahrungsaufnahme, jedoch nicht bei der Angst, spielen, was die Hypothese weiter stützt, dass unterschiedliche neuronale Subtypen im LS unterschiedliche physiologische Prozesse vermitteln.

LSNts-Neuronen sind eine Untergruppe der GABAergen Neuronen im LS, die Neurotensin exprimieren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass LSNts-Neuronen GABA freisetzen, um auf nachgeschaltete Gehirnziele zu wirken, da eine kurze optogenetische Aktivierung von LSNts-Neuronen starke picrotoxinempfindliche inhibitorische postsynaptische Ströme hervorrief. Die chemogenetische Aktivierung von Neurotensin-exprimierenden Neuronen führt zur Freisetzung von Neurotensin in nachgelagerte Hirnareale [33]. Somit setzen LSNts-Neuronen sowohl den kanonischen Neurotransmitter GABA als auch das Peptid Neurotensin frei. Mithilfe des CRISPR/Cas9-vermittelten Gen-Knockdowns konnten wir unterschiedliche Rollen der GABA- und Neurotensin-Signalisierung bei der Modulation der hedonischen Ernährung aufdecken. Auf der basalen physiologischen Ebene unterdrückte die GABA-Signalübertragung spezifisch die hedonische Nahrungsaufnahme, da der vGAT-Knockdown die Aufnahme von schmackhafter Nahrung, aber nicht von normalem Futter förderte. Allerdings unterdrückte die chemogenetische Aktivierung von LSNts bei vGAT-Knockdown-Mäusen immer noch die Aufnahme von schmackhafter Nahrung und Futter, was darauf hindeutet, dass die Neurotensin-Signalübertragung an der Unterdrückung der Gesamtfütterung beteiligt ist. Mithilfe einer In-situ-Hybridisierungstechnik haben wir die Expression des Neurotensinrezeptors 1 im SUM nachgewiesen (Abb. 7K), einem der nachgeschalteten Projektionsziele von LSNts-Neuronen. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass eine lokale Infusion von Neurotensin in das SUM die Aufnahme von schmackhafter Nahrung und normalem Futter unterdrückt, was darauf hindeutet, dass das Neurotensinsignal im LSNts→SUM-Signalweg an der Unterdrückung der Gesamtfütterung beteiligt ist.

Eine aktuelle Studie berichtete, dass Neurotensin-Neuronen bei LS mit der Unterdrückung des Appetits verbunden sind [31]. LSNts-Neuronen wurden durch Stress aktiviert und die chemogenetische Aktivierung von LSNts führte zu einer allgemeinen Nahrungsunterdrückung. Daher legt diese Studie nahe, dass LSNts-Neuronen eine wichtige Rolle bei der stressinduzierten Nahrungsunterdrückung spielen [31]. Aus den unten beschriebenen Gründen ist es jedoch unwahrscheinlich, dass der in unserem Experiment beobachtete anorektische Effekt auf eine stressbedingte Nahrungsunterdrückung zurückzuführen ist. Erstens waren die Mäuse in unserem hedonischen Fütterungsmodell mindestens drei Tage lang an eine schmackhafte Ernährung gewöhnt; Daher war die Auswirkung von Stress wahrscheinlich minimal. Zweitens erhöhte die TeNT-vermittelte synaptische Stummschaltung von LSNts das Körpergewicht von Mäusen, die eine fettreiche Diät erhielten, hatte jedoch keinen Einfluss auf das Körpergewicht von Mäusen, die eine normale Futterdiät erhielten. Dieser Unterschied wurde nicht auf Stress zurückgeführt, da beide Tiere unter den gleichen Bedingungen aufgezogen wurden und ähnliche Stressniveaus hatten. Stattdessen deutet dieses Ergebnis darauf hin, dass LSNts-Neuronen die hedonische Nahrungsaufnahme unter physiologischen Bedingungen einschränken. Drittens beobachteten wir mithilfe von In-vivo-Miniaturmikroskop-Ca2+-Bildgebung, dass 31 % der LSNts-Neuronen aktiviert wurden, während 32 % der Neuronen während der freien Fütterung schmackhafter Nahrung gehemmt wurden. Darüber hinaus untersuchten wir auch die Reaktionen derselben Gruppe von LSNts-Neuronen auf Stress (Fußschock) und stellten fest, dass die Mehrheit der LSNts-Neuronen (74 %) durch Stress aktiviert wurde (Abb. S6I). Daher fördert eine starke Aktivierung von LSNts-Neuronen durch Stress höchstwahrscheinlich die Freisetzung von Neurotensin, um die gesamte Nahrungsaufnahme zu unterdrücken. Obwohl LSNts-Neuronen Stress mit Nahrungsunterdrückung in Verbindung bringen können, zeigten unsere Studien, dass LSNts-Neuronen eine wichtige Rolle bei der Modulation hedonischer Nahrungsaufnahme in einer stressfreien Umgebung spielen. Darüber hinaus zeigten unsere Miniatur-Mikroskop-Ca2+-Bildgebungsexperimente die Heterogenität von LSNts-Neuronen während der Nahrungsaufnahme, die in der bisherigen Literatur nicht charakterisiert wurde.

Unsere Experimente zur Schaltungsverfolgung ergaben, dass LSNts-Neuronen auf mehrere nachgeschaltete Ziele projizieren, darunter POA, AHN, TU und SUM. Während die Aktivierung der Projektionen auf POA, AHN und SUM die allgemeine Nahrungsaufnahme unterdrückte, hemmte die Aktivierung des LSNts→TU-Schaltkreises speziell den Verzehr schmackhafter Nahrung. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der LSNts→TU-Signalweg eine einzigartige Rolle bei der Regulierung der hedonischen Ernährung spielt. Interessanterweise wurde kürzlich berichtet, dass SST-positive Neuronen im Tuberkulosekern eine durch den Umweltkontext bedingte nichthomöostatische Nahrungsaufnahme, meist hedonische Nahrungsaufnahme, vermitteln [8]. Unsere SynaptoTag-vermittelte anterograde Verfolgung ergab robuste Kontakte zwischen synaptischen Boutons von LSNts-Neuronen und SST-positiven Neuronen in der TU. Eine plausible Hypothese ist daher, dass die Wirkung des LSNts →TU-Schaltkreises auf die Unterdrückung der hedonischen Nahrungsaufnahme zumindest teilweise durch SST-Neuronen in der TU vermittelt wird.

Unser Miniscope-Bildgebungsexperiment ergab zwei Populationen von LSNts-Neuronen, die während der Fütterung aktiviert und gehemmt wurden. Dieser Befund erklärt die zweiphasige Reaktion, die in unserem Faserphotometrie-Experiment beobachtet wurde. Die gehemmte LSNts-Subpopulation zeigte eine langsamere Reaktionslatenz und ein breiteres Reaktionsfenster als die aktivierte LSNts-Subpopulation. Die Unterschiede in der zeitlichen Kinetik dieser beiden LSNts-Populationen führten zu zweiphasigen Reaktionen auf Populationsebene. Unsere Analyse der neuronalen Dynamik und Störungsexperimente weisen auf einen dominanten Effekt der gehemmten LSNts-Subpopulation auf die Nahrungsaufnahme hin. Unsere Ergebnisse zeigen auch die Heterogenität von LSNts-Neuronen und unterstreichen die Bedeutung der Überwachung der individuellen neuronalen Aktivität während physiologischer Prozesse. Ein wichtiges Ziel für die Zukunft besteht darin, festzustellen, ob diese aktivierten und gehemmten LSNts-Subpopulationen unterschiedliche molekulare Profile aufweisen und ob sie sich in ihren synaptischen Eingaben und Projektionsmustern unterscheiden.

Zusammenfassend identifizieren unsere Ergebnisse einen neuartigen LS-Schaltkreis, der eine wichtige Rolle bei der Regulierung hedonischer Ernährung und Fettleibigkeit spielt. Projektionen von den LSNts-Neuronen zur TU unterdrücken die hedonische Nahrungsaufnahme über die GABA-Signalisierung, während Projektionen von den LSNts-Neuronen zu POA, AHN und SUM die allgemeine Nahrungsaufnahme unterdrücken. Das Neurotensinsignal im LSNts→SUM-Weg reicht aus, um die Gesamtfütterung zu unterdrücken (Abb. 8F). Diese Erkenntnisse erweitern unser Verständnis der neuronalen Schaltkreise, die der hedonischen Nahrungsaufnahme zugrunde liegen, über das klassische mesolimbische dopaminerge Belohnungssystem hinaus und werden bei der Entwicklung von Interventionen für übermäßige Nahrungsaufnahme aufgrund der Schmackhaftigkeit der Nahrung und der daraus resultierenden Fettleibigkeit hilfreich sein.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Erwin Neher, Dr. Yu-Tian Wang, Dr. Xiaoke Chen und Dr. Lei Yuan für ihre aufschlussreichen Kommentare zum Manuskript. Wir danken Dr. Minmin Luo, Dr. Yang Dan und Dr. Chenyan Ma für ihre Hilfe bei CRISPR/Cas9-Experimenten; Dr. Jian Zhang für seine Hilfe bei der Blutdruckmessung; Dr. Cheng Wang und Dr. Zhen Zhang für ihre Hilfe beim Miniscope-Bildgebungsexperiment; Dr. Qingfeng Wu und Si Li für ihre Hilfe beim In-situ-Hybridisierungsexperiment; und Dr. Fan Yang und Dashuang Gao für ihre Hilfe bei den Stoffwechselmessungen. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des Science and Technology Innovation 2030 – Major Project (2021ZD0202103), der National Natural Science Foundation of China (81922024, 82171492 & 31900735), der Science, Technology and Innovation Commission of Shenzhen Municipality (RCJC20200714114556103, JCYJ201805071824201) unterstützt 14 & ZDSYS20190902093601675) , Frontier Research Program des Bioland Laboratory (Guangzhou Regenerative Medicine and Health Guangdong Laboratory) (2018GZR110105006) und Guangdong Provincial Key Laboratory of Brain Connectome and Behavior (2017B030301017). ZL wurde durch Zuschüsse des National Key R&D Program of China (2016YFD0400800) und der National Natural Science Foundation of China (11079019 & 31070616) unterstützt.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Zijun Chen, Gaowei Chen.

Shenzhen Key Laboratory of Drug Addiction, Shenzhen Neher Neural Plasticity Laboratory, Brain Cognition and Brain Disease Institute, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinesische Akademie der Wissenschaften; Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science – Shenzhen Fundamental Research Institutions, Shenzhen, 518055, China

Zijun Chen, Gaowei Chen, Jiafeng Zhong, Shishi Lai, Hua Xu, Xiaofei Deng, Fengling Li, Shanshan Lu, Kuikui Zhou und Yingjie Zhu

Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, 100049, Peking, China

Gaowei Chen, Jiafeng Zhong, Shanshan Lu, Xu Zhang und Yingjie Zhu

Technische Universität Henan, Henan, 450001, China

Shaolei Jiang & Zhongdong Liu

Universität Shanghai für Wissenschaft und Technologie, Shanghai, 200093, China

Shaolei Jiang

Fakultät für Lebens- und Gesundheitswissenschaften, Shenzhen Institute of Advanced Technology, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shenzhen, 518055, China

Kuikui Zhou & Yingjie Zhu

Guangdong Institute of Intelligence Science and Technology, Bezirk Hengqin, Zhuhai, Guangdong, 519031, China

Changlin Li und Xu Zhang

Forschungseinheit für Schmerzmedizin, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften; SIMR Joint Lab of Drug Innovation, Shanghai Advanced Research Institute, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, 201210, China

Xu Zhang

CAS Center for Excellence in Brain Science and Intelligence Technology, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shanghai, 200031, China

Yingjie Zhu

CAS Key Laboratory of Brain Connectome and Manipulation, Brain Cognition and Brain Disease Institute (BCBDI), Shenzhen Institute of Advanced Technology (SIAT), Chinesische Akademie der Wissenschaften, Shenzhen, 518055, China

Yingjie Zhu

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YZ konzipierte die Studie. ZC, GC und YZ entwarfen die Experimente und analysierten die Daten. ZC führte mit Hilfe von JZ, SL und SJ Spurenverfolgung, Verhaltenstests und Schnittphysiologie durch. GC führte mit Hilfe von SL, HX, FL und XD In-situ-Hybridisierungs-, Faserphotometrie-Aufzeichnungs- und Miniskop-Bildgebungsexperimente durch; YZ hat das Manuskript mit Beiträgen von ZC und GC verfasst. KZ, CL, ZL und XZ haben das Manuskript überarbeitet. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft.

Korrespondenz mit Yingjie Zhu.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Chen, Z., Chen, G., Zhong, J. et al. Ein Kreislauf von Neurotensin-Neuronen des lateralen Septums zum Tuberkulosekern steuert die hedonische Ernährung. Mol Psychiatry 27, 4843–4860 (2022). https://doi.org/10.1038/s41380-022-01742-0

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Eingegangen: 22. März 2022

Überarbeitet: 08. August 2022

Angenommen: 10. August 2022

Veröffentlicht: 26. August 2022

Ausgabedatum: Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01742-0

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