Ein angestammtes Interaktionsmodul fördert die Oligomerisierung in divergenten mitochondrialen ATP-Synthasen

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 5989 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die mitochondriale ATP-Synthase bildet stabile Dimere, die in oligomeren Anordnungen angeordnet sind und die für eine effiziente Energieumwandlung wesentliche Krümmung der Innenmembran erzeugen. Hier berichten wir über Kryo-EM-Strukturen des intakten ATP-Synthase-Dimers aus Trypanosoma brucei in zehn verschiedenen Rotationszuständen. Das Modell besteht aus 25 Untereinheiten, darunter neun linienspezifischen, sowie 36 Lipiden. Der Rotationsmechanismus wird durch den divergenten peripheren Stiel beeinflusst, was eine größere Konformationsflexibilität verleiht. Der Protonentransfer im lumenalen Halbkanal erfolgt über eine Kette aus fünf geordneten Wassermolekülen. Die Dimerisierungsschnittstelle wird von der Untereinheit g gebildet, die für Wechselwirkungen, aber nicht für die katalytische Aktivität entscheidend ist. Obwohl die Gesamtarchitektur der Dimere zwischen Eukaryoten variiert, stellen wir fest, dass Untereinheit-g zusammen mit Untereinheit-e ein angestammtes Oligomerisierungsmotiv bildet, das zwischen der Trypanosomen- und der Säugetierlinie geteilt wird. Daher definieren unsere Daten das Untereinheit-g/e-Modul als eine Strukturkomponente, die die oligomeren ATP-Synthase-Anordnungen bestimmt.

Die mitochondriale ATP-Synthase besteht aus den löslichen F1- und membrangebundenen Fo-Subkomplexen und kommt in Dimeren vor, die sich zu Oligomeren zusammenlagern, um die Bildung von Innenmembranfalten, sogenannten Cristae, zu induzieren. Die Cristae sind die Orte für die oxidative Phosphorylierung und Energieumwandlung in eukaryotischen Zellen. Die Dissoziation von ATP-Synthase-Dimeren in Monomere führt zum Verlust der nativen Cristae-Architektur und beeinträchtigt die Mitochondrienfunktion1,2. Während die Morphologie der Cristae zwischen Organismen verschiedener Abstammungslinien erheblich variiert und von flach-lamellar bei Opisthokonten über spiralförmig röhrenförmig bei Ciliaten bis hin zu scheibenförmig bei Euglenozoen reicht3, sind die mitochondrialen ATP-Synthase-Dimere ein universelles Vorkommen, um die Membranform aufrechtzuerhalten4.

ATP-Synthase-Dimere unterschiedlicher Größe und Architektur, klassifiziert in die Typen I bis IV, wurden kürzlich durch hochauflösende Kryo-EM-Studien aufgeklärt. In der Struktur des Typ-I-ATP-Synthase-Dimers von Säugetieren sind die Monomere nur schwach assoziiert5,6 und in Hefe bilden Insertionen in die Membranuntereinheiten engere Kontakte7. Die Struktur des Typ-II-ATP-Synthase-Dimers aus der Alge Polytomella sp. zeigten, dass die Dimerschnittstelle durch stammspezifische Komponenten gebildet wird8. Das Typ-III-ATP-Synthase-Dimer aus dem Wimpertier Tetrahymena thermophila zeichnet sich durch parallele Rotationsachsen aus. An der Dimer-Grenzfläche wurden eine substöchiometrische Untereinheit sowie mehrere Lipide identifiziert, während zusätzliche Proteinkomponenten, die die Monomere miteinander verbinden, in der Matrix verteilt sind , Transmembran- und Lumenregionen9. Die Struktur der Typ-IV-ATP-Synthase mit nativen Lipiden aus Euglena gracilis zeigte auch, dass spezifische Protein-Lipid-Wechselwirkungen zur Dimerisierung beitragen und dass der zentrale und periphere Stiel direkt miteinander interagieren10. Schließlich dimerisiert eine einzigartige apikomplexe ATP-Synthase über 11 parasitenspezifische Komponenten, die zu einer vergrabenen Oberfläche von ca. 7000 Å2 beitragen11, und im Gegensatz zu allen anderen ATP-Synthasen, die sich in Reihen anordnen, assoziiert sie in höheren oligomeren Zuständen fünfeckiger Pyramiden in den gekrümmten apikalen Membranregionen . Insgesamt deuten die verfügbaren Strukturdaten auf eine Vielfalt der Oligomerisierung hin, und es bleibt unbekannt, ob gemeinsame Elemente existieren, die diese Wechselwirkungen vermitteln, oder ob die Dimerisierung der ATP-Synthase unabhängig und mehrfach in der Evolution auftrat4.

Die ATP-Synthase von Trypanosoma brucei, einem Vertreter der Kinetoplastiden und einem etablierten medizinisch wichtigen Modellorganismus, der die Schlafkrankheit verursacht, ist stark divergent, was durch den pyramidenförmigen F1-Kopf veranschaulicht wird, der eine stammesspezifische Untereinheit enthält12,13. Die Dimere reagieren empfindlich auf den Mangel an Cardiolipin14 und bilden kurze linksdrehende helikale Segmente, die sich über den Membrankamm der scheibenförmigen Cristae15 erstrecken. Einzigartig unter den aeroben Eukaryoten nutzt T. brucei im Lebenszyklusstadium von Säugetieren den umgekehrten Modus der ATP-Synthase, wobei das Enzym als Protonenpumpe verwendet wird, um das mitochondriale Membranpotential auf Kosten von ATP aufrechtzuerhalten16,17. Im Gegensatz dazu nutzen die Insektenstadien des Parasiten den ATP-produzierenden Vorwärtsmodus des Enzyms18,19.

Angesichts der Erhaltung der Kernuntereinheiten, der unterschiedlichen Art der Oligomerisierung und der Möglichkeit, Strukturhypothesen biochemisch zu testen, kamen wir zu dem Schluss, dass die Untersuchung der Struktur und Funktion der ATP-Synthase von T. brucei das fehlende evolutionäre Bindeglied liefern würde, um zu verstehen, wie die Monomere bei der Bildung interagieren physiologische Dimere.

Hier gehen wir dieser Frage nach, indem wir strukturelle, funktionelle und evolutionäre Analysen des ATP-Synthase-Dimers von T. brucei kombinieren.

Wir haben ATP-Synthase-Dimere aus kultivierten prozyklischen Trypomastigoten von T. brucei durch Affinitätschromatographie mit einem rekombinanten natürlichen Proteininhibitor TbIF120 gereinigt und die Probe einer Kryo-EM-Analyse unterzogen (Ergänzende Abbildungen 1 und 2). Mithilfe maskierter Verfeinerungen wurden Karten für die Membranregion, den Rotor und den peripheren Stiel erstellt. Um den Konformationsraum der ATP-Synthase von T. brucei zu beschreiben, haben wir zehn verschiedene rotierende Subzustände aufgelöst und auf eine Auflösung von 3,5–4,3 Å verfeinert. Schließlich wurden Partikel mit beiden Monomeren im Rotationszustand 1 ausgewählt und die Konsensstruktur des Dimers auf eine Auflösung von 3, 2 Å verfeinert (Ergänzungstabelle 1, Ergänzende Abbildungen 2 und 3).

Im Gegensatz zur Weitwinkelarchitektur von Dimeren in Tieren und Pilzen weist die ATP-Synthase von T. brucei einen Winkel von 60° zwischen den beiden F1/c-Ring-Subkomplexen auf. Das Modell der ATP-Synthase von T. brucei umfasst alle 25 verschiedenen Untereinheiten, von denen neun linienspezifisch sind (Abb. 1a, ergänzende Abbildung 4 und ergänzender Film 1). Wir haben die Untereinheiten gemäß der zuvor vorgeschlagenen Nomenklatur 21, 22, 23 benannt (Ergänzungstabelle 2). Darüber hinaus haben wir 36 gebundene Phospholipide identifiziert und modelliert, darunter 24 Cardiolipine (ergänzende Abbildung 5). Beide während der Reinigung verwendeten Detergenzien, N-Dodecyl-β-D-Maltosid (β-DDM) und Glykodiosgenin (GDN), werden auch in der Peripherie der Membranregion aufgelöst (ergänzende Abbildung 6).

a Vorder- und Seitenansicht des zusammengesetzten Modells mit beiden Monomeren im Rotationszustand 1. Die beiden F1/c10-Ringkomplexe, jeweils ergänzt durch drei Kopien der stammspezifischen p18-Untereinheit, sind in einem 60°-Winkel miteinander verbunden. Die membrangebundene Fo-Region weist eine einzigartige Architektur auf und besteht sowohl aus konservierten als auch stammspezifischen Untereinheiten. b Seitenansicht der Fo-Region, die die lumenale Wechselwirkung des zehnsträngigen β-Fass des C-Rings (grau) mit ATPTB12 (hellblau) zeigt. Angezeigt ist die mit Lipiden gefüllte periphere Fo-Höhle. c Nahaufnahme der gebundenen Lipide in der peripheren Fo-Höhle mit dargestellter Kryo-EM-Dichte. d Draufsicht in den dekameren C-Ring mit einem gebundenen Pyrimidin-Ribonukleosidtriphosphat, das als UTP zugeordnet, aber experimentell nicht nachgewiesen wurde. Kartendichte in transparentem Blau dargestellt, interagierende Reste dargestellt.

In der katalytischen Region wird F1 durch drei Kopien der Untereinheit p18 ergänzt, die jeweils an die Untereinheit α12,13 gebunden sind. Unsere Struktur zeigt, dass p18 an der ungewöhnlichen Bindung von F1 an den peripheren Stiel beteiligt ist. Die Membranregion umfasst acht konservierte Fo-Untereinheiten (b, d, f, 8, i/j, k, e und g), die um die zentrale Protonentranslokator-Untereinheit a angeordnet sind. Wir haben diese Untereinheiten anhand der strukturellen Ähnlichkeit und der passenden Topologie zu ihren Hefe-Gegenstücken identifiziert (Abb. 2). Für Untereinheit-b überlagert sich eine einzelne Transmembranhelix gut mit bH1 aus Hefe und verankert die Untereinheiten-e und -g am Fo (Abb. 2a, b). In Hefe und Rindern sind die ATP-Synthasen bH1 und die Transmembranhelices der Untereinheiten e und g auf die gleiche Weise wie in unserer Struktur angeordnet und tragen zu einem charakteristischen Keil in der Membrandomäne bei5. Die lange Helix bH2, die bei anderen Organismen den zentralen Teil des peripheren Stiels darstellt, fehlt bei T. brucei (Abb. 2c). In unserer Struktur wird keine alternative Untereinheit b24 gefunden.

a Draufsicht auf die Membranregion mit T. brucei-Untereinheiten (farbig) überlagert mit S. cerevisiae-Struktur (grau transparent). Eine enge strukturelle Überlagerung und passende Topologie ermöglichten die Zuordnung konservierter Untereinheiten basierend auf passender Topologie und Position. b Die Überlagerung der Untereinheiten-b, -e und -g mit ihren S. cerevisiae-Gegenstücken PDB 6B2Z (S. cerevisiae mitochondriale ATP-Synthase) bestätigt ihre Identität. c Schematische Darstellung der Transmembranhelices von Untereinheit-b und angrenzenden Untereinheiten in T. brucei, E. gracilis PDB 6TDV (E. gracilis mitochondriale ATP-Synthase, Membranregion)10 und S. cerevisiae PDB 6B2Z (S. cerevisiae mitochondriale ATP-Synthase)7 ATP-Synthasen. PC – Phosphatidylcholin.

Die Membranregion enthält einen peripheren Subkomplex, der hauptsächlich aus den stammspezifischen ATPTB1,6,12 und ATPEG3 besteht (Abb. 1b). Es ist vom konservierten Kern durch einen membraneigenen Hohlraum getrennt, in dem neun gebundene Cardiolipine aufgelöst werden (Abb. 1c), und der C-Terminus von ATPTB12 interagiert mit dem lumenalen β-Zylinder des c10-Rings. Das β-Fass, über das zuvor auch in der ATP-Synthase von E. gracilis10 berichtet wurde, erstreckt sich vom c10-Ring etwa 15 Å bis zum Lumen (Abb. 1a und ergänzende Abb. 7). Der Hohlraum des dekameren C-Rings enthält eine Dichte, die mit ungeordneten Lipiden übereinstimmt, wie sie in anderen ATP-Synthasen beobachtet wurden5,6,7, und zusätzlich koordinieren in der Nähe der Matrixseite 10 Arg66c-Reste eine Ligandendichte, die mit einem Pyrimidin-Ribonukleosidtriphosphat übereinstimmt (Abb. 1d). Wir ordnen diese Dichte als Uridintriphosphat (UTP) zu, da es im mitochondrialen RNA-Metabolismus afrikanischer Trypanosomen einen großen Bedarf als Substrat für die posttranskriptionelle RNA-Bearbeitung25 und die Hinzufügung von Polyuridinschwänzen zu gRNAs und rRNAs26,27 hat sowie aufgrund der geringen Häufigkeit von Cytidintriphosphat (CTP)28. Die Nukleotidbase wird zwischen zwei Arg82c-Resten eingefügt, während die Triphosphatregion durch weitere fünf Arg82c-Reste koordiniert wird, wobei Tyr79δ und Asn76δ für asymmetrische Koordinationskontakte sorgen. Das Vorhandensein eines Nukleotids innerhalb des C-Rings ist angesichts der jüngsten Berichte über Phospholipide innerhalb der C-Ringe bei Säugetieren5,6 und Ciliaten9 überraschend, was darauf hindeutet, dass eine Reihe verschiedener Liganden für das Strukturgerüst sorgen können.

Der trypanosomale periphere Stiel weist im Vergleich zu seinen Hefe- und Säugetier-Gegenstücken eine deutlich andere Architektur auf. In den Opisthokont-Komplexen ist der periphere Stiel um das lange bH2 herum organisiert, das sich von der Membran etwa 15 nm in die Matrix hinein erstreckt und an der Spitze von F15,7 an OSCP anhaftet. Im Gegensatz dazu fehlt T. brucei das kanonische bH2 und stattdessen binden die Helices 5–7 der divergenten Untereinheit-d und die C-terminale Helix der erweiterten Untereinheit-8 an eine C-terminale Verlängerung von OSCP am apikalen Teil des peripheren Stiels (Abb. 3a). Die Wechselwirkung zwischen OSCP und den Untereinheiten d und -8 wird durch lösliches ATPTB3 und ATPTB4 stabilisiert. Der periphere Stiel ist durch eine Transmembranhelix der Untereinheit 8 mit dem Membranunterkomplex verwurzelt, die auf der Matrixseite von den Helices 8–11 der Untereinheit d umwickelt ist. Abgesehen von den kanonischen Kontakten an der Spitze von F1 ist der periphere Stiel über eine Euglenozoen-spezifische C-terminale Verlängerung von OSCP mit F1 verbunden, die einen ungeordneten Linker und eine terminale Helix-Haarnadel enthält, die sich zwischen dem F1-gebundenen p18 und den Untereinheiten erstreckt -d und -8 des peripheren Stiels (Abb. 3a und Zusatzfilme 2, 3). Eine weitere Wechselwirkung von F1 mit dem peripheren Stiel findet zwischen den gestapelten C-terminalen Helices der Untereinheit β und -d statt (Abb. 3b), wobei letztere strukturell zu F1 gehört und über einen flexiblen Linker mit dem peripheren Stiel verbunden ist.

Eine N-terminale OSCP-Verlängerung sorgt für eine permanente zentrale Stielbefestigung, während die C-terminale Verlängerung eine stammspezifische Befestigung am divergenten peripheren Stiel ermöglicht. b Die C-terminalen Helices der Untereinheiten -β und -d sorgen für eine permanente F1-Anbindung. c Unterschritte des C-Rings während des Übergangs vom Rotationszustand 1 zu 2. d F1-Bewegungsanpassungsschritte, gezeigt in (c). Nachdem er zusammen mit dem Rotor in den Zustand 1e vorgerückt ist, dreht sich der F1 beim Übergang in den Zustand 2a in die entgegengesetzte Richtung. e Kippbewegung von F1 und anpassende Biegung des peripheren Stiels.

Um zu beurteilen, ob die ungewöhnliche Architektur des peripheren Stiels den Rotationsmechanismus beeinflusst, haben wir 10 Klassen analysiert, die unterschiedliche Rotationszustände repräsentieren. Die drei Hauptzustände (1–3) resultieren aus drei ~120°-Rotationsschritten des Rotors relativ zum statischen Fo. In allen Klassen liegt F1 in einer ähnlichen Konformation vor, die der katalytischen Verweildauer entspricht, die zuvor auch in der Kristallstruktur der F1-ATPase von T. brucei beobachtet wurde13. Entsprechend der Drehung des zentralen Stiels um etwa 120° unterscheiden sich die Konformationen und die Nukleotidbelegung der katalytischen Schnittstellen der einzelnen αβ-Dimere zwischen den Hauptzuständen und zeigen ADP und ATP in den „lockeren“ bzw. „festen“ geschlossenen Konformationen und eine leere Nukleotidbindungsstelle in der „offenen“ Konformation. Wir identifizierten fünf (1a–1e), vier (2a–2d) und eine (3) Klassen der jeweiligen Hauptstaaten. Die Rotorpositionen der Rotationszustände 1a, 2a und 3 stehen in Schritten von 117°, 136° bzw. 107° in Beziehung. Über alle identifizierten Teilschritte des Rotationszustands 1 (Klassen 1a bis 1e) dreht sich der Rotor um ~33°, was ungefähr dem Vorrücken um eine Untereinheit-c des c10-Rings entspricht (Abb. 3c). Während er sich mit dem Rotor dreht, hinkt das F1-Kopfstück hinterher und bewegt sich nur um ca. 13° vor. Beim folgenden Übergang von 1e zu 2a bewegt sich der Rotor um ~84° vor, während sich das F1-Kopfstück um ~22° in die entgegengesetzte Richtung dreht (Abb. 3d). Dadurch entsteht ein gegenläufiges Drehmoment zwischen den beiden Motoren, was einem Krafthubmechanismus entspricht. Dieses gegenläufige Drehmoment kann bei allen drei Hauptdrehzustandsübergängen auftreten. Es wurde jedoch nur im Hauptzustand 1 beobachtet, da es in mehr Unterschritten als in den verbleibenden beiden Zuständen eingefangen wurde, vermutlich als Folge der Symmetriefehlanpassung zwischen dem dekameren c-Ring und dem α3β3-Hexamer29. Innerhalb der vier Klassen des Zustands 2 bewegt sich der Rotor um 23° weiter und F1 kehrt in die Nähe seiner in Klasse 1a beobachteten Position zurück, wo er auch in der einzigen beobachteten Klasse des Zustands 3 zu finden ist. Dies ist jedoch mit kleinen Unterschieden in der Schrittweite der Fall Der Mechanismus steht im Einklang mit einer früheren Beobachtung in der ATP-Synthase von Polytomella8. Aufgrund seines großen, starren peripheren Stiels zeigt die ATP-Synthase von Polytomella jedoch hauptsächlich Rotationsunterschritte, während das Trypanosoma F1 auch eine Kippbewegung von ~ 8 ° zeigt, die durch die Rotationszustände 1a und 1b sichtbar wird (Abb. 3e und Zusatzfilm 2). Die zuvor berichtete Gelenkbewegung zwischen den N- und C-terminalen Domänen von OSCP8 ist in unseren Strukturen nicht zu finden, stattdessen werden die Konformationsänderungen des F1/c10-Ring-Subkomplexes durch eine 5°-Biegung des apikalen Teils der Peripherie berücksichtigt Stengel. (Abb. 3e und Zusatzfilme 2, 3). Zusammengenommen deuten die Strukturdaten darauf hin, dass die divergente periphere Stielanbindung der ATP-Synthase von T. brucei eine größere Konformationsflexibilität verleiht.

Der Mechanismus der Protonentranslokation umfasst die sequentielle Protonierung von E102 der Untereinheiten c, die Rotation des c10-Rings, wobei neutralisiertes E102c der Phospholipiddoppelschicht ausgesetzt wird, und die Freisetzung von Protonen auf der anderen Seite der Membran. Die Stellen der Protonenbindung und -freisetzung sind durch das konservierte R146 getrennt, das von der horizontalen Helix H5 der Untereinheit a bereitgestellt wird, und sind über wässrige Halbkanäle vom Cristae-Lumen und der Mitochondrienmatrix aus zugänglich (Abb. 4a). Zusammen koordinieren R146 und das benachbarte N209 ein Paar Wassermoleküle zwischen den Helices H5 und H6 (Abb. 4b). Eine ähnliche Koordination wurde in der Polytomella-ATP-Synthase8 beobachtet. Die Koordination von Wasser beschränkt R146 wahrscheinlich auf Rotamere, die sich in Richtung des C-Rings erstrecken, mit dem es vermutlich interagiert.

eine Untereinheit-a (grün) mit den Matrix- (orange) und lumenalen (hellblauen) Kanälen und einem geordneten Phosphatidylcholin (PC1; blau). E102 des c10-Rings in grau dargestellt. b Nahaufnahme der hochkonservierten R146a und N209a, die zwei Wassermoleküle zwischen den Helices H5-6a koordinieren. c Seitenansicht des Lumenkanals mit Protonenweg (hellblau) und begrenzendem Phosphatidylcholin (blau). d Kette geordneter Wassermoleküle im Lumenkanal. Die Abstände zwischen W1–W5 (rot) betragen 5,2, 3,9, 7,3 bzw. 4,8 Å. e Das geordnete Wasser erstreckt sich bis H155a, was wahrscheinlich die Übertragung von Protonen auf D202a vermittelt.

In unserer Struktur ist der lumenale Halbkanal, der eine lokale Auflösung von 2,55 Å aufweist (ergänzende Abbildung 3), mit einem Netzwerk aufgelöster Wasserdichten gefüllt und endet in einer Kette aus fünf geordneten Wassermolekülen (W1–W5; Abb . 4c–e). Das Vorhandensein geordneter Wassermoleküle im wässrigen Kanal steht im Einklang mit einem Grotthuss-Mechanismus für den Protonentransfer, der keine Diffusion von Wassermolekülen über große Entfernungen erfordern würde5. Da jedoch einige Abstände zwischen den beobachteten Wassermolekülen zu groß für eine direkte Wasserstoffbrückenbindung sind, kann der Protonentransfer sowohl koordinierte als auch ungeordnete Wassermoleküle umfassen. Der Abstand von 7 Å zwischen dem zuletzt gelösten Wasser (W1) und D202a, dem konservierten Rest, von dem angenommen wird, dass er Protonen auf den C-Ring überträgt, ist für einen direkten Protonentransfer zu lang. Stattdessen kann es über die angrenzende H155a erfolgen. Daher löst unsere Struktur einzelne Elemente auf, die am Protonentransport beteiligt sind (Abb. 4d, e).

Der lumenale Protonenhalbkanal in der ATP-Synthase von Säugetieren5,6 und Apicomplexan11 ist vom Transmembranteil von bH2 ausgekleidet, der in T. brucei fehlt. Stattdessen ist die Position von bH2 in unserer Struktur durch ein vollständig geordnetes Phosphatidylcholin besetzt (PC1; Abb. 4a, c). Daher ersetzt ein gebundenes Lipid ein proteinhaltiges Element im Protonenweg.

Obwohl das ATP-Synthase-Dimer von T. brucei über einen Satz konservierter Fo-Untereinheiten verfügt, weist es im Vergleich zu zuvor ermittelten Strukturen eine deutlich andere Dimer-Architektur auf. Erstens ist seine Dimerisierungsschnittstelle mit 3600 Å2 kleiner als die der ATP-Synthasen von E. gracilis Typ IV (10.000 Å2) und T. thermophila Typ III (16.000 Å2). Zweitens sind die Monomere in unserer Struktur im Gegensatz zur ATP-Synthase von Säugetieren und Pilzen, bei denen sich die peripheren Stängel in der durch die beiden Drehachsen definierten Ebene erstrecken, so gedreht, dass die peripheren Stängel seitlich auf den gegenüberliegenden Seiten der Ebene versetzt sind. Aufgrund der gedrehten Monomere ist diese Architektur mit einer spezifischen Dimerisierungsschnittstelle verbunden, an der zwei Kopien der Untereinheit g homotypisch auf der C2-Symmetrieachse interagieren (Abb. 5a und Zusatzfilm 1). Beide Kopien von H1-2g erstrecken sich horizontal entlang der Matrixseite der Membran und klemmen sich gegenseitig fest (Abb. 5c, e). Dies erleichtert die Bildung von Kontakten zwischen einer assoziierten Transmembranhelix der Untereinheit e mit dem benachbarten Monomer über die Untereinheit a' in der Membran und -f' im Lumen und trägt so weiter zur Grenzfläche bei (Abb. 5b). Somit wird das ATP-Synthase-Dimer über das Untereinheit-e/g-Modul zusammengesetzt. Der C-terminale Teil der Untereinheit-e-Helix erstreckt sich in das Lumen, in Richtung des zehnsträngigen β-Zylinders des C-Rings (ergänzende Abbildung 7a). Die terminalen 23 Reste sind ungeordnet und weisen eine schlecht aufgelöste Dichte auf, die mit dem Detergenspfropfen des C-Ring-β-Zylinders verbunden ist (ergänzende Abbildung 7b). Dies ähnelt dem lumenalen C-Terminus der Untereinheit-e in der Rinderstruktur5, was auf eine konservierte Wechselwirkung mit dem C-Ring hinweist. Bei Säugetieren wurde ein Mechanismus vorgeschlagen, bei dem das Zurückziehen der Untereinheit e bei Kalziumexposition den Lipidpfropfen herauszieht und die Zerlegung des C-Rings induziert, was die Öffnung der Permeabilitätsübergangspore (PTP) auslöst6.

a Seitenansicht mit farbigen dimerisierenden Untereinheiten. Die Dimerschnittstelle besteht aus b-Untereinheit-e', die Untereinheit-a in der Membran und Untereinheit-f im Lumen kontaktiert, wobei c-Untereinheiten e und g aus beiden Monomeren einen Unterkomplex mit gebundenen Lipiden bilden. d Untereinheit-g und -e bilden ein Dimerisierungsmotiv im trypanosomalen (Typ-IV) ATP-Synthase-Dimer (diese Studie), das gleiche Strukturelement bildet das Oligomerisierungsmotiv im Schweine-ATP-Synthase-Tetramer. Die strukturelle Ähnlichkeit des Pseudo-Dimers (dh zwei diagonale Monomere aus benachbarten Dimeren) in der Schweinestruktur mit dem trypanosomalen Dimer legt nahe, dass sich ATP-Synthase-Dimere vom Typ I und IV durch Divergenz von einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben. e Die dimeren Untereinheit-e/g-Strukturen sind in Sus scrofa PDB 6ZNA (S. scrofa mitochondriale ATP-Synthase) und T. brucei (diese Arbeit) konserviert und enthalten ein konserviertes GXXXG-Motiv (orange), das die Interaktion von Transmembranhelices vermittelt. f Modelle der ATP-Synthase-Dimere, eingepasst in Subtomogramm-Durchschnitte kurzer Oligomere15: Matrixansicht, links; Schnitt, Mitte, Lumenansicht, rechts; EMD-3560 (In-situ-Struktur der mitochondrialen ATP-Synthase von T. brucei).

Das e/g-Modul wird durch vier gebundene Cardiolipine im Matrixsegel zusammengehalten und verankert es in der verbleibenden Fo-Region (Abb. 5c). Die Kopfgruppen der Lipide werden durch polare und geladene Reste koordiniert, wobei ihre Acylketten einen zentralen Hohlraum im Membranbereich an der Dimer-Grenzfläche füllen (Abb. 5c und ergänzende Abb. 5f). Es wurde bereits berichtet, dass die Cardiolipin-Bindung für die Dimerisierung in sekundären Transportern zwingend erforderlich ist30 und die Erschöpfung der Cardiolipin-Synthase führte zu verringerten ATP-Synthase-Spiegeln in den Trypanosomen des Blutkreislaufs14.

Interessanterweise deuteten frühe blaue native Gelelektrophorese31 und Subtomogramm-Mittelungsstudien2 für Hefen darauf hin, dass die Untereinheit g potenziell Dimer-vermittelnd sein könnte, allerdings befinden sich die e/g-Module seitlich gegenüberliegend auf beiden Seiten der Dimer-Längsachse in der Peripherie des Komplexes. ~8,5 nm voneinander entfernt. Da die e/g-Module nicht direkt innerhalb des Hefe-ATP-Synthase-Dimers interagieren, wurde vorgeschlagen, dass sie als membranbiegende Elemente dienen, während die Hauptkontakte des Dimers durch die Untereinheiten a und -i/j7 gebildet werden. Bei Säugetieren nimmt das e/g-Modul die gleiche Position ein wie bei Hefen und bildet die Wechselwirkung zwischen zwei diagonalen Monomeren in einem Tetramer5,6,32 sowie zwischen parallelen Dimeren33. Der Vergleich mit unserer Struktur zeigt, dass die Gesamtorganisation des intradimeren trypanosomalen und interdimeren Säugetier-E/G-Moduls strukturell ähnlich ist (Abb. 5d). Darüber hinaus teilen kinetoplastide Parasiten und Säugetiere konservierte GXXXG-Motive in den Untereinheiten e34 und -g (ergänzende Abbildung 8), die eine enge Wechselwirkung ihrer Transmembranhelices ermöglichen (Abb. 5e), was einen weiteren Beweis für die Homologie der Untereinheiten liefert. Während die ATP-Synthase-Dimere von Säugetieren jedoch senkrecht zur Längsachse ihrer Reihen am Rand der Cristae angeordnet sind35, sind die T. brucei-Dimere an den Rändern scheibenförmiger Cristae um etwa 45° zur Reihenachse geneigt15. Daher nimmt das e/g-Modul in den Reihen beider evolutionär entfernter Gruppen gleichwertige Positionen ein (Abb. 5f und Lit. 33).

Um strukturelle Erkenntnisse zu validieren, haben wir jede einzelne Fo-Untereinheit durch induzierbare RNA-Interferenz (RNAi) ausgeschaltet. Alle Ziel-mRNAs sanken nach zwei und vier Tagen Induktion auf 5–20 % ihrer ursprünglichen Werte (Abb. 6a und ergänzende Abb. 9a). Die Western-Blot-Analyse von durch denaturierende Elektrophorese aufgelösten Ganzzelllysaten ergab verringerte Spiegel der Fo-Untereinheiten ATPB1 und -d, was darauf hindeutet, dass die Integrität der Fo-Einheit vom Vorhandensein anderer Fo-Untereinheiten abhängt (Abb. 6c, d). Das Immunblotting von mitochondrialen Komplexen, die durch blaue native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (BN-PAGE) mit Antikörpern gegen F1- und Fo-Untereinheiten aufgelöst wurden, zeigte eine starke Abnahme oder einen nahezu vollständigen Verlust dimerer und monomerer Formen von ATP-Synthasen vier Tage nach der Induktion von RNAi der meisten Untereinheiten (b , e, f, i/j, k, 8, ATPTB3, ATPTB4, ATPTB6, ATPTB11, ATPTB12, ATPEG3 und ATPEG4), was eine erhöhte Instabilität des Enzyms oder Defekte in seinem Aufbau dokumentiert. Die durch BN-PAGE beobachtete gleichzeitige Akkumulation in F1-ATPase zeigte, dass die katalytische Einheit nach der Zerstörung des peripheren Stiels oder des Membranunterkomplexes intakt bleibt (Abb. 6b – d und ergänzende Abb. 9b).

a Wachstumskurven von nicht-induzierten (durchgezogene Linien) und Tetracyclin-induzierten (gestrichelten Linien) RNAi-Zelllinien, die in Gegenwart (schwarz) oder Abwesenheit (braun) von Glucose gezüchtet wurden. Die Einschübe zeigen relative Spiegel der jeweiligen Ziel-mRNA an den angegebenen Tagen nach der Induktion (DPI), normalisiert auf die Spiegel von 18S-rRNA (schwarze Balken) oder β-Tubulin (weiße Balken). b Immunoblots von mitochondrialen Lysaten der angegebenen RNAi-Zelllinien, aufgelöst durch BN-PAGE, sondiert mit Antikörpern gegen die angegebenen ATP-Synthase-Untereinheiten (n = 2). Die Positionen der Molekulargewichtsmarker (MW) werden angezeigt. c Immunblots ganzer Zelllysate der angegebenen RNAi-Zelllinien, sondiert mit den angegebenen Antikörpern (n = 3). Die Positionen der MW-Marker werden angezeigt. d Quantifizierung von drei unabhängigen Replikaten von Immunoblots in (c). Die Werte wurden auf das Signal der Beladungskontrolle Hsp70 und auf nicht induzierte Zellen normiert. Diagramme zeigen Einzelwerte, Mittelwerte und Standardabweichungen (SD; Fehlerbalken).

Im Gegensatz zu den anderen angestrebten Fo-Untereinheiten führte die Herunterregulierung der Untereinheit g mit RNAi zu einem spezifischen Verlust dimerer Komplexe mit gleichzeitiger Akkumulation von Monomeren (Abb. 6b), was darauf hindeutet, dass sie für die Dimerisierung, nicht jedoch für den Zusammenbau erforderlich sind Stabilität der monomeren F1Fo-ATP-Synthase-Einheiten. Transmissionselektronenmikroskopie dünner Zellschnitte ergab, dass die ATP-Synthase-Monomerisierung in der Untereinheit-gRNAi-Zelllinie den gleichen Effekt auf die mitochondriale Ultrastruktur hatte wie ein nahezu vollständiger Verlust von Monomeren und Dimeren beim Abbau der Untereinheit 8. Beide Zelllinien zeigten eine verringerte Cristae-Anzahl und eine abweichende Cristae-Morphologie (Abb. 7a, b), einschließlich des Auftretens runder Formen, die an Strukturen erinnern, die bei der Deletion der Untereinheit g oder -e in Saccharomyces cerevisiae1 entdeckt wurden. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Monomerisierung verhindert, dass sich die trypanosomale ATP-Synthase zu kurzen helikalen Reihen an den Rändern der scheibenförmigen Cristae anordnet15, wie es für eine beeinträchtigte Oligomerisierung bei Gegenstücken aus anderen Eukaryoten berichtet wurde2,36.

a Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen von Abschnitten nicht-induzierter oder 4-Tage-induzierter RNAi-Zelllinien. In jeder Kategorie wurden mindestens 70 mikroskopische Aufnahmen gemacht. Mitochondriale Membranen und Cristae sind mit blauen bzw. roten Pfeilspitzen markiert. Das obere Feld zeigt Beispiele für unregelmäßige, längliche und runde Querschnitte von Mitochondrien, die in (b) quantifiziert wurden. Maßstabsbalken: 500 nm. b Cristae-Zahlen pro Vesikel aus angegebenen induzierten (IND) oder nicht induzierten (NON) Zelllinien, getrennt gezählt im unregelmäßigen, länglichen und runden Mitochondrienquerschnitt. Kästchen und Whiskers zeigen jeweils das 25. bis 75. und das 5. bis 95. Perzentil. Für jeden Datenpunkt wird die Anzahl der analysierten Querschnitte angegeben. Ungepaarter zweiseitiger t-Test, p-Werte werden in der Grafik angezeigt. c Mitochondriale Membranpolarisationskapazität von nicht-induzierten oder RNAi-induzierten Zelllinien zwei und vier DPI, gemessen mit Safranine O. Schwarzer und grauer Pfeil zeigen die Zugabe von ATP bzw. Oligomycin an. d ATP-Produktion in permeabilisierten nicht-induzierten (0) oder RNAi-induzierten Zellen 2 und 4 DPI in Gegenwart der angegebenen Substrate und Inhibitoren. Die Diagramme zeigen individuelle Werte von zwei technischen Replikaten von n = 2 (Untereinheit-8), n = 3 (ATPTB4) oder n = 4 (Untereinheit-g) unabhängigen Experimenten sowie Mittelwerte (Balken) und SD (Fehlerbalken) der gemittelte Werte der technischen Replikate. Gly3P DL-Glycerinphosphat; KCN Kaliumcyanid; CATR-Carboxyatractylosid.

Trotz der veränderten mitochondrialen Ultrastruktur zeigten die Untereinheiten-gRNAi-Zellen nur einen sehr milden Wachstumsphänotyp, im Gegensatz zu allen anderen RNAi-Zelllinien, die vom dritten bis vierten Tag nach der RNAi-Induktion ein stetig verlangsamtes Wachstum zeigten (Abb. 7a und ergänzende Abb. 9a). ). Dies steht im Einklang mit den Wachstumsdefekten, die nach der Ablation der Fo-Untereinheit ATPTB119 und der F1-Untereinheiten α und p1812 beobachtet wurden. Somit hatte die Monomerisierung der ATP-Synthase bei der Ablation der Untereinheit g nur einen vernachlässigbaren Einfluss auf die Fitness von Trypanosomen, die in glukosereichem Medium kultiviert wurden, in dem die ATP-Produktion durch Phosphorylierung auf Substratebene die beeinträchtigte oxidative Phosphorylierung teilweise kompensiert.

Die Messung der Oligomycin-empfindlichen ATP-abhängigen mitochondrialen Membranpolarisation mittels Safranin-O-Assay in permeabilisierten Zellen zeigte, dass die Protonenpumpaktivität der ATP-Synthase in den induzierten Untereinheit-gRNAi-Zellen vernachlässigbar beeinträchtigt wird, was zeigt, dass das monomerisierte Enzym katalytisch funktionsfähig ist. Im Gegensatz dazu führte die RNAi-Herunterregulierung der Untereinheit 8, ATPTB4 und ATPTB11 sowie ATPTB1 zu einem starken Rückgang der Polarisationskapazität der Mitochondrienmembran, was mit dem Verlust sowohl der monomeren als auch der dimeren ATP-Synthase-Formen übereinstimmt (Abb. 7c). Dementsprechend führte der Abbau derselben Untereinheiten dazu, dass ATP nicht durch oxidative Phosphorylierung produziert werden konnte (Abb. 7d). Allerdings wurde die ATP-Produktion durch die Ablation der Untereinheit g nur teilweise beeinträchtigt, was bestätigt, dass die monomerisierte ATP-Synthase katalytisch aktiv bleibt. Der etwa 50-prozentige Rückgang der ATP-Produktion von Untereinheit-gRNAi-Zellen kann auf die verringerte Effizienz der oxidativen Phosphorylierung aufgrund der beeinträchtigten Cristae-Morphologie zurückgeführt werden. Wenn Zellen in Abwesenheit von Glucose kultiviert wurden, was die Notwendigkeit einer oxidativen Phosphorylierung verstärkt, führt der Abbau der Untereinheit g zu einem Wachstumsstopp, wenn auch ein bis zwei Tage später als der Abbau aller anderen getesteten Untereinheiten (Abb. 6a). Die Daten zeigen, dass die Dimerisierung entscheidend ist, wenn die oxidative Phosphorylierung die vorherrschende ATP-Quelle ist.

Unsere Struktur des mitochondrialen ATP-Synthase-Dimers des Säugetierparasiten T. brucei bietet neue Einblicke in den Mechanismus der Membranformung, der Rotationskatalyse und des Protonentransfers. Wenn man bedenkt, dass Trypanosomen zu einer evolutionär divergierenden Gruppe der Kinetoplastida gehören, weist das ATP-Synthase-Dimer mehrere interessante Merkmale auf, die sich von anderen Dimerstrukturen unterscheiden. Die Untereinheit b, die in bakteriellen und anderen mitochondrialen ATP-Synthasen vom F-Typ vorkommt, scheint stark auf eine einzelne Transmembranhelix bH1 reduziert zu sein. Das lange bH2, das bei anderen Organismen den zentralen Teil des peripheren Stiels darstellt und auch an der Zusammensetzung des lumenalen Protonenhalbkanals beteiligt ist, fehlt bei T. brucei vollständig. Interessanterweise ist die Position von bH2 im Protonenhalbkanal durch ein vollständig geordnetes Phosphatidylcholinmolekül besetzt, das ein gut konserviertes proteinhaltiges Element im Protonenweg ersetzt. Dieser Austausch ist jedoch nicht ein gemeinsames Merkmal aller Typ-IV-ATP-Synthasen, da die Untereinheit b in E. gracilis das kanonische bH2 enthält, aber bH110 fehlt. Während die Untereinheit b in Euglenozoa konserviert ist, behielten die Abstammungslinien von T. brucei und E. gracilis ihre unterschiedlichen, nicht überlappenden Strukturelemente bei (Abb. 2c). Das Fehlen von bH2 in T. brucei beeinflusst auch die Zusammensetzung des peripheren Stiels, in dem die divergierenden Untereinheiten D und Untereinheiten 8 direkt an eine C-terminale Verlängerung von OSCP binden, was auf eine umgestaltete Architektur des peripheren Stiels hinweist. Der periphere Stiel berührt das F1-Kopfstück an mehreren Stellen, was der ATP-Synthase eine größere Konformationsflexibilität verleiht.

Mithilfe der Struktur- und Funktionsdaten identifizierten wir außerdem ein konserviertes Strukturelement der ATP-Synthase, das für deren Multimerisierung verantwortlich ist. Insbesondere ist die Untereinheit g für die Dimerisierung erforderlich, für den Zusammenbau der F1Fo-Monomere jedoch entbehrlich. Obwohl das monomerisierte Enzym katalytisch kompetent ist, führt die Unfähigkeit, Dimere zu bilden, zu einer fehlerhaften Cristae-Struktur und führt folglich zu einer beeinträchtigten oxidativen Phosphorylierung und einem Stopp der Proliferation. Die kristallformenden Eigenschaften mitochondrialer ATP-Synthase-Dimere sind entscheidend für eine ausreichende ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung, nicht jedoch für andere mitochondriale Funktionen, wie das Fehlen eines Wachstumsphänotyps von Untereinheit-gRNAi-Zellen in Gegenwart von Glucose zeigt. Somit stellt der Depletionsstamm der trypanosomalen Untereinheit g ein experimentelles Werkzeug dar, um die Rolle der primären katalytischen Funktion des Enzyms und der mitochondrienspezifischen Membranformungsaktivität zu bewerten und die Bedeutung der letzteren für die oxidative Phosphorylierung hervorzuheben.

Basierend auf unseren Daten und zuvor veröffentlichten Strukturen schlagen wir einen angestammten Zustand mit doppelten Reihen von ATP-Synthase-Monomeren vor, die in Längsrichtung durch e/g-Module und in Querrichtung durch andere Fo-Untereinheiten verbunden sind. Im Laufe der Evolution bildeten verschiedene Paare benachbarter ATP-Synthase-Monomereinheiten stabile Dimere in einzelnen Abstammungslinien (Abb. 8). Dies führte zu den stark divergenten Typ-I- und Typ-IV-ATP-Synthase-Dimeren mit Untereinheiten-e/g-Modulen, die entweder als Oligomerisierungs- bzw. Dimerisierungsmotive dienten. Da Trypanosomen zur tief verzweigten eukaryotischen Supergruppe Discoba gehören, könnte die vorgeschlagene Anordnung beim letzten gemeinsamen Vorfahren der Eukaryoten vorhanden gewesen sein. Obwohl die Sequenzähnlichkeit der Untereinheit g gering ist und auf die einzelne Transmembranhelix beschränkt ist, fanden wir Homologe der Untereinheit g zusätzlich zu Opisthokonta und Discoba auch in Archaeplastida und Amoebozoa, die andere eukaryotische Supergruppen darstellen, was die angestammte Rolle bei der Oligomerisierung unterstützt ( Ergänzende Abbildung 8). Zusammenfassend zeigt unsere Analyse, dass mitochondriale ATP-Synthasen, die eine deutlich unterschiedliche Architektur aufweisen, das angestammte Strukturmodul gemeinsam haben, das die Oligomerisierung fördert.

Schematisches Modell der Entwicklung von ATP-Synthasen vom Typ I und IV. Mitochondriale ATP-Synthasen leiten sich von einem Monomerkomplex proteobakteriellen Ursprungs ab. Bei einem mitochondrialen Vorfahren führte der Erwerb mitochondrienspezifischer Untereinheiten, einschließlich des Untereinheit-e/g-Moduls, zum Aufbau von ATP-Synthase-Doppelreihen, der strukturellen Grundlage für die Cristae-Biogenese. Durch Divergenz entwickelten sich unterschiedliche ATP-Synthase-Architekturen, wobei das Untereinheit-e/g-Modul als Oligomerisierungs- (Typ I) oder Dimerisierungsmotiv (Typ IV) fungierte, was zu unterschiedlichen Reihenanordnungen zwischen mitochondrialen Abstammungslinien führte.

Prozyklische T. brucei-Stämme wurden in SDM-79-Medium, ergänzt mit 10 % (v/v) fötalem Rinderserum, kultiviert. Für Wachstumskurven unter glukosefreien Bedingungen wurden Zellen in SDM-80-Medium mit 10 % dialysiertem FBS gezüchtet. RNAi-Zelllinien wurden in Gegenwart von 2,5 μg/ml Phleomycin und 1 μg/ml Puromycin gezüchtet. Zur ATP-Synthase-Reinigung wurden Mitochondrien aus dem Lister-Stamm 427 isoliert. Typischerweise wurden 1,5 × 1011 Zellen geerntet, in 20 mM Natriumphosphatpuffer pH 7,9 mit 150 mM NaCl und 20 mM Glucose gewaschen und in hypotonischem Puffer 1 mM Tris-HCl resuspendiert pH 8,0, 1 mM EDTA und durch 10 Hübe in einem 40 ml Dounce-Homogenisator aufgeschlossen. Die Lyse wurde durch sofortige Zugabe von Saccharose auf 0,25 M gestoppt. Rohe Mitochondrien wurden pelletiert (15 Min. bei 16.000 × g, 4 °C) und in 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM Saccharose, 5 mM MgCl2, 0,3 mM resuspendiert CaCl2 und behandelt mit 5 μg/ml DNase I. Nach 60 Minuten auf Eis wurde ein Volumen des STE-Puffers (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 250 mM Saccharose, 2 mM EDTA) zugegeben und die Mitochondrien pelletiert (15 Minuten bei 16000 × g, 4 °C). Das Pellet wurde in 60 % (v/v) Percoll in STE resuspendiert und auf sechs lineare 10–35 % Percoll-Gradienten in STE in Polycarbonatröhrchen für den SW28-Rotor (Beckman) geladen. Die Gradienten wurden 1 Stunde lang bei 104000 × g und 4 ° C zentrifugiert. Die mittlere Phase mit mitochondrialen Vesikeln (15–20 ml pro Röhrchen) wurde gesammelt, viermal im STE-Puffer gewaschen und die Pellets wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80 °C gelagert.

Um ATP-Synthase-Untereinheiten durch RNAi herunterzuregulieren, wurden DNA-Fragmente, die einzelnen Zielsequenzen entsprachen, durch PCR aus genomischer DNA des Stammes Lister 427 unter Verwendung von Vorwärts- und Rückwärtsprimern, die mit den Restriktionsstellen XhoI & KpnI bzw. XbaI & BamHI verlängert wurden, amplifiziert (Ergänzungstabelle 3). Jedes Fragment wurde in die mehreren Klonierungsstellen 1 und 2 des pAZ0055-Vektors eingefügt, der von pRPHYG-iSL (mit freundlicher Genehmigung von Sam Alsford) abgeleitet wurde, indem das Hygromycin-Resistenzgen durch das Phleomycin-Resistenzgen mit den Restriktionsenzymen KpnI/BamHI bzw. XhoI/XbaI ersetzt wurde . Die resultierenden Konstrukte mit durch Tetracyclin induzierbaren T7-Polymerase-gesteuerten RNAi-Kassetten wurden mit NotI linearisiert und durch Integration des SmOx-Konstrukts zur Expression von T7-Polymerase und des Tetracyclin-Repressors38 in den β-Tubulin-Locus in eine vom Lister-Stamm 427 abgeleitete Zelllinie transfiziert. RNAi wurde in ausgewählten semiklonalen Populationen durch Zugabe von 1 μg/ml Tetracyclin induziert und die Herunterregulierung der Ziel-mRNAs wurde durch quantitative RT-PCR 2 und 4 Tage nach der Induktion verifiziert. Die mit einem RNeasy Mini Kit (Qiagen) isolierte Gesamt-RNA wurde mit 2 μg DNase I behandelt und dann mit dem TaqMan Reverse Transcription Kit (Applied Biosciences) revers in cDNA transkribiert. qPCR-Reaktionen wurden mit Light Cycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche), 2 μl cDNA und 0,3 μM Primern (Ergänzungstabelle 3) durchgeführt und auf LightCycler 480 (Roche) durchgeführt. Die relative Expression der Zielgene wurde mithilfe der ΔΔCt-Methode mit 18S-rRNA oder β-Tubulin als endogenen Referenzgenen berechnet und auf nicht induzierte Zellen normalisiert.

Ganzzelllysate für die denaturierende Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Elektrophorese (SDS-PAGE) wurden aus in PBS-Puffer (10 mM Phosphatpuffer, 130 mM NaCl, pH 7,3) resuspendierten Zellen durch Zugabe von 3 × Laemmli-Puffer (150 mM Tris, pH 6,8, 300 mM 1,4-Dithiothreitol, 6 % (w/v) SDS, 30 % (w/v) Glycerin, 0,02 % (w/v) Bromphenolblau) bis zur Endkonzentration von 1 × 107 Zellen in 30 μl. Die Lysate wurden 10 Minuten lang bei 97 °C gekocht und bei –20 °C gelagert. Für das Immunblotting wurden Lysate von 3 × 106 Zellen auf Tris-Glycin-Polyacrylamidgelen mit einem Gradienten von 4–20 % (BioRad 4568094) aufgetrennt, auf eine PVDF-Membran (Pierce 88518) elektrogeblottet und mit entsprechenden Antikörpern sondiert (Ergänzungstabelle 4). Die Membranen wurden mit dem Clarity Western ECL-Substrat (BioRad 1705060EM) inkubiert und die Chemilumineszenz wurde auf einem ChemiDoc-Gerät (BioRad) nachgewiesen. Die Bandenintensitäten wurden densitometrisch mit der ImageLab-Software quantifiziert. Die Spiegel einzelner Untereinheiten wurden auf das Signal von mtHsp70 normalisiert.

Blaue native PAGE (BN-PAGE) wurde wie zuvor beschrieben12 mit den folgenden Modifikationen durchgeführt. Rohe mitochondriale Vesikel aus 2,5 × 108 Zellen wurden in 40 µl Solubilisierungspuffer A (2 mM ε-Aminocapronsäure (ACA), 1 mM EDTA, 50 mM NaCl, 50 mM Bis-Tris/HCl, pH 7,0) resuspendiert und mit solubilisiert 2 % (w/v) Dodecylmaltosid (β-DDM) für 1 h auf Eis. Lysate wurden 30 Minuten lang bei 4 ° C mit 16.000 × g geklärt und ihre Proteinkonzentration mithilfe eines Bicinchoninsäure-Assays geschätzt. Für jeden Zeitpunkt wurde ein Volumen mitochondriales Lysat, das 4 μg Gesamtprotein entspricht, mit 1,5 μl Ladefarbstoff (500 mM ACA, 5 % (w/v) Coomassie Brilliant Blue G-250) und 5 % (w/v) gemischt. v) Glycerin und mit 1 M ACA bis zu einem Endvolumen von 20 μl/Well und gelöst auf einem nativen PAGE 3–12 % Bis-Tris-Gel (Invitrogen). Nach der Elektrophorese (3 h, 140 V, 4 °C) wurden die Proteine durch Elektroblotting auf eine PVDF-Membran übertragen (2 h, 100 V, 4 °C, Rühren), gefolgt von einer Immundetektion mit einem geeigneten Antikörper (Ergänzungstabelle 4). .

Die Fähigkeit, die Mitochondrienmembran zu polarisieren, wurde fluormetrisch unter Verwendung des Safranin-O-Farbstoffs (Sigma S2255) in permeabilisierten Zellen bestimmt. Für jede Probe wurden 2 × 107 Zellen geerntet und mit ANT-Puffer (8 mM KCl, 110 mM K-Gluconat, 10 mM NaCl, 10 mM freie Hepes-Säure, 10 mM K2HPO4, 0,015 mM EGTA-Kaliumsalz, 10 mM Mannitol) gewaschen , 0,5 mg/ml fettsäurefreies BSA, 1,5 mM MgCl2, pH 7,25). Die Zellen wurden durch 8 μM Digitonin in 2 ml ANT-Puffer mit 5 μM Safranin O permeabilisiert. Die Fluoreszenz wurde 700 s lang in einem Hitachi F-7100-Spektrofluorimeter (Hitachi High Technologies) bei einer Erfassungsrate von 5 Hz unter Verwendung von 495 und 585 nm aufgezeichnet Anregungs- bzw. Emissionswellenlängen. Nach 230 s bzw. 500 s wurden 1 mM ATP (PanReac AppliChem A1348,0025) und 10 μg/ml Oligomycin (Sigma O4876) zugegeben. Die letzte Zugabe des Entkopplers SF 6847 (250 nM; Enzo Life Sciences BML-EI215-0050) diente als Kontrolle für die maximale Depolarisation. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur und ständigem Rühren durchgeführt.

Die ATP-Produktion in Digitonin-isolierten Mitochondrien wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt39. Kurz gesagt, 1 × 108 Zellen pro Zeitpunkt wurden in SoTE-Puffer (600 mM Sorbit, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,75), der 0,015 % (Gew./Vol.) Digitonin enthielt, 5 Minuten lang auf Eis lysiert. Nach der Zentrifugation (3 min, 4000 × g, 4 °C) wurde die lösliche zytosolische Fraktion verworfen und das Organellenpellet in 75 μl ATP-Produktionstestpuffer (600 mM Sorbitol, 10 mM MgSO4, 15 mM Kaliumphosphatpuffer pH) resuspendiert 7,4, 20 mM Tris-HCl pH 7,4, 2,5 mg/ml fettsäurefreies BSA). Die ATP-Produktion wurde durch Zugabe von 20 mM DL-Glycerinphosphat (Natriumsalz) und 67 μM ADP induziert. Kontrollproben wurden mit den Inhibitoren Kaliumcyanid (1 mM) und Carboxyatractylosid (6,5 μM) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur vorinkubiert. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Reaktion durch Zugabe von 1,5 μl 70 %iger Perchlorsäure gestoppt. Die ATP-Konzentration wurde mit dem Roche ATP Biolumineszenz Assay Kit HS II in einem Tecan Spark-Plattenlesegerät geschätzt. Die Lumineszenzwerte der RNAi-induzierten Proben wurden auf die der entsprechenden nicht-induzierten Probe normalisiert.

Die Proben wurden zentrifugiert und das Pellet auf die Probenträger übertragen, die mit 20 % BSA vervollständigt und sofort mit dem Hochdruckgefriergerät Leica EM ICE (Leica Microsystems) eingefroren wurden. Die Gefriersubstitution wurde in Gegenwart von 2 % Osmiumtetroxid, verdünnt in 100 % Aceton, bei –90 °C durchgeführt. Nach 96 Stunden wurden die Proben mit einer Steigung von 5 °C/h auf –20 °C erwärmt. Nach den nächsten 24 Stunden wurde die Temperatur auf 3 °C (3 °C/h) erhöht. Bei Raumtemperatur wurden die Proben in Aceton gewaschen und bei jedem Schritt 1 Stunde lang mit einer Mischung aus 25, 50, 75 % Aceton und Harz EMbed 812 (EMS) infiltriert. Abschließend wurden die Proben in 100 % Harz infiltriert und 48 Stunden lang bei 60 °C polymerisiert. Ultradünne Schnitte (70 nm) wurden mit einem Diamantmesser geschnitten, auf Kupfergitter gelegt und mit Uranylacetat und Bleicitrat angefärbt. TEM-Aufnahmen wurden mit der Mega View III-Kamera (SIS) unter Verwendung eines JEOL 1010 TEM bei einer Beschleunigungsspannung von 80 kV aufgenommen.

Mitochondrien aus 3 × 1011 Zellen wurden durch 1 % (Gew./Vol.) β-DDM in 60 ml 20 mM Bis-tris-Propan, pH 8,0, mit 10 % Glycerin und EDTA-freien kompletten Proteaseinhibitoren (Roche) 20 Minuten lang bei 4 °C lysiert °C. Das Lysat wurde durch 20-minütige Zentrifugation bei 30.000 × g bei 4 °C geklärt und durch tropfenweise Zugabe von 1 M 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure, pH 5,9, auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt. Rekombinantes TbIF1 ohne Dimerisierungsregion, dessen Affinität zur F1-ATPase durch N-terminale Verkürzung und Substitution von Tyrosin 36 durch Tryptophan20 erhöht wurde, mit einem C-terminalen Glutathion-S-Transferase (GST)-Tag (TbIF1(9-64)-Y36W- GST) wurde in einem etwa 10-fachen molaren Überschuss gegenüber dem geschätzten Gehalt an ATP-Synthase zugesetzt. Die Bindung von TbIF1 wurde durch die Zugabe von neutralisiertem 2 mM ATP mit 4 mM Magnesiumsulfat erleichtert. Nach 5 Minuten wurde Natriumchlorid auf 100 mM zugegeben, das Lysat wurde durch einen 0,2-μm-Spritzenfilter filtriert und sofort auf eine 5-ml-GSTrap-HP-Säule (Cytiva) geladen, die in 20 mM Bis-Tris-Propan-Bindungspuffer, pH 6,8, mit 0,1 % äquilibriert war. (w/v) Glyco-diosgenin (GDN; Avanti Polar Lipids), 10 % (v/v) Glycerin, 100 mM Natriumchlorid, 1 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin (TCEP), 1 mM ATP, 2 mM Magnesium Sulfat, 15 μg/ml Cardiolipin, 50 μg/ml 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (POPC), 25 μg/ml 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (POPE) und 10 μg/ml 1-Palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-[phospho-rac-(1-glycerin)] (POPG). Alle Phospholipide wurden von Avanti Polar Lipids erworben (Katalognummern 840012C, 850457C, 850757C bzw. 840757). ATP-Synthase wurde mit einem Gradienten von 20 mM reduziertem Glutathion in Tris-Puffer, pH 8,0, eluiert, der die gleichen Komponenten wie der Bindungspuffer enthielt. ATP-Synthase enthaltende Fraktionen wurden gepoolt und auf einem Vivaspin-Zentrifugalkonzentrator mit einem Molekulargewichts-Cut-off von 30 kDa auf 150 μl konzentriert. Die Probe wurde durch Größenausschlusschromatographie auf einer Superose 6-Steigerungssäule 3,2/300 GL (Cytiva) fraktioniert, äquilibriert in einem Puffer, der 20 mM Tris pH 8,0, 100 mM Natriumchlorid, 2 mM Magnesiumchlorid und 0,1 % (Gew./Vol.) GDN enthielt , 3,75 μg/ml Cardiolipin, 12,5 μg/ml POPC, 6,25 μg/ml POPE und 2,5 μg/ml POPG bei 0,03 ml/min. Fraktionen, die der ATP-Synthase entsprachen, wurden gepoolt, mit 0,05 % (Gew./Vol.) β-DDM ergänzt, von dem wir und andere experimentell festgestellt hatten, dass es Dimeranordnungen in Kryo-EM40 besser konserviert, und auf 50 μl konzentriert.

Die Proben wurden nach 3-sekündigem Blotting auf glimmentladenen Quantifoil R1.2/1.3 Au 300-Mesh-Gittern vitrifiziert und anschließend mit einem Vitrobot Mark IV in flüssiges Ethan getaucht. 5199 Filme wurden mit EPU 1.9 auf einem Titan Krios (ThermoFisher Scientific) aufgenommen, der bei 300 kV bei einer Nennvergrößerung von 165 kx (0,83 Å/Pixel) mit einer Quantum K2-Kamera (Gatan) und einer Spaltbreite von 20 eV betrieben wurde. Die Daten wurden mit einer Belichtungsrate von 3,6 Elektronen/Pixel/s, einer Gesamtbelichtung von 33 Elektronen/Å2 und 20 Bildern pro Film erfasst.

Die Bildverarbeitung wurde innerhalb des Scipion 2-Frameworks41 unter Verwendung von RELION-3.0 durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Die Bewegungskorrektur der Filme erfolgte mithilfe der RELION-Implementierung von MotionCor2. 294.054 Partikel wurden zunächst mithilfe der referenzbasierten Auswahl in Gautomatch (http://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gautomatch) ausgewählt, und die Parameter der Kontrastübertragungsfunktion verwendeten GCTF42. Die anschließende Bildverarbeitung wurde in RELION-3.0 durchgeführt und mithilfe der 2D- und 3D-Klassifizierung wurden 100.605 Partikel ausgewählt, die dann in einer nicht gruppierten 560-Pixel-Box extrahiert wurden (Abb. S1). Ein erstes Modell des ATP-Synthase-Dimers wurde mithilfe der De-novo-3D-Modellgenerierung erhalten. Unter Verwendung einer maskierten Verfeinerung mit angewandter C2-Symmetrie wurde nach der CTF-Verfeinerung pro Partikel und dem Bayes'schen Polieren eine 2,7 Å-Struktur des Membranbereichs erhalten. Nach Erweiterung der C2-Symmetrie und Signalsubtraktion eines Monomers wurde eine 3,7-Å-Karte des peripheren Stiels erhalten. Mithilfe der 3D-Klassifizierung (T = 100) ausgerichteter Partikel mit einer Maske auf der F1/c-Ring-Region wurden dann 10 verschiedene Rotationsunterzustände getrennt und mithilfe der 3D-Verfeinerung Karten mit einer Auflösung von 3,5–4,3 Å erhalten. Die Autoren weisen darauf hin, dass die Anzahl der in dieser Studie identifizierten Klassen wahrscheinlich eher die begrenzte Anzahl von Partikeln als den gesamten Konformationsraum des Komplexes widerspiegelt. Durch die Kombination von Partikeln aus allen Zuständen, die zum Hauptrotationszustand 1 gehören, wurden eine 3,7-Å-Karte des Rotors und eine 3,2-Å-Konsensuskarte des vollständigen ATP-Synthase-Dimers mit beiden Rotoren im Hauptrotationszustand 1 erhalten.

Ein erstes Atommodell der statischen Fo-Membranregion wurde automatisch mit Bucaneer43 erstellt. Anschließend wurden Untereinheiten direkt aus der Kryo-EM-Karte zugeordnet, wobei 15 davon zuvor identifizierten ATP-Synthase-Untereinheiten von T. brucei entsprachen21, während drei Untereinheiten (ATPTB14, ATPEG3 und ATPEG4) hier mithilfe von BLAST-Suchen identifiziert wurden. Die manuelle Modellerstellung wurde in Coot 0.9.544 unter Verwendung des T. brucei F1 PDB 6F5D [https://www.rcsb.org/structure/6F5D] (T. brucei F1)13 und Homologiemodellen45 des E. gracilis OSCP und durchgeführt c-ring PDB 6TDU [https://www.rcsb.org/structure/6TDU] (E. gracilis mitochondriale ATP-Synthase)10 als Startmodelle. Liganden wurden manuell an die Karte angepasst und Beschränkungen wurden vom GRADE-Server (http://grade.globalphasing.org) generiert. Cardiolipine wurden aufgrund des Vorhandenseins einer charakteristischen länglichen Dichte verzweigt, die an beiden Enden verzweigt war und zwei Phosphatidylgruppen entsprach, die durch die zentrale Glycerinbrücke verbunden waren. Monophosphatidyllipide wurden anhand ihrer Kopfgruppendichte zugeordnet. Charakteristische tetraedrische Formen der Dichte von Cholingruppen dienten zur Unterscheidung von Phosphatidylcholinen von verlängerten Phosphatidylethanolamin-Kopfgruppen (ergänzende Abbildung 5g, h). Die Verfeinerung des realen Raums wurde in PHENIX 1.17.1 unter Verwendung automatisch geschärfter, lokal aufgelöster gefilterter Karten der Membranregion, der peripheren Stielspitze, des C-Rings/Zentralstiels und der F1Fo-Monomere in verschiedenen Rotationszuständen unter Verwendung sekundärer Daten durchgeführt Strukturbeschränkungen. Modellstatistiken wurden mit MolProbity46 und EMRinger47 erstellt. Schließlich wurden die jeweiligen verfeinerten Modelle zu einem zusammengesetzten ATP-Synthase-Dimer-Modell kombiniert und im realen Raum anhand der lokal aufgelösten gefilterten Konsens-ATP-Synthase-Dimer-Karte mit beiden Monomeren im Rotationszustand 1 verfeinert, wobei Referenz angewendet wurde Beschränkungen. Abbildungen der Strukturen wurden mit ChimeraX 0.9148 erstellt, die Protonenhalbkanäle wurden mit HOLLOW49 verfolgt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die in dieser Studie generierten Atomkoordinaten wurden in der Proteindatenbank (PDB) unter den Zugangscodes 8AP7 (Membranregion), 8AP8 (peripherer Stiel), 8AP9 (Rotor), 8AP6 (F1Fo-Dimer), 8APA (Rotation) hinterlegt Zustand 1a), 8APB (Rotationszustand 1b), 8APC (Rotationszustand 1c), 8APD (Rotationszustand 1d), 8APE (Rotationszustand 1e), 8APF (Rotationszustand 2a), 8APG (Rotationszustand 2b), 8APH (Rotationszustand). 2c), 8APJ (Rotationszustand 2d), 8APK (Rotationszustand 3). Die mit lokaler Auflösung gefilterten Kryo-EM-Karten, Halbkarten, Masken und FSC-Kurven wurden in der Elektronenmikroskopie-Datenbank unter den Zugangscodes EMD-15560 (Membranregion), EMD-15561 (peripherer Stiel), EMD-15562 hinterlegt (Rotor), EMD-15559 (F1Fo-Dimer), EMD-15563 (Rotationszustand 1a), EMD-15564 (Rotationszustand 1b), EMD-15565 (Rotationszustand 1c), EMD-15566 (Rotationszustand 1d), EMD- 15567 (Rotationszustand 1e), EMD-15568 (Rotationszustand 2a), EMD-15570 (Rotationszustand 2b), EMD-15571 (Rotationszustand 2c), EMD-15572 (Rotationszustand 2d), EMD-15573 (Rotationszustand 3 ). Die TEM-Aufnahmen dünner Zellschnitte sind auf Anfrage bei den Autoren erhältlich. Alle anderen Daten sind im Artikel, in den Zusatzinformationen oder in der Quelldatendatei verfügbar. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Die in dieser Studie verwendeten Atomkoordinaten: 6TDU (mitochondriale ATP-Synthase aus E. gracilis), 6TDV (mitochondriale ATP-Synthase aus E. gracilis, Membranregion), 6B2Z (mitochondriale ATP-Synthase aus S. cerevisiae), 6F5D (T. brucei F1) , 6ZNA (S. scrofa mitochondriale ATP-Synthase) Quelldaten werden mit diesem Artikel bereitgestellt.

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Referenzen herunterladen

Wir danken John E. Walker und Martin G. Montgomery für ihre unschätzbare Unterstützung bei der ATP-Synthase-Reinigung in der Anfangsphase des Projekts. Wir danken der Kerneinrichtung Kryo-Elektronenmikroskopie und Tomographie des CIISB, Instruct-CZ Centre, unterstützt von MEYS CR (LM2018127). Diese Arbeit wurde durch die Zuschüsse der Tschechischen Wissenschaftsstiftung mit der Nummer 18-17529S an AZ und 20-04150Y an OG sowie durch den Europäischen Fonds für regionale Entwicklung (EFRE) und das Projekt CZ.02.1.01/0.0 des Ministeriums für Bildung, Jugend und Sport (MEYS) unterstützt /0.0/16_019/0000759 an AZ, Swedish Foundation for Strategic Research (FFL15:0325), Ragnar Söderberg Foundation (M44/16), European Research Council (ERC-2018-StG-805230), Knut and Alice Wallenberg Foundation (2018.0080) und EMBO Young Investigator Program an AA

Open-Access-Finanzierung durch die Universität Stockholm.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ondřej Gahura, Alexander Mühleip.

Institut für Parasitologie, Biologiezentrum, Tschechische Akademie der Wissenschaften, 37005, České Budějovice, Tschechische Republik

Ondřej Gahura, Carolina Hierro-Yap, Brian Panicucci, Minal Jain, Martina Slapničková und Alena Zíková

Science for Life Laboratory, Abteilung für Biochemie und Biophysik, Universität Stockholm, 17165, Solna, Schweden

Alexander Mühleip & Alexey Amunts

Fakultät für Naturwissenschaften, Südböhmische Universität, 37005, České Budějovice, Tschechische Republik

Carolina Hierro-Yap, Minal Jain, David Hollaus und Alena Zíková

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AZ und AA konzipierten und gestalteten das Werk. OG bereitete die Probe für die Kryo-EM vor. OG und AM führten ein erstes Screening durch. AM verarbeitete die Kryo-EM-Daten und erstellte das Modell. OG, AM und AA analysierten die Struktur. BP, CHY, MJ, MS, OG, DH und AZ führten biochemische Analysen durch. OG, AM, AA und AZ interpretierten die Daten. OG, AM, AA und AZ haben das Manuskript geschrieben und überarbeitet. Alle Autoren haben zur Analyse beigetragen und die endgültige Fassung des Manuskripts genehmigt.

Korrespondenz mit Alena Zíková oder Alexey Amunts.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Gahura, O., Mühleip, A., Hierro-Yap, C. et al. Ein angestammtes Interaktionsmodul fördert die Oligomerisierung in divergenten mitochondrialen ATP-Synthasen. Nat Commun 13, 5989 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33588-z

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Eingegangen: 22. Dezember 2021

Angenommen: 22. September 2022

Veröffentlicht: 11. Oktober 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33588-z

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