Eine direkte erregende Projektion von Neuronen der entorhinalen Schicht 6b zum Hippocampus trägt zur räumlichen Kodierung und zum Gedächtnis bei

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4826 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Hippocampusformation (HF) von Säugetieren spielt eine Schlüsselrolle bei mehreren höheren Gehirnfunktionen wie räumlicher Kodierung, Lernen und Gedächtnis. Seine einfache Schaltkreisarchitektur wird oft als trisynaptische Schleife betrachtet, die Eingaben verarbeitet, die von den oberflächlichen Schichten des entorhinalen Kortex (EC) stammen, und sie an die tieferen Schichten zurücksendet. Hier zeigen wir, dass erregende Neuronen in Schicht 6b der Maus-EC in alle Unterregionen des HF projizieren und Eingaben von CA1, Thalamus und Claustrum erhalten. Darüber hinaus zeichnet sich ihr Output durch einzigartige, langsam abklingende erregende postsynaptische Ströme aus, die in ihren postsynaptischen Zielen Plateau-ähnliche Potenziale antreiben können. Die optogenetische Hemmung des EC-6b-Signalwegs beeinflusst die räumliche Kodierung in CA1-Pyramidenneuronen, während die Zellablation nicht nur den Erwerb neuer räumlicher Erinnerungen beeinträchtigt, sondern auch den Abbau zuvor erworbener Erinnerungen. Unsere Ergebnisse liefern Hinweise auf eine funktionelle Rolle für Neuronen der kortikalen Schicht 6b im erwachsenen Gehirn.

Der Hippocampus ist eine kortikale Region im Gehirn von Säugetieren, die für mnemonische Prozesse und raumbezogenes Verhalten erforderlich ist1. Basierend auf klassischen morphologischen Arbeiten wird der Kreislauf der Hippocampusformation (HF) oft als Schleife betrachtet, die an den beiden oberflächlichen Schichten 2 und 3 des entorhinalen Kortex (EC) beginnt und nach der Weiterleitung in seinen tieferen Schichten2,3 endet durch die großen Unterregionen des Hippocampus – Gyrus dentatus (DG), CA3 und CA1 – in einer Richtung4,5. Angesichts dieser Schaltkreisarchitektur ist es überraschend, dass verschiedene Manipulationen an den oberflächlichen EC-Schichten nur zu geringfügigen Veränderungen in der Aktivität und Dynamik der Hauptneuronen des Hippocampus führen6,7,8,9,10,11. Daher muss das Vorhandensein alternativer synaptischer Wege in Betracht gezogen werden.

Wir haben kürzlich eine Technik für die zuverlässige und effiziente transsynaptische retrograde Markierung auf Tollwutbasis entwickelt12, die bestehende Technologien verbessert13,14. Durch die Verwendung dieser Technik haben wir herausgefunden, dass der Hippocampus nicht nur kanonischen Input von den Schichten 2 und 3 des EC erhält, sondern auch von seinen tieferen Schichten, insbesondere von Schicht 612. Da Schicht 6 einen Großteil des EC ausmacht und einen großen Teil enthält Aufgrund des Anteils an erregenden Neuronen kann diese Gehirnregion einen erheblichen Einfluss auf die Aktivität des Hippocampus-Netzwerks haben. Bisher wurden Neuronen dieser Schicht ausschließlich nach ihrer charakteristischen polymorphen dendritischen Morphologie2,3,15,16 kategorisiert. Obwohl gezeigt wurde, dass diese Schicht Zellen mit räumlich selektiven Feuermustern beherbergt, die an die Aktivität von Gitterzellen erinnern17, wurde keine detaillierte molekulare, anatomische, physiologische oder funktionelle Charakterisierung dieser Zellpopulation durchgeführt.

Eine große Schwierigkeit bei der Analyse der Funktion der Schicht 6 ist ihre komplexe Organisation. Obwohl die kortikale Schicht 6 oft als eine einzige einheitliche Schicht betrachtet wird, unterscheiden sich Neuronen der Schicht 6b (manchmal auch als Schicht 718 bezeichnet) von Neuronen in Schicht 6a in Bezug auf die Entwicklung, genetisch und morphologisch19,20. Neuronen in Schicht 6b differenzieren viel früher als Neuronen in Schicht 6a und exprimieren mehrere Marker, die für Subplattenneuronen (SPNs) spezifisch sind, darunter Complexin 3 (Cplx3), Neurexophilin 4 (Nxph4) und den Bindegewebswachstumsfaktor (Ctgf)21,22. 23. Obwohl allgemein davon ausgegangen wird, dass SPNs eine vorübergehende Population sind24,25, wurde das Vorhandensein eines persistierenden Anteils von SPNs nachgewiesen22,26. Bemerkenswerterweise ähnelt die entorhinale Schicht 6 eher der kortikalen Schicht 6b27 als der Schicht 6a28 und scheint häufig mit der dünnen Zellschicht überzugehen, von der man annimmt, dass sie den Rest der Unterplatte darstellt18,24,26. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Schicht-6b-Neuronen über ihre Funktion in der kortikalen Entwicklung24,29,30,31 hinaus die Schaltkreisfunktion im erwachsenen Hippocampus regulieren können. Diese Hypothese wurde jedoch nicht direkt überprüft.

Um die Konnektivität und Netzwerkfunktion des EC-Tiefschicht-Inputs in den Hippocampus zu untersuchen, kombinierten wir auf dem Tollwutvirus basierende transsynaptische Markierung, molekulare Charakterisierung, Elektrophysiologie, Optogenetik und Verhaltensanalyse. Wir fanden heraus, dass EC-6b-Neuronen im erwachsenen Gehirn monosynaptisch mit den Hauptneuronen des Hippocampus verbunden sind und einen überraschend starken Einfluss auf die Aktivität des Hippocampus-Netzwerks haben, vom einzelnen Neuron bis zur Verhaltensebene.

Um eine bessere molekulare Charakterisierung von EC-6-Neuronen zu erreichen, untersuchten wir zunächst die Expression mehrerer neuronaler Marker (ergänzende Abbildung 1a – c). Wir fanden heraus, dass diese Schicht keine bekannten Marker für die neokortikale Schicht 6a wie Ntsr1 exprimiert, aber reich an bekannten Biomarkern für SPNs wie Cplx3, Nxph4 und Ctgf21, 22, 23 ist (ergänzende Abbildung 1a – c). Unter Verwendung einer Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdatenbank32 und fluoreszierender In-situ-Hybridisierung (FISH) fanden wir heraus, dass diese charakteristischen SPN-Gene im hinteren Kortex von Erwachsenen leistungsstarke Selektionsmarker für eine bestimmte Population erregender Neuronen sind, die beide innerhalb der kortikalen Schicht einzigartig sind 6 Cluster und innerhalb der Kortikalisplatte insgesamt (Ergänzende Abbildung 1d – h). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen erzeugte die Immunmarkierung für CPLX3 ein starkes Signal in Somata von Zellen in der tiefsten kortikalen Schicht, die als Schicht 6b oder Subplatte bezeichnet wird (definiert als ein 50 μm breites Band über der weißen Substanz22), aber auch entlang der kortikalen und hippocampalen Schicht 1 , dh Stratum Moleculare (SM), wo nur wenige CPLX3+-Somata nachgewiesen werden konnten (Abb. 1a und ergänzende Abb. 2a und b).

ein repräsentativer horizontaler Abschnitt, gefärbt für CPLX3 und DAPI (links), neben einer erweiterten Ansicht des Kortex (rechts). b Repräsentative STED-Bilder von LEC-1, gefärbt für CPLX3 neben VGluT1 (oben links) oder VGAT (unten links). Rechts neben jedem Bild über der entsprechenden Maske werden erweiterte Einfügungen angezeigt, die die Berechnung der Kolokalisierung für jeden Marker veranschaulichen. c Analyse der synaptischen Dichte unter Verwendung von STED-Bildern, die aus den Feldern aufgenommen wurden, die in (a) durch grün gestrichelte Quadrate gekennzeichnet sind. Die synaptische Dichte wurde hier als Verhältnis zwischen der Signalfläche und der gesamten Bildfläche berechnet. d Relative eCPLX3- und iCPLX3-Signaldichte des gesamten VGluT1- oder VGAT-Signalbereichs. e Die einseitige Injektion von retAAV in das CA1 ermöglicht die genetische Ausrichtung auf das kontralaterale CA3 zur retrograden Markierung und nutzt dabei die Fülle an Kommissuralaxonen der Pyramidenneuronen von CA3 (obere Schemata). Repräsentative horizontale Schnitte aus dem mittleren dorsalen Hippocampus der ipsilateralen (unten links) und kontralateralen (unten Mitte) Hemisphäre für die RetAAV-cre-Injektion. Doppelt markierte Neuronen im vergrößerten Ausschnitt (unten rechts) sind mutmaßliche Starterzellen. f, g Ein repräsentativer horizontaler Schnitt aus dem ventralen Hippocampus nach CA3-spezifischer retrograder Markierung zeigt eine Population von Neuronen in der tiefsten Schicht des EC (f), die eine positive Immunmarkierung für den Subplatten-spezifischen Marker CPLX3 aufweist (72/78 Zellen, gezählt von 5). Tiere, g). h Repräsentative horizontale Abschnitte der Schicht 6b nach retrograder Markierung mit CVS-N2c(deltaG)-tdTomato aus CA3-Neuronen einer GAD1-EGFP-Maus (links). Die Zahlen über den Balken im rechten Bereich geben die Gesamtzahl der doppelt markierten tdTomato+/EGFP+-Somata aus der Gesamtzahl der tdTomato+-Somata für jede der untersuchten Regionen an (P = 1,2 × 10−9; zweiseitiger exakter Fisher-Test). . i Zwei Biocytin-markierte CA3-projizierende pSPNs (magenta) aus einem akuten Hippocampusabschnitt (links) und einer Vergrößerung eines dendritischen Segments (rechts). Das Experiment wurde für 12 Zellen mit identischen Ergebnissen wiederholt. j Repräsentative Spuren spontaner EPSCs (obere Spur) und Membranpotential nach Strominjektionen von –50 pA (blau), 100 pA (rot) und 200 pA (schwarz; untere Spuren). Das folgende zusammenfassende Diagramm zeigt die Zündfrequenz als Funktion der Stromamplitude (N = 31 Zellen). Maßstabsbalken für vergrößerte repräsentative EPSCs (obere Kurve) und erste AP bei Rheobase-Strom (untere Kurve) zeigen 25 ms/20 pA bzw. 2 ms/20 mV an. N in c, d stellt die Anzahl der einzelnen Abschnitte von 6 verschiedenen Tieren dar. Die Daten in c, d, j werden als Mittelwert und SEM angezeigt.

Da es sich bei CPLX3 um ein synaptisches Protein33 handelt, stellten wir die Hypothese auf, dass die Immunreaktivität von CPLX3 entlang des SM auf die Existenz von Synapsen hinweisen könnte, die aus der Population persistenter SPNs resultieren. Mithilfe der STED-Bildgebung (Stimulated Emission Depletion) des SM aus verschiedenen Unterregionen des Hippocampus und Parahippocampus konnten wir bestätigen, dass CPLX3 in diesen Regionen weitgehend mit dem vesikulären Glutamattransporter 1 (VGluT1) und dem vesikulären GABA-Transporter (VGAT) kolokalisiert ), jeweils. Diese erregenden oder hemmenden CPLX3+-Terminals (eCPLX3/iCPLX3) wurden in ähnlichen Anteilen zueinander, jedoch in unterschiedlichen Anteilen in den verschiedenen Unterregionen der HF nachgewiesen (Abb. 1b, c und ergänzende Abb. 2c, d). Eine bemerkenswerte Ausnahme wurde im CA3 SM beobachtet, wo eCPLX3-Terminals fast 15 % aller glutamatergen Terminals ausmachten, wohingegen iCPLX3-Terminals weniger als 5 % aller GABAergen Terminals ausmachten.

Um zu testen, ob diese Terminals von EC-6b-Neuronen stammen, haben wir CA3-Pyramidenneuronen genetisch für die transsynaptische retrograde Markierung gezielt, indem wir zunächst das kontralaterale CA1 der tdTomato-Cre-Reporterlinie Ai9 mit retrograd transportierbarem Adeno-assoziiertem Virus (retAAV)34, das Cre exprimiert, injizierten -Rekombinase und das ipsilaterale CA3 mit Adeno-assoziiertem Virus (AAV), das eine cre-abhängige TVA-2A-N2cG-Kassette exprimiert. Eine anschließende Injektion von envA-pseudotypisierten, G-deletierten CVS-N2c-Tollwutvirusvektoren (RVdGenvA-CVS-N2c), die EGFP12,14 exprimierten, zwei Wochen nach der Anwendung beider AAVs führte zu einer umfassenden und spezifischen retrograden Markierung von CA3-Pyramidenneuronen ( Abb. 1d und ergänzende Abb. 3a, b). In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen konnte ein weit verbreitetes EGFP-Signal entlang der Schicht 2 des medialen und lateralen EC (MEC bzw. LEC) beobachtet werden und stimmte mit unserer Vorhersage überein, auch in CPLX3+ EC-6b-Neuronen (Abb. 1e, f). Da im sich entwickelnden Gehirn die Subplattenschicht sowohl erregende als auch hemmende Projektionsneuronen hervorbringen könnte36, führten wir ein zusätzliches retrogrades Markierungsexperiment mit GAD1-EGFP-Mäusen durch und stellten fest, dass die überwiegende Mehrheit der Projektionsneuronen von EC-6b GAD1 waren -negativ (Abb. 1h und ergänzende Abb. 3c, d). Intrazelluläre elektrophysiologische Aufzeichnungen und die anschließende Bildgebung von mit Biozytin gefüllten CA3-projizierenden Neuronen in EC-6b zeigten eine polymorphe Arborisierung dicht stacheliger Dendriten (Abb. 1i), spontane erregende postsynaptische Ströme (EPSCs) und eine mäßige Spitzenaktivität als Reaktion auf Strominjektionen ( Abb. 1j und Ergänzungstabelle 1). Diese Beobachtungen legen nahe, dass Neuronen in der tiefsten Schicht des EC persistente SPNs sind, die mit der kortikalen Schicht 6b fortfahren, und bestätigen die Existenz einer direkten erregenden Projektion auf den SM des Hippocampus CA3. Im Gegensatz dazu können die von uns entdeckten iCPLX3-Terminals aus lokalen Cplx3 + SM-Interneuronen stammen und dem molekularen Profil zuvor beschriebener neurogliaformer Zellen der Schicht 1 entsprechen (ergänzende Abbildung 4a, d). Zusammengenommen belegen diese Ergebnisse das Vorhandensein einer direkten erregenden synaptischen Verbindung von EC-6b-Neuronen zum Hippocampus.

Um die anatomische Ausdehnung der CA3-projizierenden EC-6b-Neuronen zu bewerten und ihren relativen Anteil an anderen CA3-projizierenden kortikalen Populationen zu quantifizieren, haben wir die gesamte HF mithilfe der konfokalen Mikroskopie nach transsynaptischer retrograder Markierung herausgeschnitten, optisch gereinigt und abgebildet der CA3 (Abb. 2a, b). Die resultierende Analyse ergab, dass CA3-projizierende Neuronen entlang der gesamten dorsoventralen Achse des EC-6b mit einer wesentlich höheren Dichte in der Nähe seines ventralen Pols gegenüber dem LEC gefunden wurden (Abb. 2c).

eine schematische 3D-Übersicht der verschiedenen Komponenten, aus denen die Hippocampusformation besteht. A, D und M stehen jeweils für anterior, dorsal und medial. b Intaktes, gereinigtes Cortico-Hippocampus-Präparat nach retAAV-unterstützter Markierung von CA3-Neuronen, wie in Abb. 1e (rot – tdTomato, Cyan – N2c-EGFP; oben links) gezeigt, neben Projektionen der XY-Ebene entlang der nachgezeichneten Linien (links). , unten) und ein kommentiertes Bild der Präparation in der Z-Ebene (rechts). c Visuelle Darstellung der Verteilung von N2c-EGFP-markierten Neuronen im EC und HC nach retrograder Markierung von CA3. d, CA1-spezifisches retrogrades Markierungsschema (oben links) und repräsentative konfokale Bilder des HC (unten links) und des EC (rechts). e Wie c, jedoch mit retrograder Markierung von CA1. f DGC-spezifisches retrogrades Markierungsschema (oben links) und repräsentative konfokale Bilder des HC (unten links) und des EC (rechts). g Wie c, jedoch mit retrograder Kennzeichnung durch den DG. h CA1 IN-spezifisches retrogrades Markierungsschema (oben links) und repräsentative konfokale Bilder des HC (unten links) und des EC (rechts). i, wie c, jedoch für die retrograde Markierung von Hippocampus-Interneuronen. j Markierungsverteilung über kortiko-hippocampale Subregionen nach retrograder Markierung von CA3, CA1 und DG. Der Anteil in jeder Region wurde für jede Bedingung der Gesamtzahl der Neuronen 2. Ordnung separat berechnet. k Anteil der entorhinalen SPNs an der Gesamtzahl der Projektionsneuronen im EC, nach retrograder Markierung von den Interneuronen CA3, CA1, DG und Hippocampus. l Anzahl der Neuronen 2. und 1. Ordnung für jede Starterpopulation (links) zusammen mit einer zusammenfassenden Darstellung der berechneten Verhältnisse von Neuronen 2. und 1. Ordnung (rechts). Für alle Berechnungen wurde die Anzahl der CA3- und Mooszellen mit 2 multipliziert, um die Anzahl der kommissuralen Projektionsneuronen zu berücksichtigen. Für DG, n = 6, für alle anderen Bedingungen, n = 4 Mäuse. Sofern nicht anders angegeben, repräsentieren die Maßstabsbalken 200 µm. Das Bild in a wurde mit dem Brain Explorer 2™ des Allen Institute aufgenommen. Die Daten in jl werden als Mittelwert und SEM angezeigt, wobei für jedes Experiment einzelne Datenpunkte angezeigt werden.

Da eCPLX3-Terminals auch im SM aller anderen Unterregionen des Hippocampus beobachtet wurden, wenn auch in geringerer Dichte, haben wir diesen Ansatz um die retrograde Markierung der Interneurone CA1, DG und Hippocampus erweitert. Um präsynaptische Partner von CA1-Pyramidenneuronen zu identifizieren, wurden diese Zellen durch Injektion einer cre-off-AAV-Kassette unter der Kontrolle des CaMKIIa-Promotors12 in die CA1-Region von KA1-cre-Mäusen gezielt, in denen cre selektiv in CA3 und DG38 exprimiert ( Abb. 2d), wodurch eine retrograde Markierung durch nahegelegene CA3- und die meisten CA2-Neuronen verhindert wird (ergänzende Abb. 5a, b). Diese Experimente ergaben, dass CA1-Neuronen zusätzlich zum Haupt-EC-3- und einem EC-5a-Eingang, der kürzlich ausführlicher beschrieben wurde (ergänzende Abbildung 5c, d), auch einen wesentlichen Eingang vom dorsalen Pol des EC-6b besteht gegenüber dem MEC (Abb. 2d, e, j), das ähnlich der EC-6b-Projektion auf CA3 ist, überwiegend aus erregenden Neuronen (ergänzende Abb. 6a).

Um präsynaptische Partner von Dentatgranula-Zellen (DGCs) zu identifizieren, injizierten wir cre-abhängige AAVs in die DGC-spezifische Prox1-cre-Linie (Abb. 2f). Wir fanden heraus, dass diese Population einen gleichmäßig verteilten, aber spärlichen erregenden Input vom EC-6b erhielt (Abb. 2f – j und ergänzende Abb. 6b). Um schließlich festzustellen, ob die EC-6b-Projektion zusätzlich zur Erregung möglicherweise eine Feed-Forward-Hemmung auslöst, führten wir eine retrograde Markierung mit RVdGenvA-CVS-N2c-tdTomato aus Hippocampus-INs mittels AAV-vermittelter Expression eines Flp-abhängigen durch Kassette im Hippocampus der IN-spezifischen DLX5/6-FlpE-Linie, gekreuzt mit einer EGFP-Flp-Reporterlinie12 (Abb. 2h und ergänzende Abb. 6c). Zu den retrograd markierten Zellen gehörten Hauptneuronen im Hippocampus und in oberflächlichen kortikalen Schichten sowie eine sehr spärliche Markierung von Neuronen in EC-6b (Abb. 2h – j und ergänzende Abb. 6d, e). Dieses Ergebnis legt nahe, dass EC-6b-Neuronen weniger Feed-Forward-Hemmung hervorrufen als EC-2/3-Neuronen, was möglicherweise ihren relativen Beitrag zum gesamten extrinsischen Erregungsantrieb für Pyramidenneuronen des Hippocampus erhöht.

Um den relativen Beitrag der erregenden Eingaben von EC-6b zu jeder dieser Hippocampuspopulationen zu bestimmen, haben wir für jede Maus den Anteil retrograd markierter Neuronen in Schicht 6b an der gesamten markierten Population über alle EC-Schichten berechnet (Abb. 2k). Wir fanden heraus, dass dieses Verhältnis die in Abb. 1c beschriebenen relativen Schätzungen der synaptischen Dichte von eCPLX3/VGluT1 widerspiegelt. Sowohl die in Abb. 1c als auch die in Abb. 2k angegebenen Verhältnisse lieferten unabhängige, aber sehr ähnliche Schätzungen zum Beitrag der EC-6b-Projektion zum kortikalen Netto-Input und untermauerten damit diese Ergebnisse zusätzlich. Diese Kreuzvalidierung ermöglicht eine Annäherung des relativen Beitrags dieser Projektion in Regionen, die für eine retrograde Markierung nicht einfach zerlegt werden können, unter Verwendung der Quantifizierung der lokalen synaptischen eCPLX3-Dichte. Eine zusätzliche Quantifizierung des Neuronenverhältnisses 2./1. Ordnung für die Populationen erregender Neuronen bestätigte die Hochdurchsatzmarkierung unter allen Bedingungen, wobei niedrigere Verhältnisse nach retrograder Markierung durch die DG beobachtet wurden (Abb. 2l), möglicherweise aufgrund einer hohen Abweichung von eine kleine Anzahl von EC-Neuronen zu einer großen Anzahl von DGCs40. Diese Ergebnisse zeigen, dass die EC-6b-Projektion auf alle Subpopulationen des Hippocampus abzielt, wobei erregende Neuronen in CA1 und CA3 bevorzugt werden.

Unsere Ergebnisse liefern eine detaillierte Beschreibung der EC-6b-Hippocampusprojektion. Um jedoch zu verstehen, welche Art von Informationen diese Zellen weiterleiten, ist eine parallele funktionelle Charakterisierung ihrer synaptischen Eingänge erforderlich. Wir fanden heraus, dass die Ctgf-2A-dgCre-Treiberlinie41,42 nach Verabreichung des Antibiotikums Trimethoprim (TMP) eine induzierbare genetische Dissektion von exzitatorischen Cplx3+-EC-6b-Neuronen ermöglicht, nicht jedoch von Cplx3+-EC-Layer-1-INs oder Hippocampus-SM-INs (Abb. 3a). und ergänzende Abb. 7a – c). Diese Mäuse wurden dann verwendet, um EC-6b für die duale anterograde und retrograde Markierung anzuvisieren, vermittelt durch eine Kombination von cre-abhängigen AAV- und RVdGenvA-CVS-N2c-Vektoren, um ihr erweitertes Verbindungsnetzwerk zu rekonstruieren (Abb. 3b und Ergänzung). Abb. 7d, e).

a Repräsentative horizontale Schnitte von Ctgf-2A-dgCre-Mäusen, die mit der Ai9-tdTomato-Reporterlinie gekreuzt wurden, zeigen eine effiziente TMP-induzierbare genetische Dissektion von Cplx3+-Neuronen in der kortikalen Schicht 6b. b Eine Darstellung des AAV-Injektionsschemas für die subplattenspezifische duale anterograde und retrograde Markierung. c, d Ein repräsentativer horizontaler Abschnitt nach retrograder Markierung von der entorhinalen Unterplatte und Immunmarkierung für NeuN (c) und repräsentative koronale Abschnitte (d), der die Projektionen zu und von kortikalen und subkortikalen Regionen zeigt. e Ein repräsentativer horizontaler Abschnitt, immunmarkiert für CPLX3 (links) und vergrößerte Ansichten des CA3-CA1-Übergangsbereichs und der tiefen Schichten des EC, nach Immunmarkierung für PCP4. ld – Lamina dissecans. f Zusammenfassungsdiagramme, die die Neuronenzahl aus allen Regionen zeigen, die zur entorhinalen Unterplatte projizieren, im Verhältnis zur Gesamtzahl der in jeder Präparation gezählten EGFP+-Neuronen, gemessen aus intaktem und gereinigtem Kortikalis- und Hirnstammgewebe (n = 6 Mäuse). g, Markierungsdichte von NeuN+ + EGFP+-Kernen in Schlüsselregionen, relativ zu ihrer jeweiligen Gesamt-NeuN-Anzahl (n = 5 Mäuse). Die Daten in f, g werden als einzelne Datenpunkte (offene Kreise), Mittelwert (gefüllte Kreise) und SEM angezeigt.

Die Axonverfolgung von tdTomato+-Neuronen ergab, dass diese Population neben den Strukturen innerhalb der HF, die zuvor als immunreaktiv für CPLX3 befunden wurden, auch nur spärlich auf den lateralen Septumkern (LS) und die Lamellenregionen der vorderen Thalamuskerne (ATN) projiziert wurde. Die gleichzeitige retrograde Verfolgung mit RVdGenvA-CVS-N2c-EGFP ergab Projektionen auf EC-6b-Neuronen vom medialen Septumkern (MS) und dem Diagonalband von Broca (DBB) sowie den Thalamuskernkernen, die das ATN (AD – Anterodorsal) umfassen ; AM – Anteromedial; AV – Anteroventral) zusammen mit dem Nucleus reuniens (Re) (Abb. 3d). Von der Kortikalisplatte gingen spärliche Vorsprünge aus dem cingulären Kortex (Cg), dem retrosplenialen Kortex (RSC) und der kortikobasalen Amygdala (CoA) aus. Während alle diese Regionen zuvor mit dem erweiterten Hippocampus-Netzwerk in Verbindung gebracht wurden, fanden wir auch eine markante Projektion der gesamten antero-posterioren Ausdehnung des Claustrums (Cla), deren Zusammenhang mit dem HF selten festgestellt wird (Abb. 3c, d, f, g). EC-6b-Neuronen erhielten auch umfangreiche Eingaben von bestimmten Subpopulationen innerhalb der HF; Aus dem eigentlichen Hippocampus stammt der erregende Input ausschließlich von CA1 und Subiculum, zusammen mit einer Population mutmaßlich hemmender Neuronen im CA3 Stratum oriens und Radiatum. Innerhalb der EC erwies sich Schicht 5a als primäre Inputquelle für EC-6b, mit spärlicherem Input von den anderen kortikalen Schichten, was sich durch die Markierung von PCP4 auszeichnete, das selektiv in EC-3- und EC-5b-Neuronen exprimiert wurde , jedoch nicht EC-2 und EC-5a43 (Abb. 3e – g).

Alle bisher vorgelegten Beweise deuten auf die Existenz einer strukturellen synaptischen Verbindung zwischen EC-6b-Neuronen und Hauptneuronen des Hippocampus hin. Allerdings ist es immer noch möglich, dass es sich bei diesen Kontakten lediglich um strukturelle Überbleibsel aus frühen Entwicklungsstadien handelt und keine funktionellen Synapsen im erwachsenen Gehirn darstellen. Um diese Möglichkeit anzugehen, exprimierten wir einen optogenetischen Aktuator in Schicht 6b, indem wir die Ctgf-2A-dgCre-Linie mit Ai32-Mäusen kreuzten, die bedingt ChR2(H134R)-EYFP exprimieren, und optogenetisch induzierte Reaktionen von Pyramidenneuronen in CA3b gemessen (Abb. 4a und ergänzende Abb. 8a–c). Um die physiologischen Eigenschaften der EC-6b-Projektion auf CA3 mit anderen bekannten Signalwegen zu vergleichen, exprimierten wir auch Aktoren speziell in EC-2-Neuronen und DGCs. Ersteres wurde durch retrograde Markierung der DG erreicht, die zu einer umfassenden Markierung von EC-2, aber nur einer spärlichen Markierung von EC-6b führte (Abb. 4b und ergänzende Abb. 8d – j), und letzteres durch AAV-EF1a-DIO-ChIEF-2A-dTomato-Injektion in die DG von Prox1-cre-Mäusen (Abb. 4c). Während nach der Stimulation des EC-6b-Signalwegs postsynaptische Reaktionen beobachtet wurden, unterschieden sich diese deutlich von denen der Projektionen des Perforationspfads (PP) oder der Moosfasern (MF) auf den CA3 (Abb. 4d – i). Während die EPSC-Spitzenamplitude und die Latenz bis zum Einsetzen von EC-6b-CA3-EPSCs mit denen von PP-CA3-EPSCs identisch waren (Abb. 4j, k), waren die Anstiegszeit von 20–80 %, die Abklingzeitkonstante und die Dauer deutlich langsamer und die kurzfristige Depression war nahezu absolut (Abb. 4l – o). In ähnlicher Weise haben die exzitatorischen postsynaptischen Potentiale (EPSPs) von EC-6b-CA3 einen langsamen zeitlichen Verlauf, der den zuvor beschriebenen Plateaupotentialen in Hippocampus-Neuronen ähnelt (Abb. 4p). Weitere Aufzeichnungen von optogenetisch hervorgerufenen Strömen und Potentialen bestätigten, dass EPSCs bei einem negativen Haltepotential (–60 mV), aber diesem großen NMDAR empfindlich auf den AMPAR- und KAR-Antagonisten 6-Cyano-7-nitrochinoxalin-2,3-dion (CNQX) reagierten Unter positivem Haltepotential (+40 mV) sind noch Ströme zu beobachten. Dies ist eine zusätzliche Bestätigung dafür, dass diese Ströme überwiegend durch die Freisetzung von Glutamat vermittelt werden und dass die langsame Kinetik nicht auf polysynaptische Aktivität zurückzuführen ist, da diese durch CNQX blockiert würde (Abb. 4q – r und ergänzende Abb. 9a – f). Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass EC-6b-Neuronen eine einzigartige und leistungsstarke glutamaterge synaptische Verbindung mit CA3-Pyramidenneuronen herstellen.

a–c Repräsentative Bilder akuter Hippocampusschnitte nach spezifischer Expression optogenetischer Aktoren (gelb) speziell in EC-6b (a), EC-2 (b) oder DG (c) während der Aufzeichnung postsynaptischer Reaktionen von Neuronen in CA3b (Magenta). Der weiße gestrichelte Kreis zeigt die Zielregion für die Photostimulation an und die Maßstabsbalken repräsentieren 200 µm. d–f Repräsentative individuelle (grau) und gemittelte (schwarz) Spuren optogenetisch hervorgerufener EPSCs nach einer 10-Hz-Folge von 5-ms-Lichtimpulsen von 6b-CA3 (d), PP-CA3 (e) oder MF -CA3 (f) Projektionen. g–i Zehn überlagerte Spannungsreaktionen auf 6b-CA3 (g), PP-CA3 (h) oder MF-CA3 (i) Stimulation. j–o Zusammenfassungsdiagramme, in denen die EPSC-Eigenschaften für jeden der Pfade verglichen werden: Spitzenamplitude der ersten Reaktion (j), Latenz bis zum EPSC-Beginn ab Beginn der Stimulation (k), 20–80 % Anstiegszeit (l), Abfall Zeitkonstante (m), Dauer bei halbem Maximum (n) und Paarimpulsverhältnis bei 100 ms Interstimulusintervall (o). Einzelne Datenpunkte werden als offene Kreise angezeigt und Balken geben den Mittelwert und den SEM für jede Bedingung an. Die Schemata über den Diagrammen veranschaulichen die jeweils gezeigten gemessenen EPSC-Eigenschaften. p–r Repräsentative 6b-CA3-Reaktionen zeigen Plateau-artige EPSPs mit einem einzelnen verkürzten AP (p; grau, einzelne Spuren; schwarz, Durchschnitt), EPSCs wurden in Gegenwart von 100 μM Gabazin und 25 μM CNQX bei einem negativen Haltepotential aufgezeichnet ( q) und EPSCs wurden in Gegenwart von 100 μM Gabazin, 25 μM CNQX und 50 μM D-AP5 bei einem positiven Haltepotential (r) aufgezeichnet. Die Anzahl der Messungen für jede Bedingung wird in der Legende in Klammern angezeigt (siehe k). Die Diagramme j–o zeigen einzelne Datenpunkte, wobei Mittelwert und SEM als vertikale und horizontale schwarze Linien angezeigt werden. Statistische Unterschiede mit P < 0,05 unter Verwendung des zweiseitigen Mann-Whitney-Tests (Holm-Bonferroni-bereinigt) wurden als signifikant angesehen. Einfache (*), doppelte Sternchen (**) und dreifache Sternchen (***) geben P < 0,05, P < 0,01 bzw. P < 0,001 an.

Während die Existenz einer erregenden Projektion, die Plateau-ähnliche postsynaptische Potenziale erzeugen kann, nicht vorhergesagt wurde, wurde zuvor gezeigt, dass ähnliche Aktivitätsmuster für die Erzeugung neuer Ortsfelder in CA1-Pyramidenneuronen ausreichen44,45, was darauf hindeutet, dass der EC-6b-Signalweg dies könnte spielen eine entscheidende Rolle bei der Verarbeitung räumlicher Informationen (SI). Um diese Hypothese zu testen, haben wir den optogenetischen Inhibitor ArchT spezifisch in Schicht-6b-Neuronen exprimiert, indem wir die Ctgf-2A-dgCre-Treiberlinie mit Ai40-Reportermäusen gekreuzt haben, in denen ArchT-EGFP bedingt exprimiert wird (Abb. 5a). Anschließend implantierten wir diesen Tieren chronisch eine optische Faser über dem CA1-SM sowie sechs unabhängig voneinander bewegliche Tetroden in der CA1-Pyramidenschicht (ergänzende Abbildung 10a). Wir haben uns auf die CA1-Region konzentriert, wo wir die größten Auswirkungen der experimentellen Manipulation erwarteten, da direkte Effekte über EC-6b-CA1-Synapsen und indirekte Netzwerkeffekte (EC-6b–DG–CA3–CA1 und EC-6b–CA3–CA1) könnte sich ansammeln. Anschließend wurden die Tiere in eine quadratische Arena gebracht und nach einer 30-minütigen Eingewöhnungssitzung (S1) weitere 30 Minuten mit der Erkundung fortfahren gelassen, wobei die Photoinhibition nur in einem zufällig zugewiesenen Quadranten (S2) aktiviert wurde. Darauf folgte eine dritte 30-minütige Sitzung, bei der wiederum keine Photoinhibition angewendet wurde (S3) (Abb. 5b). Die anschließende Analyse des SI-Scores mutmaßlicher Pyramidenzellen ergab, dass die Photoinhibition nur im manipulierten Quadranten während der Photoinhibitionssitzung zu einer akuten Abnahme des SI führte, die nach Aufhebung der Photoinhibition weitgehend wiederhergestellt wurde (Zielquadrant: P = 1,02 × 10−23; Rest der Arena: P = 0,01; Zweiseitiger Mann-Whitney-Test, Abb. 5c). Diese Abnahme des SI konnte nicht durch ein beobachtbares Verhaltenskorrelat wie Belegung oder Bewegungsgeschwindigkeit erklärt werden und war auch nicht mit einer Änderung der grundlegenden Feuereigenschaften von erregenden oder hemmenden Neuronen in der CA1-Pyramidenzellschicht verbunden (ergänzende Abbildung). 10b–j). Da unter allen Hippocampus-projizierenden Neuronen nur die EC-Schicht 6b Ctgf exprimierte (ergänzende Abbildung 8a – c), deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass EC-6b-Neuronen die räumliche Kodierung regulieren.

Ein repräsentativer parasagittaler Abschnitt, der die spezifische Expression von ArchT-EGFP in Schicht 6b und die Position der optischen Faser in einer Ctgf-2A-dgCre-Maus zeigt, die mit einer ArchT-EGFP (Ai40) Cre-Reportermaus gekreuzt wurde. b Repräsentative Positionsdiagramme für die drei aufeinanderfolgenden Expositionssitzungen (oben) und entsprechende Feuerratenkarten von 12 repräsentativen Einheiten, geordnet nach ihrem räumlichen Informationswert in S3. Die Zahlen über jedem Diagramm geben die Spitzenfeuerrate (Hz) an. c Ein zusammenfassendes Diagramm, das die durchschnittlichen räumlichen Informationen für CA1-Pyramidenzellen innerhalb des beleuchteten Quadranten (grün) relativ zum Rest der Arena (grau) in jeder Belichtungssitzung (links) zeigt, zusammen mit einem Boxdiagramm, das die mittlere Änderung des SI zwischen S2- und S1 und S3-S1 für Zellen innerhalb und außerhalb der Zielregion (rechts). Die Mitte des Boxplots, die Grenzen der Box und die Whisker stellen den Median, das obere und untere 25. bzw. obere und untere 10. Perzentil dar. Insgesamt wurden 184 Einheiten von 4 Tieren in die Analyse einbezogen. Einzelne (*) und dreifache Sternchen (***) zeigen P < 0,05 bzw. P < 0,001 an. d Repräsentative Bilder des Hippocampus einer Ctgf-2A-dgCre-Maus, gekreuzt mit einer Rosa(stop)DTA-Maus, immunmarkiert für CPLX3, entweder ohne (oben links) oder 9 Tage nach der Verabreichung von TMP (oben rechts) mit repräsentativen STED-Bildern aus Das CA3 SM unten zeigt die Dichte von VGluT1 und eCPLX3 zu jedem Zeitpunkt. Änderungen der Dichte von VGluT1 und eCPLX3/VGluT1 werden für CA1 und CA3 SM zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verabreichung von TMP quantifiziert, wobei jeder Punkt ein einzelnes Tier darstellt (n = 3 Tiere pro Gruppe) und Linien den Durchschnitt für jede Erkrankung darstellen ( unteres Diagramm). e Schematische Darstellung des Versuchsprotokolls im Intellicage. f Zeitdiagramm der durchschnittlichen Gruppenfehlerrate an jedem der Versuchstage. TMP wurde am Versuchstag 0 verabreicht, angezeigt durch einen schwarzen Pfeil. g Streudiagramm zwischen der Dichte überlebender eCPLX3-Terminals im CA3 SM, berechnet aus STED-Bildern, und der Fehlerrate für jedes Tier in der TMP-Gruppe an den Versuchstagen 8 und 9, entsprechend dem letzten Tag des endgültigen neuen Standorts ( D) bzw. der erste Tag der Rückkehr an den vertrauten Ort (A*). Einseitiger Spearman-Rangkorrelationskoeffizient (rs) mit dem entsprechenden unten angegebenen P-Wert und gestrichelten Regressionslinien für jede Gruppe. Die Daten in (c, links) und f werden als Mittelwert angezeigt und SEM- und Maßstabsbalken auf den Bildern repräsentieren 200 µm.

Basierend auf diesen Erkenntnissen stellten wir die Hypothese auf, dass dieser neue synaptische Weg bei der Vermittlung der Bildung und Beibehaltung des räumlichen Gedächtnisses gleichermaßen wichtig sein könnte. Um diese Frage zu beantworten, haben wir Ctgf-2A-dgCre-Mäuse mit RosaStopDTA-Mäusen gekreuzt, um eine selektive bedingte Ablation der EC-6b-Population im erwachsenen Gehirn zu ermöglichen und gleichzeitig alle anderen erregenden Hippocampusprojektionen mit großer Reichweite zu schonen (Abb. 5d und Ergänzung). Abb. 8a–c). Doppelt transgene Tiere wurden dann gemeinsam in einer Intellicage-Umgebung46 gehalten, die es uns ermöglichte, den Ort der Wasserverfügbarkeit für jedes Tier individuell aus der Ferne zu steuern und sein Erkundungsverhalten zu überwachen. Nach einer Gewöhnungsphase ordneten wir jedem Tier einen bestimmten Port zu (Abb. 5e; „A“), wo es uneingeschränkten Zugang zu Wasser haben konnte, und injizierten den Tieren fünf Tage später entweder TMP, um eine spezifische Ablation von Schicht 6b zu induzieren, oder mit Fahrzeuglösung. Unmittelbar nach dieser Manipulation ordneten wir jedem Tier für einen Zeitraum von drei Tagen einen anderen Wasseranschluss zu und drehten es symmetrisch in eine andere Ecke und Seite. Insgesamt wurde dieser Vorgang dreimal wiederholt (Abb. 5e; „B“, „C“ und „D“), bevor die Tiere wieder dem ursprünglichen Hafen zugewiesen wurden, dessen Standort sie vor der Manipulation erfuhren (Abb. 5e, „ A*"). Wir fanden heraus, dass die Fähigkeit EC-6b-ablatierter Tiere, neue Belohnungsorte zu lernen, beeinträchtigt wurde („D“ gegenüber „A“), und zwar in einem Tempo, das dem des Ablationsprozesses sehr nahe kam (Abb. 5d). Unerwarteterweise hatten diese Mäuse auch Schwierigkeiten, den Ort zu vergessen, den sie unmittelbar vor der Manipulation gelernt hatten („A*“ versus „A“).

Die ausgerichtete Rangtransformations-Dreiwege-ANOVA-Analyse zeigte signifikante Auswirkungen der Sitzung und des Versuchstages und zeigte darüber hinaus eine hochsignifikante Interaktion zwischen Gruppe (TMP gegenüber Vehikel) und Sitzung (A, D, A*; P = 1,3 × 10−4). Dies weist darauf hin, dass die Zellablation das Lernen in neuen und vertrauten Sitzungen erheblich, aber unterschiedlich beeinflusste (Abb. 5e). Sowohl in der neuartigen Sitzung „D“ als auch in der bekannten Sitzung „A*“ zeigten EC-6b-ablatierte Tiere reduziertes Lernen („D“: TMP, P = 0,036 gegenüber Veh, P = 1,8 × 10−4; „A*“: TMP, P = 0,116 versus Veh, P = 2,2 × 10−4). Da die Auswirkungen bei einzelnen Tieren unterschiedlich waren, gingen wir davon aus, dass die Leistung der Tiere mit dem Grad der Ablation korreliert. Um diese Hypothese zu testen, haben wir die individuelle Fehlerrate an den Tagen 8 und 9 des Verhaltenstests, die dem letzten Tag des dritten neuen Hafens und dem ersten Tag nach der Rückkehr in den vertrauten Hafen entsprechen, gegen den Grad der Schicht-6b-Ablation aufgetragen. gemessen anhand der Dichte der verbleibenden eCPLX3-Terminals im Verhältnis zur gesamten VGluT1-Dichte im CA3 (Abb. 5g). Wir fanden heraus, dass der Erwerb neuer räumlicher Erinnerungen signifikant mit der eCPLX3-Dichte korrelierte, während es bei der Beibehaltung zuvor erworbener Erinnerungen einen Trend in die entgegengesetzte Richtung gab (Abb. 5g; rs = −0,91, P = 3 × 10−5 gegenüber rs =). 0,46, P = 0,11). Somit waren die Tiere mit der stärksten Ablation diejenigen mit der schlechtesten Leistung am Tag 8 und der besten Leistung am Tag 9 und umgekehrt. Diese Ergebnisse bestätigen die Beteiligung von EC-6b sowohl an der Bildung neuer als auch an der Beibehaltung alter räumlicher Erinnerungen.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass Neuronen in der tiefsten entorhinalen Schicht, die dem molekularen21,22,23, morphologischen26,27 und elektrophysiologischen47 Profil der kortikalen Schicht 6b entsprechen, auf alle Unterregionen des Hippocampus und wahrscheinlich des Parahippocampus projizieren und dabei das charakteristische bidirektionale Konnektivitätsmuster aufweisen mit Thalamuskernen, die zuvor für die SPNs im Gehirn von Neugeborenen beschrieben wurden 26,48,49,50 (Abb. 1–3 und ergänzende Abb. 1, 2). Somit deuten mehrere Beweislinien darauf hin, dass die Hippocampus-projizierenden EC-6b-Neuronen, die wir im erwachsenen Gehirn identifiziert haben, einer persistenten Population von SPNs entsprechen. Dies ist ein unerwarteter Befund, nicht nur, weil bisher nicht über die Existenz solcher Zellen im EC berichtet wurde, sondern vor allem, weil angenommen wird, dass die tieferen Schichten die Hippocampus-Produktion selektiv verarbeiten und neu verteilen2,3.

SPNs sind die ersten Neuronen, die während der Embryonalentwicklung bei E11.5–E12.529 erzeugt werden, und es ist allgemein anerkannt, dass sie eine herausragende Rolle bei verschiedenen Prozessen im Zusammenhang mit der kortikalen Entwicklung spielen, wie z. B. Zellmigration, Differenzierung und Verdrahtung der kortikalen Schichten24 ,51,52,53. In Übereinstimmung mit dieser vorgeschlagenen Funktion wird allgemein angenommen, dass SPNs kurz nach Abschluss der Kortikogenese sterben, vermutlich durch programmierten Zelltod24,25,54. Allerdings häufen sich die Hinweise darauf, dass Subpopulationen von SPNs, vorzugsweise solche, die Cplx3 und Ctgf exprimieren, bis ins Erwachsenenalter bestehen bleiben18,22,26,55, und unsere Ergebnisse bestätigen und erweitern diese früheren Erkenntnisse. Der Beitrag von SPNs zur kortikalen Entwicklung und von Schicht 6b zur Schaltkreisdynamik beim Erwachsenen schließt sich möglicherweise nicht gegenseitig aus und es wird interessant sein, mögliche Wechselwirkungen zwischen den beiden Prozessen in der Zukunft zu untersuchen.

Seit der klassischen Arbeit von Santiago Ramón y Cajal56 wird der EC-Hippocampus-Schaltkreis oft als trisynaptische Schleife betrachtet, in der die Hauptschaltkreiselemente linear verbunden sind. Obwohl geringfügige Ergänzungen vorgenommen wurden, ist das grundlegende Konnektivitätsschema unangefochten geblieben5. Unsere Ergebnisse identifizieren einen neuartigen Zusammenhang in diesem etablierten Schaltkreis. Obwohl die Anzahl der EC-6b-Neuronen viel geringer ist als die der EC-2/3-Neuronen, konvergieren einzigartige funktionelle und strukturelle Eigenschaften, die diesen Neuronen einen Einfluss verleihen, der in keinem Verhältnis zu ihrer Anzahl steht. Erstens zeigt das EPSC einen langsamen Zerfall und eine absolute synaptische Depression, was zu Plateau-ähnlichen EPSPs in postsynaptischen Zielzellen führt, deren Beginn auf das erste Spitzenereignis in einem bestimmten Burst abgestimmt ist (Abb. 4d, p). Zweitens erhalten EC-6b-Neuronen konvergente Eingaben von mehreren Quellen, insbesondere vom Claustrum – einem zentralen und stark vernetzten kortikalen Hub57 (Abb. 3), und zielen auf alle Unterregionen ab, aus denen die HF besteht (Abb. 1d). Schließlich könnte ein hoher Grad an Interkonnektivität zwischen SPNs, der sowohl durch chemische als auch elektrische Synapsen vermittelt wird und im sich entwickelnden Kortex53,58,59 beobachtet wird, bis ins Erwachsenenalter bestehen bleiben, was es einer kleinen Anzahl miteinander verbundener SPNs ermöglicht, die Aktivität über kortiko-hippocampale Unterregionen hinweg zu synchronisieren. Zusammengenommen könnten diese einzigartigen Eigenschaften die wichtige Rolle dieser Neuronen im Verhalten erklären und auf eine einheitlich wichtige Funktion in der gesamten Kortikalisplatte hinweisen.

Mehrere Mechanismen könnten den langsamen Zerfall von EC-6b-CA3 EPSCs erklären. Es ist möglich, dass die Kinetik des Glutamatrezeptors zum langsamen Zeitverlauf beiträgt, obwohl die unterschiedliche Kinetik der EC-2- und EC-6b-Einträge, die an den distalen Dendriten derselben Zelltypen enden, gegen diese Möglichkeit sprechen könnte. Alternativ könnten asynchrone Senderfreigabe, Sender-Spillover und Volumenübertragung eine Rolle spielen. Es ist interessant festzustellen, dass EC-6b-Neuronen Ähnlichkeiten mit GABAergen Ndnf+ neurogliaformen Zellen aufweisen37, insbesondere im Hinblick auf den langsamen zeitlichen Verlauf synaptischer Ereignisse60 und die Expression des synaptischen Proteins CPLX3, das in keinem anderen kortikalen Zelltyp exprimiert wird (ergänzende Abb. 4). Es sind weitere Arbeiten erforderlich, um die beiden Arten von Synapsen auf einheitlicher Ebene zu vergleichen.

Unsere Ergebnisse legen nahe, dass EC-6b zur räumlichen Kodierung und Gedächtnisbildung im Hippocampus beiträgt. Die akute optogenetische Stummschaltung tiefer EC-6b-Neuronen führte zu einer akuten Abnahme des SI der CA1-Pyramidenneuronen (Abb. 5a – c) mit nur minimaler Verringerung der durchschnittlichen Feuerfrequenz (ergänzende Abb. 10). Somit unterscheiden sich die Auswirkungen der optogenetischen Hemmung von denen, die nach akuter oder chronischer Manipulation von EC-Neuronen der oberflächlichen Schicht beobachtet werden, die bisher nur zu geringfügigen Veränderungen in SI6,7,8,9,10,11 geführt haben. Darüber hinaus unterscheiden sich die Auswirkungen auch von denen einer akuten optogenetischen Hemmung der CA3-CA1-Projektion, die zu einem deutlichen Rückgang der Feuerraten, aber einem Anstieg des SI in CA1-Pyramidenneuronen führt61. Es ist möglich, dass die divergente Ausgabe von Schicht-6b-Neuronen die Kohärenz der Spitzen im Hippocampus-Netzwerk beeinflusst und zur Synchronisation der Hauptneuronen im langsamen Delta- (0,5–3 Hz) und Theta-Frequenzbereich (3–8 Hz) beiträgt. Nach diesem Modell könnten ortsspezifische Feuermuster als Ergebnis einer schwachen, aber hoch orchestrierten Aktivierung von Netzwerken entstehen und stabilisiert werden, die alle Subregionen des Hippocampus umfassen. Es wurde gezeigt, dass in CA1 Plateaupotentiale, wie wir sie nach der Stimulation der EC-6b-zu-CA3-Projektion beobachtet haben, der Bildung von Ortsfeldern44,45 und neuerdings auch assoziativen Erinnerungen62 zugrunde liegen, was diese Hypothese zusätzlich stützt. Multi-Unit-Aufzeichnungen von EC-6b zeigten zuvor, dass Teilmengen von Zellen gitterartige Feuermuster aufwiesen17. Somit könnte die Verbindung der Schicht 6b mit dem Hippocampus eine Erklärung für frühere Beobachtungen liefern, dass Hippocampus-Ortsfelder vor und in Abwesenheit der EC-2-Gitterzellaktivität entstehen können8,63,64.

Um den Beitrag von EC-6b-Neuronen zur Bildung des räumlichen Gedächtnisses zu untersuchen, haben wir ein Experiment mit dem Intellicage-System entworfen, das es uns ermöglicht, gleichzeitig und unterschiedlich die Position einer Wasserbelohnung für eine Kohorte gemeinsam gehaltener Tiere in ihrem Heimkäfig zu steuern und ohne die physische Anwesenheit eines Experimentators. Dieses Design, das die Situation in einem natürlichen Lebensraum in gewisser Weise nachahmt, zeigte einen doppelten Effekt der Schicht-6b-Ablation auf das räumliche Gedächtnis: Während die Ablation die Fähigkeit beeinträchtigte, neue Belohnungsorte zu lernen, beeinträchtigte sie auch die Fähigkeit, frühere Orte zu vergessen.

Die gezielte Manipulation von EC-6b-Neuronen maximierte effizient die Anzahl der betroffenen Zellen in dieser Schicht und ermöglichte uns so die Beobachtung robuster Effekte bei einer Verhaltensaufgabe. Da die Manipulation jedoch nicht EC-spezifisch war, könnte auch die Ablation von Schicht-6b-Neuronen in anderen kortikalen Bereichen beteiligt gewesen sein. Obwohl motorische oder sensorische Defizite ausgeschlossen werden können, da sie zu einer ortsunabhängigen Abnahme der Verhaltensleistung führen würden, sind komplexere Netzwerkeffekte über die EC hinaus nicht auszuschließen. Diese könnten auf Veränderungen der Aktivität im präfrontalen Kortex zurückzuführen sein, von dem zuvor gezeigt wurde, dass er an räumlichen Aufgaben beteiligt ist, die kognitive Flexibilität erfordern65,66 (siehe aber auch Lit. 67). Da die Verhaltensaufgabe jedoch eine große räumliche Komponente hat, die wahrscheinlich die EC-Hippocampus-Achse betrifft, ist die sparsamste Erklärung, dass Neuronen der entorhinalen Schicht 6b eine entscheidende Rolle bei diesen Verhaltenseffekten spielen. Selbst in dem unwahrscheinlichen Szenario, dass die beobachteten Verhaltenseffekte nachweislich nur den präfrontalen Kortex und keine Beteiligung der Hippocampusformation erfordern, sollten unsere Ergebnisse dennoch relevant sein, da den Zellen bisher keine Verhaltens- oder kognitive Funktion zugeordnet wurde der Schicht 6b in jeder kortikalen Region.

Obwohl dieser bidirektionale Effekt paradox erscheinen mag, wurde vermutet, dass der Gedächtnisabbau ein aktiver und ebenso adaptiver mnemonischer Prozess ist wie die Gedächtniskodierung und dass eine verminderte Fähigkeit zum Vergessen ebenfalls als Gedächtnisdefizit angesehen werden sollte68. Diese Ergebnisse lassen die interessante Möglichkeit aufkommen, dass diese beiden gegensätzlichen Prozesse nicht nur miteinander zusammenhängen, sondern aus Aktivitätsmustern einer einzelnen Population von Neuronen entstehen, die in der Lage sind, Aktivitäten in Hippocampus-Schaltkreisen sowohl zu synchronisieren als auch zu desynchronisieren.

Wir kommen zu dem Schluss, dass Neuronen der entorhinalen Schicht 6b für die ordnungsgemäße Funktion des Hippocampus erwachsener Nagetiere, einschließlich räumlicher Kodierung und Gedächtnis, von zentraler Bedeutung sind. Neuronen der Schicht 6b in anderen kortikalen Regionen könnten ähnliche Funktionen haben, was auf eine allgemeine Rolle bei komplexen, gehirnweiten Netzwerkberechnungen schließen lässt. Da die Unterplattenschicht bei allen Säugetierarten hoch konserviert ist und offenbar im menschlichen Gehirn am weitesten entwickelt ist69,70,71, könnten unsere Ergebnisse möglicherweise über den Modellorganismus hinaus extrapoliert werden. Zukünftige Arbeiten werden den Beitrag von Schicht-6b-Neuronen zu höheren Schaltkreisfunktionen des menschlichen Gehirns bei Gesundheit und Krankheit identifizieren.

HEK293-GT- und BHK-eT-Zellen wurden verwendet, um RVdG-CVS-N2c-Tollwutvirusvektoren zu retten, zu pseudotypisieren und zu amplifizieren, basierend auf einem zuvor veröffentlichten Ansatz12. Kurz gesagt, HEK293-GT-Zellen, die das SAD B19-optimierte Glykoprotein und eine optimierte T7-RNA-Polymerase stabil exprimieren, wurden mit dem RVdG-CVS-N2c-Vektorplasmid zusammen mit den SADB19-Helferplasmiden pTIT-N, pTIT-P und pTIT-L unter Verwendung von Polyethylenimin transfiziert (PEI). Sobald alle Zellen in der Kultur fluoreszierend markiert waren, normalerweise 5–6 Tage nach dem Zeitpunkt der Transfektion und 1–2 Tage nach dem ersten Nachweis der Fluoreszenz, wurde das Medium geerntet, filtriert, aliquotiert und eine kleine Menge (100–200 µl) hinzugefügt ) wurde zur gleichzeitigen Pseudotypisierung und Amplifikation der Vektoren auf Schalen mit BHK-eT-Zellen übertragen, die das envA-Glykoprotein und den TVA-Rezeptor stabil exprimieren. Pseudotypisierte Vektoren wurden täglich über einen Zeitraum von drei Tagen gesammelt, beginnend am Tag 3 der Transduktion, und das Virus wurde gepoolt und 1,5 Stunden lang bei 70.000 × g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das Medium abgesaugt und das Viruspellet in 200 µl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, resuspendiert, aliquotiert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Der endgültige Titer der pseudotypisierten RVdG-CVS-N2c-Tollwutvirusvektoren wurde mithilfe der seriellen Transduktion von HEK293-TVA bestimmt und unter Verwendung einer zuvor veröffentlichten Formel72 berechnet. Eine vollständige Liste der in dieser Studie verwendeten RVdG-CVS-N2c-Plasmide finden Sie in der Ergänzungstabelle 2.

Die AAV-Produktion wurde in HEK293T-Zellen basierend auf einem zuvor veröffentlichten Protokoll73 durchgeführt. Kurz gesagt, vollständig konfluente HEK293-Zellen wurden mit einem AAV2-Vektorplasmid zusammen mit pAdenoHelper und den AAV-dj RepCap-Plasmiden unter Verwendung von PEI transfiziert. 36 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, pelletiert und unter Verwendung von drei Einfrier-Auftau-Zyklen lysiert. Die lysierten Zellen wurden 1 Stunde lang mit Benzonase-Nuklease (Sigma-Aldrich) inkubiert, dann wurden die Trümmer pelletiert und der virushaltige Überstand gesammelt und durch einen 0,22-µm-Filter geleitet. Der gesammelte Überstand wurde anschließend mit einer gleichen Menge Heparin-Agarose (Sigma-Aldrich) gemischt und über Nacht unter ständigem Rühren bei 4 °C gehalten. Am folgenden Tag wurde die Agarose-Virus-Mischung auf eine Chromatographiesäule übertragen und die Agarose absetzen gelassen. Der Überstand wurde dann mittels Schwerkraft von der Säule abgelassen und das Agarose-gebundene Virus einmal mit PBS gewaschen und dann mit PBS, ergänzt mit 0,5 M NaCl, eluiert. Das eluierte Virus wurde dann erneut filtriert, entsalzt und unter Verwendung eines 100-kDa-Zentrifugalfilters konzentriert und dann aliquotiert und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert. Eine vollständige Liste der in dieser Studie verwendeten AAV-Plasmide finden Sie in der Ergänzungstabelle 2.

Alle in dieser Studie verwendeten transgenen Mauslinien wurden zuvor charakterisiert (Ergänzungstabelle 3). In allen Experimenten wurden männliche und weibliche Mäuse abwechselnd in gleichen Mengen verwendet, und zwar in einem Alter zwischen 1 und 6 Monaten. In den Verhaltensexperimenten wurden etwas größere Wirkungen von TMP bei Frauen festgestellt, wahrscheinlich aufgrund einer stärkeren Wirkung von TMP, diese Beobachtung wurde jedoch nicht weiter verfolgt. Experimente an C57BL/6-Wildtyp- und transgenen Mäusen wurden in strikter Übereinstimmung mit institutionellen, nationalen und europäischen Richtlinien für Tierversuche durchgeführt und vom österreichischen Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft bzw. Bildung, Wissenschaft und Forschung genehmigt (A. Haslinger, Wien; BMWF-66.018/0010-WF/V/3b/2015; BMBWF-66.018/0008-WF/V/3b/2018).

Für die In-vivo-Verabreichung viraler Vektoren wurden Mäuse mit Isofluran anästhesiert, ihnen wurden 0,1 mg kg-1 Buprenorphin injiziert und sie wurden in einen stereotaktischen Rahmen gebracht, wo sie weiterhin 1–5 % in Sauerstoff verdampftes Isofluran mit einer festen Flussrate von 1 l erhielten min−1. Die Beinrückzugsreflexe wurden getestet, um die Tiefe der Anästhesie zu beurteilen. Wenn kein Reflex beobachtet wurde, wurde ein Einschnitt über die Kopfhaut gemacht, um den Schädel freizulegen. Anschließend wurde Bregma lokalisiert und seine Koordinaten als Referenz für anterior-posteriore (AP) und mediolaterale (ML) Koordinaten verwendet, während die Oberfläche der Dura an der Injektionsstelle als Referenz für dorsoventrale (DV) Koordinaten verwendet wurde. In unseren Experimenten haben wir die folgenden Sätze von AP/ML/DV-Koordinaten (in mm) verwendet: DG: −1,9/1,3/−1,9; CA3: −1,9/±2,5/−2; CA1: −1,9/1,5/−1,2; Hippocampus-INs: −1,9/1,8/−1,6; EC: −4/3,5/−3. AAV-Vektoren wurden zunächst 1:5 in PBS verdünnt und mit einer Hamilton-Spritze und einer 32G-Nadel in einem Volumen von 0,3 µl und einer Geschwindigkeit von 0,06 µl pro Minute an die Injektionsstelle abgegeben. Nachdem die Injektion abgeschlossen war, wurde die Nadel noch 1–2 Minuten an Ort und Stelle belassen, damit das Virus im Gewebe diffundieren konnte, und dann langsam zurückgezogen. Am Ende der Injektionssitzung wurde die Kopfhaut zurückgeklebt und die Mäuse wurden zur Genesung in ihren Heimkäfig zurückgebracht. Die Injektion pseudotypisierter Tollwutvirusvektoren erfolgte 2–3 Wochen nach der ersten Injektion von AAV-Vektoren, die den TVA-Rezeptor und das Tollwut-Glykoprotein enthielten. Pseudotypisierte Tollwutvektoren wurden zunächst verdünnt, um eine Endkonzentration von ~2–5 × 108 TU ml–1 zu erreichen, und dann auf die gleiche Weise wie das AAV injiziert. Mit Ausnahme der Tollwut-Injektionen in die DG von Prox1-cre oder EC von Ctgf-2A-dgCre-transgenen Tieren waren alle anderen Injektionen des Tollwutvirus um –0,2 mm AP und –0,2 mm ML verschoben. Dies geschah, um eine unspezifische Markierung entlang des Nadelkanals der ersten Injektion so weit wie möglich zu vermeiden, da die Cre-Rekombinase-Expression im KA1-cre- und DLX5/6-Flp-Transgen keine vollständige Spezifität aufweist Linien.

Elektrophysiologische Aufzeichnungen von identifizierten retrograd markierten Zellen wurden 5–7 Tage nach der Injektion von CVS-N2c-Vektoren durchgeführt. Manipulierte Tiere wurden mit einer MMF-Mischung bestehend aus Medetomidin (0,5 mg kg−1), Midazolam (5 mg kg−1) und Fentanyl (0,05 mg kg−1) anästhesiert und transkardial mit 20 ml eiskalter Dissektionslösung mit 87 mM perfundiert NaCl, 25 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM D-Glucose, 75 mM Saccharose, 0,5 mM CaCl2 und 7 mM MgCl2 (pH 7,4 in 95 % O2/5 % CO2, 325–327 mOsm). Dann wurde das Gehirn entfernt und der Hippocampus zusammen mit dem angrenzenden kortikalen Gewebe herauspräpariert und in eine vorgefertigte Form aus 4 % Agarose gelegt, die das Gewebe stabilisieren sollte. Die Form wurde in die Kammer eines VT1200-Vibratoms (Leica Microsystems) überführt und das Gewebe in Gegenwart einer eiskalten Schnittlösung quer in 350 µm dicke Scheiben geschnitten. Transversale Cortico-Hippocampus-Schnitte konnten sich etwa 30 Minuten lang bei etwa 31 °C erholen und wurden dann für die Dauer der Experimente bei Raumtemperatur (RT, 22 ± 1 °C) aufbewahrt. Während der Aufzeichnungen wurden die Schnitte mit einer Aufzeichnungslösung superfundiert, die 125 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 1,25 mM NaH2PO4, 25 mM D-Glucose, 2 mM CaCl2 und 1 mM MgCl2 (pH 7,4 in 95 % O2/5 % CO2, 316 mOsm), mit einer Geschwindigkeit von ~1 ml min−1 unter Verwendung der Schwerkraftströmung. Neuronen in den interessierenden Regionen wurden mithilfe von Pull-Patch-Pipetten gepatcht, die Folgendes enthielten: 125 mM K-Gluconat, 20 mM KCl, 0,1 mM EGTA, 10 mM Phosphokreatin, 2 mM MgCl2, 2 mM Na2ATP, 0,4 mM Na2GTP, 10 mM HEPES (pH-Wert angepasst). auf 7,28 mit KOH, ∼300 mOsm); In einer Teilmenge der Aufzeichnungen wurden 0,3 % Biocytin hinzugefügt. Die gepatchten Zellen wurden im Current-Clamp-Modus auf dem Ruhemembranpotential des Neurons gehalten. Signale von gepatchten Zellen wurden mit einem Axon Axopatch 200 A-Verstärker (Molecular Devices) erfasst und mit einem Analog-Digital-Wandler CED Power 1401 (Cambridge Electronic Design) digitalisiert. Die optogenetische Stimulation erfolgte mithilfe einer blau gefilterten weißen LED mit einer Intensität von 4,5 mW mm−2 (Prizmatix, IL), die durch ein über dem aufgezeichneten Neuron positioniertes ×63-Objektiv geleitet wurde. Für alle Aufzeichnungen wurden 2–5 Lichtimpulse von 5 ms Dauer mit einer Frequenz von 10 Hz abgegeben, mit einem Intervall von 20 s zwischen den Stimulationen. Zur Isolierung von AMPA- und NMDA-Rezeptor-vermittelten Strömen verwendeten wir eine interne CsCl-basierte Lösung bestehend aus 145 mM CsCl, 10 mM HEPES, 2 mM MgCl2, 5 mM Phosphokreatin, 2 mM Na2ATP, 0,3 mM Na2GTP und 5 mM QX-314 (pH-Wert mit KOH auf 7,28 eingestellt, ∼310 mOsm), zusammen mit den folgenden pharmakologischen Wirkstoffen: 100 µM Gabazin, 25 µM CNQX und 50 µM D-AP5, angewendet in verschiedenen Phasen der Aufzeichnung. Am Ende jeder Aufzeichnungssitzung wurde die Elektrode langsam zurückgezogen, um einen von außen nach außen gerichteten Patch zu bilden. Anschließend wurde die Scheibe aus der Aufnahmekammer entnommen, in 4 % Paraformaldehyd (PFA) getaucht und dann bis zur weiteren Verarbeitung in 0,1 M Phosphatpuffer (PB) aufbewahrt. Nachfolgende Analysen der EPSC- und Membraneigenschaften wurden mit Stimfit (Version 0.15.8; https://github.com/neurodroid/stimfit)74 durchgeführt und repräsentative Spuren wurden mit Igor Pro 6 (Wavemetrics, OR, USA) verarbeitet und visualisiert.

Zu Bildgebungszwecken wurden die Tiere 5–7 Tage nach der Injektion der RVdGenvA-CVS-N2c-Vektoren getötet. Zunächst wurden die Tiere wie im vorherigen Abschnitt beschrieben anästhesiert und transkardial mit 15 ml 0,1 M PB, gefolgt von 30 ml 4 % PFA, perfundiert. Nach der Perfusion wurde das Gehirn entnommen und über Nacht bei 4 °C in 4 % PFA aufbewahrt, das anschließend durch 0,1 M PB ersetzt wurde. Fixierte Gehirne wurden entweder in einer koronalen, parasagittalen oder transversalen Ebene 100 µm dick geschnitten und in 0,1 M PB bei 4 °C gelagert.

Für die immunhistochemische Markierung von transduziertem Gewebe wurden Standardprotokolle verwendet. Zunächst wurden die Schnitte dreimal 10 Minuten lang mit PB gewaschen. Als nächstes wurden die Schnitte mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) und 0,3 % Triton , in PB mit 5 % NGS und 0,3 % Triton X-100, bei 4 °C über Nacht. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit isotypspezifischen Sekundärantikörpern (Ziegen-Anti-Kaninchen konjugiert mit Alexa Fluor 488 oder 647) in PB, das 5 % NGS und 0,3 % Triton X-100 enthielt, 2 Stunden lang bei RT unter konstantem Rühren inkubiert. Nach erneutem Waschen wurden die Scheiben montiert, in Prolong Gold Antifade-Eindeckmittel (Thermo-Fisher Scientific, Kat.-Nr. P36930) eingebettet und mit einem 0,17-mm-Deckglas versiegelt. Für die doppelte Markierung von CPLX3 mit VGLUT1 oder VGAT wurden Meerschweinchen-Antikörper (Synaptic Systems, Kat.-Nr. 135304 bzw. 131004, 1:200) und für die Markierung von PCP4 und NeuN Kaninchen-Antikörper (Novus Biologicals, Kat.-Nr.) verwendet. NBP1-80929 bzw. NBP1-92693, 1:500). Für die Aufnahme von STED-Bildern verwendeten wir Anti-Kaninchen-Star580- und Anti-Meerschweinchen-Star635P-Sekundärantikörper (Abberior, Deutschland, 1:200).

Mit Biocytin (0,3 %) gefüllte Neuronen wurden zur morphologischen Analyse verarbeitet. Nach dem Herausziehen der Pipetten, was zur Bildung von Außenseitenflecken an den Pipettenspitzen führte, wurden die Schnitte 12–24 Stunden lang bei 4 °C in einer 0,1 M PB-Lösung mit 4 % PFA fixiert. Zur Rekonstruktion der dendritischen Morphologie wurden fixierte Schnitte etwa 2 Stunden lang mit Alexa-Fluor 647-konjugiertem Strepdavidin (Invitrogen, Kat.-Nr. S32357: 1:200) zusammen mit 5 % NGS und 0,4 % Triton X-100 behandelt, gefolgt von 3 Waschzyklen in PB. Die gefärbten Schnitte wurden dann auf einen Objektträger montiert, in Mowiol (Sigma-Aldrich) eingebettet und mit einem 0,17-mm-Deckglas versiegelt.

Eine erwachsene Wildtyp-Maus (P60) wurde durch Enthauptung eingeschläfert und ihr Gehirn schnell entfernt, 4 Stunden lang in kalter 4 %iger PFA fixiert, gefolgt von einer weiteren 24-stündigen Inkubation in einer kalten 30 %igen Saccharoselösung. Als nächstes wurde das Gehirn in eine Verbindung mit optimaler Schnitttemperatur (OCT, Tissue-Tek) eingebettet, mit Trockeneis eingefroren und mit einem Kryostat (Leica CM1950, Leica Biosystems) in 16-µm-Schnitte geschnitten. Zunächst wurden die Schnitte 15 Minuten lang mit 4 % PFA fixiert, mit PBS gewaschen und unter Verwendung eines aufsteigenden EtOH-Gradienten (25 %, 50 %, 75 % und 100 %, jeder Schritt für 5 Minuten mit anschließender Trocknung für 15 Minuten) dehydriert. . Die Scheiben wurden dann gemäß dem Protokoll des Herstellers75 (Molecular Instruments) gefärbt, wobei vor der Montage DAPI ergänzt wurde. ISH-Sonden zum Nachweis von Cplx3 und Ctgf (auch als Ccn2 bezeichnet) wurden vom Hersteller kommerziell entwickelt.

Konfokale Bilder wurden mit einem LSM 800-Mikroskop (Zeiss) aufgenommen. Eine Teilmenge der gereinigten Gewebeproben wurde mit dem konfokalen Andor Dragonfly-Spinning-Disk-Mikroskop (Andor Technologies) entnommen. Alle in diesem Manuskript dargestellten repräsentativen konfokalen Bilder werden als maximale Intensitätsprojektion eines Bildstapels aus 4–12 Einzelbildern dargestellt. Zur Abbildung von intaktem Gewebe wurde die kortikale Platte, die den Hippocampus und die angrenzende EC enthielt, aus der transduzierten Hemisphäre entfernt und anschließend mit der CUBIC-Methode gereinigt76. Sobald das Gewebe durchscheinend erschien, wurde es in eine Kammer montiert, die noch immer in die CUBIC-Lösung getaucht war, leicht gedrückt, um das Gewebe zu glätten, und mit einem Deckglas abgedeckt. Das gereinigte Gewebe wurde dann mit der CA3-Seite nach oben auf das konfokale Mikroskop übertragen, wo es über Nacht abgebildet wurde. Bei allen in diesem Manuskript verwendeten Bildern wurde ein mögliches Übersprechen zwischen den Kanälen genau überwacht und vor der Analyse der Signalüberlappung ausgeschlossen.

Die zweifarbige STED-Mikroskopie wurde mit einem kommerziellen inversen STED-Mikroskop (Abberior Instruments, Deutschland) mit gepulster Anregung und STED-Lasern durchgeführt. Zur Anregung wurden ein 561-nm- und ein 640-nm-Laser und zur stimulierten Emissionsverarmung ein 775-nm-Laser verwendet. Zur Bildaufnahme wurde ein Ölimmersionsobjektiv mit numerischer Apertur 1,4 (UPLSAPO 100XO, Olympus, Japan) verwendet. Das Fluoreszenzsignal wurde in einer konfokalen Anordnung mit einer Lochgröße von 0,6 Lufteinheiten unter Verwendung von photonenzählenden Lawinenfotodioden mit 605/50 nm- und 685/70 nm-Bandpassfiltern für die STAR 580- bzw. STAR 635P-Detektion gesammelt. Die Pulswiederholungsrate betrug 40 MHz und die Fluoreszenzdetektion erfolgte zeitgesteuert. Die für die Aufnahme zweifarbiger STED-Bilder verwendeten Bildgebungsparameter waren 15 μs Pixelverweilzeit, ~4,5 μW (561 nm) und ~3,8 μW (640 nm) Anregungslaserleistung und ~75 mW STED-Laserleistung. Die Kanäle wurden nacheinander als Linienschritte mit zweizeiligen Akkumulationen für jeden Kanal erfasst. Für 3-Farben-Bilder wurde der gleiche interessierende Bereich mit einem dritten Farbkanal mit beugungsbegrenzter Auflösung unter Verwendung eines 488-nm-Lasers mit 25 μs Verweilzeit und ~40 μW Anregungsleistung aufgezeichnet. Hier wurden eine Lochgröße von 1,0 Lufteinheiten und 2-Linien-Ansammlungen verwendet. Das Signal wurde mit einer photonenzählenden Lawinenfotodiode mit einem 525/50-nm-Bandpassfilter gesammelt. Die Pixelgröße betrug für alle Bilder 40 nm. Die Leistungswerte beziehen sich auf die Leistung an der hinteren Apertur des Objektivs. Bilder vom Hippocampus-SM wurden aus den Regionen aufgenommen, die den Projektionen des MEC entsprechen, dh der medialen Molekülschicht von DG, CA3 und CA2, der proximalen Molekülschicht von CA1 und dem distalen SM des Subiculums.

Die Quantifizierung der Zellzahlen im gereinigten Gewebepräparat sowie die Quantifizierung der Kolokalisierung in Dünnschnitten wurden mit der Imaris-Software (Oxford Instruments) durchgeführt, wobei der maximale Abstand für die Kolokalisierung auf 2 µm eingestellt war. Die Analyse der Terminalkolokalisierung für STED-Bilder wurde mit Fidschi („Fiji is just ImageJ“)77 über ein speziell geschriebenes Skript (https://github.com/sommerc/coloco3surf) durchgeführt. Hierzu wurde nach manueller Anpassung der Schwelle für jeden einzelnen Kanal eine Maske erstellt, wobei Flächen kleiner als 0,1 µm2 verworfen wurden. Die Signaldichte für jeden Kanal wurde dann als Verhältnis zwischen der Gesamtzahl der Pixel in der Maske und der Gesamtzahl der Pixel im Bild berechnet. Als nächstes wurde eine neue Maske erstellt, die nur überlappende Pixel aus den beiden Kanälen enthielt, wobei Oberflächen kleiner als 0,1 µm2 wieder verworfen und die Dichte wie für die Primärmasken beschrieben berechnet wurde.

Ctgf-2A-dgCre//Ai40-Mäusen wurde 150 mg kg−1 TMP verabreicht, um die Expression von ArchT-GFP in EC-6b-Neuronen zu fördern. 2–3 Tage nach der Cre-Induktion wurden den Tieren unter tiefer Anästhesie mit Isofluran (0,5–3 % ), Sauerstoff (1–2 l min−1) und eine Anfangsdosis Buprenorphin (0,1 mg kg−1). Die Tetroden wurden entsprechend aus vier 12-μm-Wolframdrähten (H-Formvar-Isolierung mit Butyral-Bindeschicht, California Fine Wire, Grover Beach CA) hergestellt, verdrillt und dann erhitzt, um sie zu einem einzigen Bündel zu verbinden. Anschließend wurden die Spitzen vergoldet, um ihre Elektrodenimpedanz auf 200–400 kΩ zu reduzieren. Während der Operation wurde eine Kraniotomie über dem dorsalen CA1 zentriert und die Spitze der optischen Faser in den folgenden Koordinaten implantiert: –1,9 mm AP und 1,6 mm ML vom Bregma und –1,2 mm von der Pialoberfläche. Die Spitzen der Tetroden befanden sich zunächst ca. 300 µm über der Faserspitze. Zwei oberhalb des Kleinhirns positionierte Schrauben dienten als Erdungs- und Referenzelektroden. Zwei zusätzliche Ankerschrauben aus rostfreiem Stahl wurden verwendet, um die Mikroantriebsbaugruppe dauerhaft am Schädel zu befestigen. Die mit Paraffinwachs beschichteten Elektroden und das Mikroantriebsgerät wurden dann mit Dentalacryl bestrichen, um die Elektroden-Mikroantriebsbaugruppe zu umhüllen und an den Schrauben im Schädel zu verankern. Nach einer Erholungsphase von 7 Tagen wurden die Tetroden über einen weiteren Zeitraum von 7–14 Tagen täglich in Schritten von 50–150 μm in die CA1-Region abgesenkt.

Extrazelluläre Daten wurden mit dem Intan RHD2000-Auswertungssystem und einem RHD2132-Headstage (Intan Technologies, CA, USA) zusammen mit einer erweiterten Version der Ktan-Software (https://git.ist.ac.at/alois.schloegl/ktan) erfasst. Git). Das elektrische Signal wurde mit 20 kHz abgetastet. Die Flugbahn wurde mit einer Videokamera (FL-HC0614-2M; RICOH) verfolgt, die zwei an der Bühne angebrachte LED-Leuchten aufzeichnete und mit der Positrack-Software (https://github.com/kevin-allen/positrack) aufgezeichnet wurde. Die Spike-Extraktion wurde durch Implementierung der Mountainsort-Software78 durchgeführt und eine angepasste Software wurde zur Clusterbereinigung und -verfeinerung verwendet (https://github.com/igridchyn/lfp_online). Grünes Licht für die ArchT-Aktivierung wurde von einer 535 nm grünen LED mit 2,5 mW mm−2 (Prizmatix, IL) bereitgestellt. Die Lichtquelle wurde in ein optisches Glasfaser-Patchkabel mit 0,48 NA (4,5 m lang, 0,37 NA; Doric Lenses) eingekoppelt, das das Licht an den Mikroantrieb übertrug. Die Lichtimpulse wurden durch TTL-Impulse ausgelöst, die über den Parallelanschluss des Computers gesendet wurden und die Software zur Erfassung und Echtzeit-Signaldekodierung ausführten.

Zur Datenanalyse wurde die Freilandumgebung in 15 × 15 gleich große räumliche Behälter von jeweils etwa 11,1 cm2 unterteilt. Mithilfe der Positionsverfolgung wurde eine Belegungskarte erstellt, indem die Zeit berechnet wurde, die das Tier während der Laufperioden in jedem räumlichen Behälter verbrachte (Geschwindigkeitsfilter >3 cm s−1). Dann wurde die Anzahl der Spikes, die eine Zelle in jedem räumlichen Behälter abfeuerte, gezählt (ebenfalls geschwindigkeitsgefiltert, >3 cm s−1) und durch die Belegungsdauer dividiert. Anschließend wurden die Ratenkarten mit einem Gauß-Filter mit einer Standardabweichung von 1 Bin geglättet. Um die räumliche Abstimmung von Zellen zu messen, wurde das SI-Maß berechnet79. In diese Analyse wurden nur Zellen mit einer mittleren Feuerrate zwischen 0,2 und 5 Hz einbezogen, wodurch es sich um mutmaßliche Pyramidenzellen handelte. Darüber hinaus mussten die Zellen sowohl in den ersten als auch in den letzten 15 Minuten der Aufzeichnung eine Feuerungsrate von mindestens 0,2 Hz aufweisen, um sicherzustellen, dass nur stabil aufgezeichnete Zellen einbezogen werden. Für jede Zelle wurde die Ratenkarte in vier gleich große Quadranten unterteilt. Der SI wurde für jeden Quadranten separat berechnet und der durchschnittliche SI zwischen den hellen und nicht-hellen Quadranten verglichen. Wir haben die folgende Definition verwendet:

Dabei ist λx die mittlere Feuerrate im räumlichen Bin x, λ die mittlere Feuerrate über die gesamte Umgebung und P die Belegung79.

Zur Beurteilung des Beitrags von EC-6b-Neuronen zum räumlichen Gedächtnis haben wir Ctgf-2A-dgCre- und RosaStopDTA-Mäuse gekreuzt, um eine bedingte Ablation der Subplattenschicht zu ermöglichen. Es wird angenommen, dass RosaStopDTA-Mäuse eine hochspezifische Zellablation induzieren, da Mäusen ein funktioneller Rezeptor für Diphtherietoxin fehlt und DTA die B-Untereinheit fehlt, die für die Penetration von Zellmembranen erforderlich ist80. Doppelt transgene männliche und weibliche Nachkommen im Alter von 2–5 Monaten wurden subkutan mit einem Identifikationstransponder implantiert und eine Woche später in eine Intellicage-Umgebung (TSE-Systems, Deutschland) gebracht – bis zu 8 Mäuse desselben Geschlechts gleichzeitig bei konstanter Temperatur , ein 12-stündiger Lichtzyklus und ad libitum Zugang zu Nahrungsmitteln. Nach dem Betreten des Intelligenzkäfigs durchliefen die Tiere eine 5-tägige Gewöhnungsphase, in der alle Wasseranschlüsse verfügbar waren und sie nach und nach lernten, wie sie an die Wasserflasche gelangen, nachdem sie ab dem Zeitpunkt des Nasenstichs in den Anschluss eine Verzögerung von 10 Sekunden eingelegt hatten. Anschließend wurde jedes Tier für einen Zeitraum von fünf Tagen nach dem Zufallsprinzip einem einzelnen der acht in jedem Käfig verfügbaren Wasseranschlüsse zugewiesen. Am Ende dieser anfänglichen Trainingsperiode wurden die Tiere nach dem Zufallsprinzip in die Versuchsgruppe, der 150 mg g-1 TMP ip verabreicht wurden, und eine Kontrollgruppe, der ein Vehikel injiziert wurde, aufgeteilt. Die individuelle Fehlerrate wurde als Verhältnis zwischen Nosepokes zum zugewiesenen Port und der Gesamtzahl der Nosepokes während eines 24-Stunden-Zeitraums gemessen. Mäuse, die bis zum letzten Tag der anfänglichen Lernphase keine Fehlerquote von weniger als 70 % erreichten, wurden von der Studie und allen weiteren Analysen ausgeschlossen. Unmittelbar nach dieser Manipulation wurden die Mäuse für einen Zeitraum von drei Tagen wieder in ihren Intelligenzkäfig gesetzt und mit einem anderen Wasseranschluss versehen. Nach drei solchen Rotationen, die alle aus identischen Änderungen an Ecken und Seiten bestanden, wurden die Tiere für einen weiteren Zeitraum von fünf Tagen wieder ihrem ursprünglichen Wasserhafen zugewiesen, der ihnen vor der Manipulation zugewiesen worden war. Am Ende dieses Versuchs wurden die Tiere aus dem Käfig genommen, transkardial mit PFA 4 % in PB perfundiert und die Gehirne der Versuchsgruppe zur weiteren Analyse der synaptischen CPLX3-Dichte auf 100 µm geschnitten. Abgesehen von der Verabreichung von TMP oder Vehikel wurde kein direkter oder indirekter Kontakt mit den Tieren hergestellt.

Alle Werte wurden als Mittelwert und Fehlerbalken als ± SEM angegeben. Die statistische Signifikanz wurde mit einem nichtparametrischen, einseitigen Kruskal-Wallis-Test getestet, gefolgt von einem doppelseitigen Mann-Whitney-Test für Post-hoc-Vergleiche oder mit dem exakten Fisher-Test zur Analyse von Unterschieden in den Gruppenanteilen. Mehrere Vergleiche wurden mithilfe der Holm-Bonferroni-Korrektur angepasst. Als Darstellung verwendete konfokale Bilder wurden erfolgreich für mehrere Tiere reproduziert, mit identischen Ergebnissen. Für die Analyse von Intellicage-Daten verwendeten wir einen einseitigen, nichtparametrisch ausgerichteten Rangtransformations-Dreiweg-ANOVA-Test, um die Sitzungen A, D und A*81 zu vergleichen, und einen einseitigen, nichtparametrischen Friedman-Test, um den Lernzeitverlauf zu untersuchen . Berechnungen wurden in Microsoft Excel, Python oder R (Version 4.1.0) durchgeführt. Statistische Unterschiede mit p < 0,05 wurden als signifikant angesehen. In Abbildungen geben ein einzelnes Sternchen (∗), doppelte Sternchen (**) und dreifache Sternchen (***) p < 0,05, p < 0,01 bzw. p < 0,001 an und werden im gesamten Manuskript verwendet.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Weitere Bilddatendateien sind auf begründete Anfrage beim jeweiligen Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Der folgende benutzerdefinierte Code wurde für diese Studie generiert und ist über die folgenden Links verfügbar: Coloco3surf – https://github.com/sommerc/coloco3surf. Ktan – https://git.ist.ac.at/alois.schloegl/ktan.git. Analyseroutinen sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken F. Marr und A. Schlögl für technische Unterstützung, E. Kralli-Beller für die Manuskriptbearbeitung sowie C. Sommer und der Imaging and Optics Facility des Institute of Science and Technology Austria (ISTA) für Bildanalyseskripte und Mikroskopie-Unterstützung. Wir danken J. Wallenschus und D. Rangel Guerrero für die technische Unterstützung bei der Erfassung von Einzeldaten und I. Gridchyn für die Hilfe beim Clustering von Einzeleinheiten. Abschließend danken wir auch B. Suter für die Diskussionen, A. Saunders, M. Jösch und H. Monyer für die kritische Lektüre früherer Versionen des Manuskripts, C. Petersen für die Weitergabe von Clearing-Protokollen und den Scientific Service Units des ISTA für die effiziente Unterstützung . Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (ERC Advanced Grant Nr. 692692 für PJ) und dem Fond zur Förderung der Wissenschaftlichen Forschung (Z 312-B27, Wittgenstein-Preis für PJ und) gefördert I3600-B27 für JGD und PV).

Yoav Ben-Simon

Aktuelle Adresse: Abteilung für Neurophysiologie und Pharmakologie, Medizinische Universität Wien, Wien, Österreich

Carol Kaefer

Aktuelle Adresse: Abteilung für Neuroinformatik, Radboud-Universität, Nijmegen, Niederlande

Institute of Science and Technology Austria (ISTA), Klosterneuburg, Österreich

Yoav Ben-Simon, Karola Kaefer, Philipp Velicky, Jozsef Csicsvari, Johann G. Danzl & Peter Jonas

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YB konzipierte das Projekt, entwarf und führte alle Experimente durch, YB und PV erwarben STED-Bilder, die von JGD, KK beraten wurden, und YB analysierte Einzeldaten, JC stellte Einrichtungen und Ausrüstung für Tetrodenaufzeichnungen zur Verfügung, YB analysierte die Daten, YB und PJ schrieben die Manuskript, und PJ betreute das Projekt. Alle Autoren haben das Manuskript gelesen und kommentiert.

Korrespondenz mit Yoav Ben-Simon.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ben-Simon, Y., Kaefer, K., Velicky, P. et al. Eine direkte erregende Projektion von Neuronen der entorhinalen Schicht 6b zum Hippocampus trägt zur räumlichen Kodierung und zum Gedächtnis bei. Nat Commun 13, 4826 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32559-8

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Eingegangen: 11. April 2022

Angenommen: 03. August 2022

Veröffentlicht: 16. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32559-8

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