Gehirn

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3417 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Trotz der grundlegenden Bedeutung des Verständnisses des Schaltplans des Gehirns bleibt unser Wissen darüber, wie die neuronale Konnektivität durch traumatische Hirnverletzungen neu verkabelt wird, bemerkenswert unvollständig. Hier verwenden wir die zellulare Auflösung der Ganzhirnbildgebung, um gehirnweite Karten des Inputs zu hemmenden Neuronen in einem Mausmodell einer traumatischen Hirnverletzung zu erstellen. Wir stellen fest, dass Somatostatin-Interneuronen in mehreren Gehirnregionen in hypervernetzte Knotenpunkte umgewandelt werden, mit reichhaltigen lokalen Netzwerkverbindungen, aber verminderten Ferneinträgen, selbst in Bereichen, die nicht direkt geschädigt sind. Der Verlust von Ferninput korreliert nicht mit dem Zellverlust in entfernten Hirnregionen. In die Verletzungsstelle transplantierte Interneurone erhalten orthotopen lokalen und weitreichenden Input, was darauf hindeutet, dass die Maschinerie zum Aufbau entfernter Verbindungen auch nach einer schweren Verletzung intakt bleibt. Unsere Ergebnisse decken eine mögliche Strategie zur Aufrechterhaltung und Optimierung der Hemmung nach einer traumatischen Hirnverletzung auf, die eine räumliche Neuorganisation der direkten Eingänge zu hemmenden Neuronen im gesamten Gehirn beinhaltet.

Die Gehirnfunktion beruht auf einer äußerst vielfältigen Gruppe hemmender Interneurone, die den Ein- und Ausgang lokaler Netzwerke steuern1,2,3. In der Großhirnrinde exprimiert eine der größten Interneuronpopulationen das Neuropeptid Somatostatin (SST)4,5,6. Diese Zellen hemmen Dendriten und regulieren dadurch die Integration glutamaterger Eingaben in lokale Hauptneuronen. Dies verleiht ihnen eine einzigartige Rolle bei der Gestaltung der synaptischen Plastizität, des Lernens und des Gedächtnisses7,8,9,10,11,12,13,14. SST-Interneuronen gehören jedoch zu den anfälligsten für den Zelltod nach einer Hirnverletzung, und ihr Verlust wurde in experimentellen Modellen für Epilepsie, traumatische Hirnverletzung (TBI) und Alzheimer-Krankheit gut dokumentiert15,16,17,18,19 und beim Menschen20,21. Im Hippocampus erhalten überlebende SST-Interneuronen einen stärkeren erregenden Antrieb, bilden neue inhibitorische Synapsen auf glutamatergen Neuronen und wachsen sogar in Gebiete hinein, die sie normalerweise nicht besetzen22,23,24,25. Dieses Muster der Neuverdrahtung lokaler Schaltkreise wirft die Frage auf, ob eine Hirnschädigung die Interneuron-Konnektivität in viel größerem Maßstab neu organisiert.

Um diese Möglichkeit unvoreingenommen anzugehen, nutzten wir ein retrogrades monosynaptisches Tollwutvirussystem und verbesserte Techniken zur Gewebereinigung im gesamten Gehirn, um gehirnweite Karten des direkten Inputs zu SST-Interneuronen in einem Mausmodell mit fokalem TBI zu erstellen. Wir fanden dramatische quantitative Unterschiede sowohl im lokalen als auch im weitreichenden Input zu Hippocampus-SST-Interneuronen an der Verletzungsstelle. Allerdings gab es keinen Neuronenverlust innerhalb der entfernten Eingaberegionen selbst und der Anteil der Neuronensubtypen, die auf Starterneuronen abzielten, war stabil. Zu unserer Überraschung entdeckten wir ein ähnliches Muster der Schaltkreisreorganisation weit entfernt von der Verletzung im präfrontalen Kortex (PFC), der bidirektional mit dem Hippocampus interagiert26, aber durch die anfängliche Beleidigung nicht direkt beschädigt wurde. Interneuron-Vorläufer, die in den verletzten Hippocampus eingepfropft wurden, stellten erfolgreich geeignete Fernverbindungen her; Allerdings behielten aus Transplantaten gewonnene Interneurone den verstärkten lokalen Input bei, der nach TBI beobachtet wurde. Somit liefern unsere Experimente neue Erkenntnisse über den groß angelegten Umbau von Schaltkreisen nach einer Hirnverletzung und legen nahe, dass eine Hirnschädigung, selbst wenn sie fokal begrenzt ist, weitaus größere Auswirkungen auf die Funktion neuronaler Schaltkreise im gesamten Gehirn hat als bisher angenommen.

Trotz ihrer wichtigen Rolle bei der Gestaltung der lokalen Netzwerkaktivität und des Gedächtnisses11,14 wurde der genaue gehirnweite Input zu SST-Interneuronen im Gyrus dentatus nicht systematisch definiert. Wir haben die SST+-Neuronendichte zunächst während der chronischen Phase nach TBI mithilfe von Reportermäusen quantifiziert, die fast alle SST-Interneuronen mit GFP27 markieren. Bei P60 (1,0 mm Einwirkungstiefe, 3,5 m s−1 und 500 ms Dauer) wurde jungen erwachsenen Mäusen eine einseitige kontrollierte kortikale Einwirkungsverletzung (CCI) zugefügt, und acht Wochen später wurden die Tiere zur Immunfärbung verarbeitet. Dieser Zeitraum entspricht einer Zeit, in der langfristige Neuropathologie und Verhaltensphänotypen gut etabliert sind. Bei allen hirngeschädigten Mäusen bestand die Läsion aus einem Hohlraum, der sich durch die Dicke des Neocortex erstreckte und zu einer erheblichen Verzerrung und Ausdünnung der Hauptzellschichten im Hippocampus führte (Abb. 1a). Wir beobachteten eine Verringerung der GFP+-Zellen im Hilus um ca. 65 % (Abb. 1b; ergänzende Daten 1), was mit dem in früheren Studien berichteten kurzfristigen Verlust von SST-Interneuronen übereinstimmt 17, 18.

a Koronaler Abschnitt 8 Wochen nach TBI markiert für SST-GFP (grün) und DAPI (magenta). h, hilus; gcl, Körnerzellschicht; ml, molekulare Schicht. Repräsentatives Tier aus n = 5 TBI-Mäusen b Quantifizierung von SST-GFP-Interneuronen in unverletzten Kontrolltieren und hirngeschädigten Tieren. ***P = 1,62E-06, ipsilaterale unverletzte Kontrolle versus ipsilateraler TBI, ***P = 1,31E-05, kontralateraler TBI versus ipsilateraler TBI; Zweiwege-ANOVA mit Tukey-Post-hoc-Test, n = 6 unverletzte und 5 TBI-Mäuse. C. Schematische Darstellung der experimentellen retrograden Rückverfolgungsstrategie für zwei Viren. d, e Gyrus dentatus eines unverletzten Kontrolltiers (d) und eines CCI-verletzten Tieres (e), markiert für DAPI (blau), AAV-Helfervirus (grün) und RVΔG-mCherry (magenta). Repräsentative Tiere von n = 4 unverletzten und 2 TBI-Mäusen. F. Koronaler Abschnitt des Gyrus dentatus, markiert für AAV-Helfervirus (grün) und Somatostatin (magenta). Repräsentatives Tier von n = 3 unverletzten Mäusen. g Quantifizierung der SST-Expression in mit AAV-Helfervirus markierten Neuronen; n = 3 Mäuse. h Verteilung von zweifarbig markierten Starterzellen im Hippocampus; n = 73 Zellen von 4 unverletzten Kontrollen, n = 23 Zellen von 2 Tieren mit TBI. Fehlerbalken, sem; Maßstabsbalken, 1 mm (a, links), 100 μm (a, rechts; d und e) und 50 μm (f). Siehe auch Ergänzende Abbildungen. 1, 2 und ergänzende Daten 1. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um den monosynaptischen Input zu SST-Interneuronen im chronisch verletzten Gehirn zu kennzeichnen, verwendeten wir einen genetisch eingeschränkten Zwei-Virus-Ansatz, um ihre mutmaßlichen Inputs anatomisch aufzudecken (Abb. 1c-e). Wir injizierten zunächst 4 Wochen nach TBI ein Cre-abhängiges Helfervirus (AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG) in den Gyrus dentatus erwachsener SST-Cre-Mäuse. Dieses Helfervirus stellt den Rezeptor bereit, der es dem EnvA-beschichteten Tollwutvirus ermöglicht, nur in Cre-positive Neuronen und Glykoprotein einzudringen, damit das Tollwutvirus retrograd auf monosynaptische Eingangsneuronen übertragen werden kann. Drei Wochen später injizierten wir ein G-deletiertes und EnvA-pseudotypisiertes Tollwutvirus, das mCherry kodiert, an derselben Stelle (RVΔG-mCherry). Da sich SST+-Interneuronen im Gyrus dentatus ausschließlich im Hilus befinden, haben wir diese Region für die Virusinjektion ins Visier genommen. Nach 7 Tagen identifizierten wir Neuronen, die sowohl für fluoreszierende Reporter an der Injektionsstelle positiv waren (Starterzellen), als auch mit dem Tollwutvirus infizierte Neuronen, die mit mCherry markiert waren (präsynaptische Eingabeneuronen). Eine beträchtliche Anzahl von Neuronen in verschiedenen Gehirnbereichen wurde durch das Tollwutvirus markiert (ergänzende Abbildung 1).

Um die Spezifität der Virusmarkierung zu bestätigen, führten wir an der Injektionsstelle eine Immunfärbung gegen SST durch. Wir fanden heraus, dass 97 % der GFP-markierten Neuronen SST+ waren (152 von 156 Zellen, n = 3 Mäuse) (Abb. 1f, g). Um die potenzielle Leakage-Expression des Virus zu bewerten, führten wir eine Reihe von Kontrollexperimenten durch. Um die Abhängigkeit der Cre-Rekombination zu bestätigen, injizierten wir Cre-Wurfgeschwistern AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG-Helfer und RVΔG-mCherry-Virus. Nirgendwo im Gehirn wurden Neuronen markiert (ergänzende Abbildung 2a). Bei Cre+-Tieren wurden GFP+-Neuronen nur an der Injektionsstelle markiert und außerhalb der Injektionsstelle wurden keine GFP+-Neuronen gefunden (ergänzende Abbildung 2). Sowohl bei Kontrolltieren als auch bei hirngeschädigten Tieren waren die Starterzellen fast ausschließlich auf den Hilus beschränkt (Abb. 1h, Ergänzende Daten 1). In der angrenzenden CA3-Region wurden nur gelegentlich Starterzellen gefunden; In CA1, CA2, Neocortex oder einer anderen Gehirnregion wurden keine GFP+-Zellen gefunden.

Als nächstes erstellten wir mithilfe von iDISCO+ Brain Clearing und Whole-Brain Light-Sheet Imaging Ganzhirnkarten von Neuronen, die monosynaptische Eingaben an SST-Interneuronen senden (Abb. 2a). Eine der größten Herausforderungen bei diesen Techniken war der Zugriff auf Eingabeneuronen tief im Gewebe28. Aufbauend auf bestehenden iDISCO+-Protokollen und jüngsten Fortschritten in der Permeabilisierungschemie29,30 haben wir daher die Clearing-Bedingungen modifiziert, um eine tiefe Gewebeimmunmarkierung in einem traumatisch verletzten Gehirn zu erreichen. Wir haben drei wichtige Verbesserungen bei den iDISCO+-Probenvorbereitungs- und Bildgebungsverfahren vorgenommen (ergänzende Abbildung 3). Zunächst führten wir eine erste Wäsche mit N-Methyldiethanolamin (MDEA) durch, um restliches, nicht durchblutetes Blut zu entfärben, das Licht absorbiert31. Zweitens denaturierten wir die extrazelluläre Matrix vor der Immunmarkierung mit einer konzentrierten Guanidinhydrochloridlösung. Drittens haben wir dem Antikörperverdünnungsmittel ein zusätzliches Detergens (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat, CHAPS) hinzugefügt, um das Eindringen von Antikörpern tiefer in das Gewebe zu verbessern. Diese Optimierungen ermöglichten eine Immunmarkierung des gesamten Gehirns, ohne dass das Gehirn wie üblich in zwei separate Hemisphären unterteilt werden musste. Die aus der Bildgebung erfassten Rohdaten wurden im Allen Common Coordinate Framework (CCF) registriert und die Zellpositionen wurden mit Tools aus der BrainGlobe-Suite32,33 kommentiert und analysiert (ergänzende Abbildung 4). Wie erwartet war die Anzahl der Starterneuronen bei hirngeschädigten Tieren reduziert (Kontrolle: 48,0 ± 3,7 Zellen, TBI: 9,4 ± 0,9 Zellen, P = 9,45E-06, zweiseitiger t-Test), was mit dem Verlust von übereinstimmt SST-Interneuronen. Starterzellen waren fast ausschließlich auf den Hilus beschränkt (Kontrolle: 92,8 ± 0,96 % Starterzellen im Gyrus dentatus, TBI: 89,8 ± 3,2 % Starterzellen im Gyrus dentatus; P = 0,3, exakter Fisher-Test). Obwohl die Anzahl der markierten Neuronen von Tier zu Tier unterschiedlich war, gab es eine Korrelation zwischen der Anzahl der Input-Neuronen und der Starterzellen (Abb. 2b).

a Experimentelles Design für eine verbesserte iDISCO+-Gehirnreinigung und Lichtblattbildgebung des gesamten Gehirns. b Lineare Regressionsanalyse für die Anzahl der Starterzellen und präsynaptischen Eingabeneuronen im gesamten Gehirn (n = 4 unverletzte Kontrollen, 5 TBI-Mäuse; R2 = 0,98). c Schematische Koronarschnitte (250 μm), die einzelne mit Tollwut markierte Zellen zeigen, die im standardisierten Atlasraum für unverletzte Kontrolltiere (blau) und hirnverletzte Tiere (rot) registriert sind. Ein Punkt repräsentiert ein Neuron. n = 4 unverletzte Kontrolltiere und 5 TBI-Tiere. Eine Liste der Abkürzungen finden Sie in den Zusatzdaten 2. d Gaußsche Kernzelldichtediagramme, die gepoolte euklidische Abstände von Eingabeneuronen zum nächstgelegenen Starterneuronschwerpunkt zeigen. e. Anteil der Eingabeneuronen außerhalb des ipsilateralen Hippocampus (DG, CA3, CA2, CA1). Unverletzt: 39,6 ± 5,2 %, n = 4 Mäuse; TBI: 11,8 ± 2,7 %, n = 5 Mäuse; **P = 1,5E-3; zweiseitiger t-Test. f Anteil der Input-Neuronen in der kontralateralen Hemisphäre. Unverletzt: 8,4 ± 0,7 %, n = 4 Mäuse; TBI: 3,0 ± 0,8 %, n = 5 Mäuse; **P = 2,0E-3; zweiseitiger t-Test. g Gaußsches Kernzelldichtediagramm der Verteilung der Eingangsneuronen im gesamten Gehirn entlang der anterior-posterioren Achse. Die graue Schattierung stellt die gepoolte Population dar, wobei einzelne Linien jedes Tier darstellen. Die Quantifizierung erfolgt in den Zusatzdaten 3. h Anteil der Input-Neuronen, die in jedem einzelnen Gehirnbereich gefunden werden. ***P < 1,0E-15, unverletzt vs. TBI (CA1), ***P = 2,25E-04, unverletzt vs. TBI (ENTm), **P = 4,69E-03, unverletzt vs. TBI (NDB); Zweifaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen und Bonferronis Post-hoc-Test; n = 4 unverletzte und 5 TBI-Mäuse. Die Quantifizierung erfolgt in den Zusatzdaten 4. Fehlerbalken, SEM; Maßstabsbalken, 1 mm (außer tiefe Immunmarkierung in a, 100 μm). Siehe auch Ergänzende Abbildungen. 3 bis 7, Zusatzdaten 5 und Zusatzfilme 1 und 2. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die Kartierung des gesamten Gehirns von mit Tollwut markierten Neuronen ergab Eingaben aus 15 verschiedenen Gehirnregionen (Abb. 2c, ergänzende Abb. 5, 6). Der Großteil der Eingaben kam erwartungsgemäß vom Gyrus dentatus und CA324,34,35, gefolgt vom medialen entorhinalen Kortex (ENTm), dem Diagonalbandkern (NDB) und dem lateralen entorhinalen Kortex (ENTl). Bemerkenswert ist, dass sich dieses Eingabemuster von früheren Ergebnissen der retrograden Verfolgung in dentierten Körnerzellen unterscheidet, die erheblich schwächere Projektionen von ENTm als von ENTl und deutliche Eingaben von Brustkernen erhalten36, 37, sowie von SST-Interneuronen in CA1, die sehr wenig Eingaben erhalten aus dem entorhinalen Kortex38. Nach TBI kam es zu einer Verschiebung des euklidischen Abstands tollwutmarkierter Neuronen zum Starterzellschwerpunkt (Abb. 2d; ergänzende Abb. 5), was darauf hindeutet, dass Eingabeneuronen nach einer Hirnverletzung wesentlich näher an den Starterzellen lagen.

Ein höherer Anteil lokaler Verbindungen wurde bestätigt, als wir den Input zu SST-Interneuronen detaillierter analysierten. Bei Kontrolltieren wurden etwa 40 % der Input-Neuronen außerhalb des Hippocampus nachgewiesen, und 8 % der Input-Neuronen befanden sich in der kontralateralen Hemisphäre. Die Anteile dieser weitreichenden Einträge waren bei Tieren mit TBI signifikant verringert (Abb. 2e, f). Darüber hinaus analysierten wir die Wahrscheinlichkeit von Eingabeneuronen in 200-μm-Bins entlang der gesamten anterior-posterioren (AP) Achse von 0 mm (Riechkolben) bis 13 mm (Kleinhirn) (Abb. 2g). Dies ergab einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes der Eingabeneuronen zwischen 6,8 mm und 7,4 mm auf der Ebene des Hippocampus (6,8–7 mm, unverletzt: 6,79 ± 0,79 %, TBI: 18,12 ± 5,03 %, P = 1,42E-11; 7– 7,2 mm, unverletzt: 7,15 ± 0,83 %, TBI: 18,31 ± 4,01 %, P = 3,02E-11; 7,2–7,4 mm, unverletzt: 8,67 ± 1,70 %, TBI: 16,72 ± 4,55 %, P = 7,64E-06; Zweiwege-ANOVA mit wiederholten Messungen und Bonferroni-Post-hoc-Test; Ergänzende Daten 3) und nimmt auf der Ebene von ENTm um 10 mm auf 10,2 mm ab (Kontrolle: 7,48 ± 2,04 %, TBI: 1,90 ± 1,03 %, P = 1,33E). -02; Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und Bonferroni-Post-hoc-Test; Ergänzende Daten 3). Nach TBI wurde eine massive Eingabemarkierung im ipsilateralen Hippocampus festgestellt, mit einem signifikant höheren Anteil an Eingaben aus dem Bereich CA1 (Abb. 2h; Ergänzende Daten 4). Es wurde jedoch festgestellt, dass entfernte Gehirnbereiche, die bei Kontrollen den größten Anteil an Eingaben für SST-Interneuronen liefern, wie z. B. ENTm und NDB, nach TBI eine signifikante Verringerung der Eingaben aufwiesen (Abb. 2h; ergänzende Daten 4). Um Änderungen in der Anzahl der Input-Neuronen und nicht im Anteil des Inputs direkt zu vergleichen, haben wir den Konvergenzindex für jedes Tier berechnet, definiert als die Anzahl der mCherry-markierten Input-Neuronen dividiert durch die Anzahl der GFP- und mCherry-markierten Starterzellen. Diese Analyse ergab auch einen signifikanten Anstieg des CA1-Eintrags und einen Rückgang des Ferneintrags von ENTm und NDB (Ergänzende Abbildung 7; Ergänzende Daten 5). Somit kommt es nach TBI zu einer dramatischen Verschiebung sowohl in der Anzahl als auch im relativen Anteil der lokalen und Ferneinträge in die SST-Interneuronen des Hippocampus.

Der Verlust der Ferneingabe nach TBI könnte auf einen Verlust von Neuronen an entfernten Stellen oder einen Verlust anatomischer Verbindungen zurückzuführen sein. Um dies zu testen und die neurochemischen Identitäten der Eingaben in hiläre SST-Interneuronen zu charakterisieren, haben wir eine Methode entwickelt, um dieselben Gehirne zu rehydrieren, die für die Lichtblattbildgebung verwendet wurden, und sie für die herkömmliche Doppelimmunfluoreszenz-Immunfärbung zu verarbeiten (Abb. 3a-c). Da der weitreichende Input zu hilären SST-Interneuronen hauptsächlich vom basalen Vorderhirn und der HNO kommt, haben wir die Neuronenpopulationen in diesen Bereichen quantifiziert.

ein Schema, das das experimentelle Protokoll für die umgekehrte Gehirnreinigung und Immunmarkierung zeigt. b Zwei mit Tollwut markierte Eingabeneuronen (rot), identifiziert in einem sagittalen optischen Schnitt von NDB in einem intakten Kontrollgehirn. Repräsentatives Tier aus n = 3 unverletzten Kontrollen. 50-μm-Projektion mit maximaler Intensität, erhalten durch Lichtblattbildgebung des gesamten Gehirns. c Sagittalschnitt mit den gleichen Eingangsneuronen (magenta), markiert für CHAT (grün), nach der Verarbeitung für traditionelle Immunfärbung und konfokale Bildgebung. Repräsentatives Tier aus n = 3 unverletzten Kontrollen. Der Pfeil zeigt die co-markierte Zelle an. d NDB der unverletzten Kontrolle (links) und des hirnverletzten Tieres (rechts), markiert für CHAT (grün). Repräsentative Tiere von n = 3 unverletzten und 4 TBI-Mäusen. e Anteil der mit mCherry+ Tollwut markierten Eingabeneuronen, die CHAT exprimierten. f Quantifizierung der CHAT+-Neuronendichte im ipsilateralen und kontralateralen NDB bei unverletzten Kontrolltieren und hirnverletzten Tieren. n = 3 unverletzte und 5 TBI-Tiere. g Sagittalschnitt des Gyrus dentatus bei einem unverletzten Kontrolltier (links) und einem hirnverletzten Tier (rechts), markiert für CHAT (grün) und DAPI (blau). Repräsentative Tiere von n = 3 unverletzten und 4 TBI-Mäusen. h, hilus; gcl, Körnerzellschicht; ml, molekulare Schicht. H. Quantifizierung der CHAT+-Axondichte im ipsilateralen und kontralateralen Gyrus dentatus bei unverletzten Kontrolltieren und hirngeschädigten Tieren. n = 3 unverletzte und 4 TBI-Tiere. i ENTm des unverletzten Kontrolltiers (links) und des hirnverletzten Tieres (rechts), gekennzeichnet für Reelin (grün) und mCherry (magenta). Repräsentative Tiere von n = 3 unverletzten und 5 TBI-Tieren. j Anteil der mit mCherry+ Tollwut markierten Eingabeneuronen, die Reelin exprimierten. k Quantifizierung der Reelin+-Zelldichte in der ipsilateralen und kontralateralen HNO. n = 3 unverletzte und 5 TBI-Tiere. Fehlerbalken, sem; Maßstabsbalken, 100 μm. Siehe auch ergänzende Abbildung 8 und ergänzende Daten 1. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Das basale Vorderhirn enthält mehrere Zelltypen, die über weite Strecken über den Fimbria/Fornix-Weg zum Hippocampus projizieren, darunter cholinerge, glutamaterge und GABAerge Neuronen39. Sowohl bei Kontrolltieren als auch bei verletzten Tieren exprimierte die absolute Mehrheit der NDB-Eingangsneuronen zu hilären SST-Interneuronen Cholinacetyltransferase (CHAT) (Kontrolle: 67,1 ± 6,8 %, n = 3 Mäuse; TBI: 79,2 ± 12,5 %, n = 4 Mäuse; P = 0,99, exakter Fisher-Test; Abb. 3d, e). Dies unterscheidet sich von inhibitorischen Interneuronen in CA1, die hauptsächlich GABAergen Input vom basalen Vorderhirn erhalten38. Wir fanden keinen Unterschied in der Dichte von CHAT+-Neuronen in NDB zwischen Kontrolltieren und hirngeschädigten Tieren (Abb. 3f), was darauf hindeutet, dass CHAT+-Neuronen im basalen Vorderhirn nach fokaler TBI nicht reduziert waren.

Da Neuronen in NDB und ENTm direkt in den Hippocampus projizieren, werden ihre Axone mit ziemlicher Sicherheit durch TBI beschädigt. Daher untersuchten wir als nächstes, ob die Dichte cholinerger Projektionen im Hippocampus durch TBI beeinflusst wurde. Sowohl bei den Kontrolltieren als auch bei den verletzten Tieren gab es ein dichtes Geflecht aus CHAT+-Axonfortsätzen, die jede Schicht des Hippocampus innervierten, sogar im Epizentrum der Verletzung (Abb. 3g, h). Wir konnten keinen Unterschied in der CHAT-Expression zwischen den Gruppen feststellen (Kontrolle, ipsilateral: 20,8 ± 1,9 %, Kontrolle, kontralateral: 20,8 ± 1,7 %, n = 3 Mäuse; TBI, ipsilateral: 22,9 ± 0,6 %, TBI, kontralateral: 22,0 ±). 1,2 %, n = 4 Mäuse; P = 0,96, Zwei-Wege-ANOVA). Diese Ergebnisse zeigen, dass die Verringerung der CHAT+-Eingabeneuronen nicht mit einem allgemeinen Verlust von CHAT+-Afferenzen im Hippocampus nach TBI einherging.

Dieses Ergebnis war unerwartet, da über einen Verlust von CHAT-immunreaktiven Neuronen im basalen Vorderhirn von Modellen mit diffuser Verletzung berichtet wurde40,41. Um die Möglichkeit auszuschließen, dass die Zellquantifizierungen durch die Kartierung von Tollwutkreisläufen oder Gehirnreinigungsverfahren beeinflusst wurden, untersuchten wir eine zweite, unabhängige Kohorte von Kontrolltieren und hirngeschädigten Tieren, die sich diesen Verfahren nicht unterzogen (n = 6 Kontrollen, n = 4 TBI-Tiere). . In diesem Replikationsexperiment fanden wir auch eine ähnliche Anzahl von CHAT+-Neuronen in NDB von altersentsprechenden Kontroll- und TBI-Mäusen (ergänzende Abbildung 8).

Sowohl bei Kontrolltieren als auch bei hirngeschädigten Tieren wurden Eingabeneuronen in ENTm fast ausschließlich in Schicht II gefunden (Abb. 3i). Ungefähr 90 % dieser Zellen exprimierten Reelin und hatten große multipolare Sternzellmorphologien (Kontrolle: 86,8 ± 0,34 %, n = 3 Mäuse; TBI: 95,2 ± 4,8 %, n = 3 Mäuse; P = 0,99, exakter Fisher-Test; Abb. 3j). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Studien überein, die zeigen, dass Reelin-exprimierende Sternzellen in ENTm den wichtigsten assoziativen glutamatergen Weg hervorrufen, der als perforierender Weg bekannt ist und in die Regionen Gyrus dentatus, CA3 und CA2 des Hippocampus projiziert42,43,44. Wir fanden keinen Unterschied in der Dichte von Reelin+-Neuronen in ENTm zwischen Kontrolltieren und hirngeschädigten Tieren (Abb. 3k), ähnlich wie unsere Ergebnisse im basalen Vorderhirn. Zusammenfassend zeigen unsere Ergebnisse, dass es zu einer Verringerung der Inputmenge an hilären SST-Interneuronen aus beiden großen entfernten Hirnregionen kommt, die den Gyrus dentatus nach einem fokalen Schädel-Hirn-Trauma innervieren, diese entfernten Bereiche bleiben jedoch strukturell intakt.

Der Input von CA1 erhöhte sich nach TBI um mehr als das Zehnfache. Um herauszufinden, welche CA1-Neuronentypen Eingaben für hiläre SST-Interneuronen bereitstellen, haben wir die laminare Position der CA1-Eingabeneuronen im selben rückseitig gereinigten Gewebe beurteilt (Abb. 4). Bei den Kontrollen befanden sich etwa 65 % der CA1-Eingabeneuronen in der Pyramidenzellschicht. Diese Neuronen hatten morphologische Merkmale von Pyramidenneuronen und exprimierten WFS1, einen Marker für CA1-Pyramidenneuronen (Abb. 4a). Ein kleinerer Teil der CA1-Eingabeneuronen wurde außerhalb der Pyramidenschicht gefunden und exprimierte kein WFS1; Dies sind mutmaßliche Interneurone. Bei hirngeschädigten Tieren gab es einen signifikanten Anstieg des Anteils der Input-Neuronen, die in der Pyramidenzellschicht positioniert waren (Kontrolle: 64,5 ± 14,0 %, n = 3 Mäuse; TBI: 92,1 ± 5,1 %, n = 4 Mäuse; P = 1,29). E-07, Chi-Quadrat-Test; Abb. 4b). Robuste Projektionen dieser Neuronen konnten deutlich beim Eintritt in den Gyrus dentatus beobachtet werden (Abb. 4a). Daher kommt es nach TBI zu einem Anstieg des lokalen CA1-Inputs in hiläre SST-Interneuronen, und CA1-Pyramidenneuronen sind die Hauptquelle dieses neuen Inputs.

ein CA1 bei einem unverletzten Kontrolltier (oben) und einem hirnverletzten Tier (unten), markiert für Tollwut (blau) und WFS1 (rot). Repräsentative Tiere von n = 3 unverletzten und 4 TBI-Mäusen. also, stratum orients; sp, Stratum Pyramidale; sr, Stratum radiatum; ml, molekulare Schicht; gcl, körnige Zellschicht. b Anteil der Eingabeneuronen, die in jeder Schicht von CA1 gefunden werden. ***P = 1,29E-07, unverletzt versus TBI, zweiseitiger Chi-Quadrat-Test. n = 45 Zellen von 3 unverletzten Kontrollen, 183 Zellen von 4 TBI-Mäusen. Maßstabsbalken, 100 μm. Siehe auch Ergänzende Daten 1. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Nachdem wir eine dramatische hirnweite Reorganisation der SST-Interneuron-Schaltkreise im Hippocampus beobachtet hatten, fragten wir als nächstes, ob der Input zu SST-Neuronen auch weit entfernt von der Verletzung neu verdrahtet wurde. Der PFC ist eine entscheidende limbische Stelle höherer Ordnung, die für das Abrufen von Erinnerungen und die Entscheidungsfindung von zentraler Bedeutung ist und ein äußerst vielfältiges Muster von Eingaben empfängt, die sich über das gesamte Gehirn erstrecken, einschließlich direkter Eingaben vom Hippocampus45. 24 Stunden nach der Verletzung zeigte die Fluoro-Jade-C-Färbung degenerierte Neuronen im Hippocampus und Neocortex im Epizentrum der Verletzung, an entfernten Stellen wie PFC, entorhinalem Cortex, basalem Vorderhirn oder Thalamus wurden jedoch keine markierten Zellen nachgewiesen (ergänzende Abbildung 9). ). Dieses Ergebnis ist nahezu identisch mit früheren Berichten in diesem Modell46. Wir fanden auch keinen Unterschied in der SST+-Neuronendichte bei PFC acht Wochen nach TBI (Ergänzende Abbildung 10; Ergänzende Daten 1). Diese Ergebnisse stimmen mit der Entstehung einer hochfokalen kontusiven Hirnverletzung überein.

Um Ganzhirnkarten des Inputs zu SST-Interneuronen in PFC zu erstellen, verwendeten wir den gleichen Zwei-Virus-Tollwut-basierten Ansatz, um zweifarbige Starterzellen und mCherry-markierte Input-Neuronen in SST-Cre-Mäusen zu markieren (Abb. 5a, b). ). Für diese Studien wurde PFC so definiert, dass es die folgenden Unterregionen umfasst, basierend auf einem Konsens aus der Literatur:45 sekundärer motorischer Bereich (MOs), anteriore cinguläre Bereiche dorsal und ventral (ACAd und ACAv), prälimbischer Bereich (PL), infralimbischer Bereich ( ILA), orbitaler Kortex medial, lateral und ventrolateral (ORBm, ORBl und ORBvl). Die Injektionen erfolgten in die ipsilaterale Hemisphäre (also die verletzte Seite des Gehirns). Wir fanden heraus, dass 96,5 % der GFP-markierten Neuronen SST+ waren und nach der Injektion des AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG-Helfervirus und des RVΔG-mCherry-Virus in Cre-Tiere nirgendwo im Gehirn Neuronen markiert wurden ( Ergänzende Abbildung 11). Sowohl bei Kontrolltieren als auch bei hirngeschädigten Tieren befanden sich die Starterzellen fast ausschließlich innerhalb der PFC (Abb. 5c-f). Die regionalen Verteilungen der Starterzellen ähnelten denen, die zuvor für PFC47 veröffentlicht wurden, und es wurden keine Unterschiede zwischen den Gruppen hinsichtlich der dorsal-ventralen Position der Starterneuronen (Abb. 5d; Ergänzende Daten 6) oder der Schichtverteilung (Abb. 5e) festgestellt ), was darauf hindeutet, dass es keine größere Abweichung bei der Position der Starterzellen gab. Wie erwartet gab es eine Korrelation zwischen der Anzahl der Input-Neuronen und der Starter-Neuronen, aber im Gegensatz zum Hippocampus war die Anzahl der Starter-Neuronen bei hirngeschädigten Tieren nicht reduziert (Kontrolle: n = 283,6 ± 69,5 Zellen; TBI: n = 178,8 ±). 18,2 Zellen, P = 0,2, zweiseitiger t-Test, n = 5 Tiere pro Gruppe; Abb. 5g).

a Links: Das gesamte Gehirn wurde mit iDISCO+ gereinigt und auf Neuronen markiert, die Input für PFC-SST-Interneuronen liefern (weiß). Rechts: 100 μm großer sagittaler optischer Schnitt desselben Gehirns, der mit Tollwut markierte Eingangsneuronen an der Injektionsstelle zeigt. b Der in (a) gezeigte umrahmte Bereich ist für Starterzellen (blau) und Eingabeneuronen (rot) gekennzeichnet. C. Schematische koronale Schnitte (100 μm), die einzelne Starterzellen zeigen, die im standardisierten Atlasraum für unverletzte Kontrolltiere und hirngeschädigte Tiere registriert sind. Jede Farbe entspricht einem anderen Tier. Ein Punkt repräsentiert ein Neuron. n = 5 Tiere pro Gruppe. d Gaußsche Kernzelldichtediagramme der Verteilung von Starterneuronen im gesamten Gehirn entlang der dorsal-ventralen Achse. Die graue Schattierung stellt die gepoolte Population dar, wobei einzelne Linien jedes Tier darstellen. e Regionale Verteilung der Starterzellen bei unverletzten Kontrolltieren und hirngeschädigten Tieren. f Anteil der in PFC identifizierten Starterzellen (PL, ACAd, ACAv, MOs, ORBm, ORBvl, ILA). g Lineare Regressionsanalyse für die Anzahl der Starterzellen und präsynaptischen Eingabeneuronen (n = 5 Mäuse pro Gruppe; R2 = 0,95). Maßstabsbalken, 1 mm (a und c), 500 μm (b). Eine Liste der Abkürzungen finden Sie in den Zusatzdaten 2. Siehe auch die Zusatzabbildungen 9 bis 12. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes quantifizierten wir den Input zu SST-Interneuronen in PFC. Die retrograde Verfolgung des gesamten Gehirns ergab Eingaben aus 178 verschiedenen Gehirnregionen (Abb. 6a, ergänzende Abb. 12, 13). Der Großteil der Eingaben wurde im Isokortex nachgewiesen, insbesondere in der ipsilateralen Hemisphäre, gefolgt von Thalamus, Hippocampus und Pallidum. Diese Ergebnisse sind vergleichbar mit früheren retrograden Verfolgungsergebnissen bei Kontrolltieren47,48. Innerhalb des Isocortex lieferten PFC-Subregionen den wichtigsten Input; Der agranuläre Inselbereich und der Hippocampusbereich CA1 lieferten ebenfalls wichtige Beiträge. Die Analyse der Eingabewahrscheinlichkeit entlang der AP-Achse zeigte einen signifikanten Anstieg des Prozentsatzes der Eingabeneuronen zwischen 3,2 und 3,4 mm auf der PFC-Ebene bei hirngeschädigten Tieren (unverletzte: 9,14 ± 1,14 %, TBI: 12,06 ± 1,41 %, P = 4,82E-03; Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Bonferronis Post-hoc-Test; Ergänzende Daten 7). Entlang der medial-lateralen (ML) Achse konnten wir einen signifikant höheren Anteil an Eingabeneuronen zwischen 0,2 und 0,5 mm lateral zur Mittellinie in der ipsilateralen Hemisphäre feststellen (5,9–6,0 mm, unverletzt: 8,37 ± 1,38 %, TBI: 11,38 ± 1,69 %, P = 9,09E-07; 6,0–6,1 mm, unverletzt: 10,20 ± 1,12 %, TBI: 13,35 ± 0,81 %, P = 2,08E-07; 6,1–6,2 mm, unverletzt: 8,94 ± 0,61 %, TBI: 11,90 ± 1,24 %, P = 1,68E-06; Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Bonferronis Post-hoc-Test; Ergänzende Daten 7) und ein signifikant geringerer Anteil an Eingabeneuronen wurden zwischen 0,4 und 0,5 mm lateral zur Mittellinie in der kontralateralen Hemisphäre gefunden (5,2 bis 5,3 mm, unverletzt: 3,22 ± 0,34 %, TBI: 1,35 ± 0,32 %, P = 3,51E-02; Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen und Bonferronis Post-hoc-Test; Abb. 6b, Ergänzende Daten 7). Es gab einen signifikanten Rückgang des Gesamtprozentsatzes des kontralateralen Inputs zu SST-Interneuronen nach TBI (Abb. 6c), ähnlich wie wir es im Hippocampus beobachteten. Es wurden jedoch keine Unterschiede im mittleren Abstand der Eingabeneuronen zum Schwerpunkt der Starterzelle (Abb. 6d) oder im Gesamtprozentsatz der Eingabeneuronen außerhalb des ipsilateralen PFC festgestellt (Abb. 6e).

a Schematische koronale Schnitte (100 μm), die einzelne Input-Neuronen zeigen, die im standardisierten Atlasraum für unverletzte Kontrolltiere (blau) und hirnverletzte Tiere (rot) registriert sind. Ein Punkt repräsentiert ein Neuron. n = 5 Tiere pro Gruppe. b Gaußsche Kernzelldichtediagramme der Verteilung der Eingangsneuronen im gesamten Gehirn entlang der anterior-posterioren (AP) und medial-lateralen (ML) Achse. Die graue Schattierung stellt die gepoolte Population dar, wobei einzelne Linien jedes Tier darstellen. Bregma, 5,3 mm; Mittellinie: 5,7 mm. c Anteil der Input-Neuronen in der kontralateralen Hemisphäre. Unverletzt: 14,00 ± 1,02 %; TBI: 8,22 ± 0,98 %; n = 5 Mäuse pro Gruppe; **P = 3,41E-03; zweiseitiger t-Test. d Quantifizierung des durchschnittlichen euklidischen Abstands zwischen dem Schwerpunkt der Starterzelle und den Positionen der Eingabeneuronen. n = 5 Tiere pro Gruppe. e Anteil der Eingabeneuronen, die außerhalb des ipsilateralen PFC gefunden wurden. n = 5 Tiere pro Gruppe. f Anteil des Gesamtinputs, der aus hochrangigen Gehirnregionen stammt. ***P = 2,84E-06, unverletzt vs. TBI (IsoCTX, kontralateral), ***P = 4,46E-10, unverletzt vs. TBI (IsoCTX, ipsilateral), ***P = 4,12E-05, unverletzt vs TBI (TH, ipsilateral); n = 5 Mäuse pro Gruppe; Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Bonferronis Post-hoc-Test. g Anteil des gesamten präsynaptischen Inputs, der aus Thalamusbereichen stammt. ***P = 1,16E-11, unverletzt vs. TBI (ATN, ipsilateral), *P = 4,46E-02, unverletzt vs. TBI (VENT, ipsilateral); n = 5 Mäuse pro Gruppe; Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Bonferronis Post-hoc-Test. h Heatmap, die den Anteil der Input-Neuronen zeigt, die in allen einzelnen Hirnregionen identifiziert wurden, die PFC innervieren. ***P = 1,00E-15, unverletzt vs. TBI (ACAd, ipsilateral), ***P = 1,00E-15, unverletzt vs. TBI (ILA, ipsilateral), ***P = 1,00E-15, unverletzt vs TBI (ORBm, ipsilateral), *P = 1,25E-02, unverletzt vs. TBI (ORBvl, ipsilateral), ***P = 1,00E-15, unverletzt vs. TBI (PL, ipsilateral), ***P = 1,18E -04, unverletzt vs. TBI (PL, kontralateral), ***P = 1,07E-05, unverletzt vs. TBI (AM, ipsilateral); n = 5 Mäuse pro Gruppe; Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Bonferronis Post-hoc-Test. Fehlerbalken, sem; Maßstabsbalken, 1 mm. Eine Liste der Abkürzungen finden Sie in den Zusatzdaten 2. Siehe auch Ergänzende Abbildungen. 12 bis 14, Zusatzdaten 7 bis 9 und Zusatzfilme 3 und 4. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Input-Neuronen wurden zunächst nach großen Funktionsbereichen gruppiert, d. h. Isocortex, Riechbereiche, Hippocampus-Formation, kortikale Unterplatte, Striatum, Pallidum, Thalamus, Hypothalamus, Mittelhirn und Hinterhirn. Bei hirngeschädigten Tieren stellten wir fest, dass SST-Interneuronen in PFC im Vergleich zu Kontrollen einen signifikant höheren Prozentsatz des Gesamtinputs vom ipsilateralen Isocortex erhielten, der Prozentsatz der Inputneuronen im kontralateralen Isocortex und im ipsilateralen Thalamus jedoch beide verringert war (Abb. 6f; Ergänzung). Daten 8). Im Thalamus zeigten die vorderen Thalamuskerne (ATN) und die ventrale Gruppe des dorsalen Thalamus (VENT) nach TBI einen signifikant geringeren Anteil an Eingabeneuronen (Abb. 6g). Eine Gesamthirnanalyse der Input-Neuronen in allen einzelnen Gehirnbereichen ergab, dass sechs der sieben Bereiche mit verändertem Input nach TBI im Isocortex lagen (Abb. 6h). Bemerkenswert ist, dass nicht alle PFC-Regionen in der ipsilateralen Hemisphäre einen signifikant höheren Anteil an Eingabeneuronen aufwiesen; Der Input von ACAd und ORBvl war nach TBI beide deutlich reduziert. Der Anteil des Inputs durch kontralaterale PL war nach TBI ebenfalls reduziert. Ähnliche Ergebnisse wurden durch Analyse des Konvergenzindex für jedes Tier erhalten (Ergänzende Abbildung 14; Ergänzende Daten 9). Dieses Muster aus verbesserter lokaler Konnektivität und reduzierter Ferneingabe ähnelt dem, was wir im hirnverletzten Hippocampus beobachtet haben, was darauf hindeutet, dass selbst in Hirnregionen, die sehr weit von der Verletzungsstelle entfernt sind, die topografische Organisation hemmender Neuronen nach einem fokalen Gehirn dramatisch neu verdrahtet wird Verletzung.

Transplantate embryonaler Interneuron-Vorläufer ermöglichen eine robuste Wiederherstellung der Hemmung und sind therapeutisch bei einem breiten Spektrum erworbener Hirnerkrankungen, einschließlich Epilepsie49, Alzheimer-Krankheit50 und SHT51. Die Kreislaufgrundlage dieser Regeneration ist jedoch unbekannt. Daher haben wir getestet, ob Interneuron-Vorläufer in der Lage sind, in einem geschädigten Gehirn geeignete lokale und weitreichende Verbindungen herzustellen. Zu diesem Zweck haben wir GABA-Vorläufer aus der medialen ganglionären Eminenz (MGE) geerntet, dem Entwicklungsursprung fast aller SST-exprimierenden kortikalen Interneurone6. Dann, 7 Tage nach TBI, transplantierten wir 3 × 104 MGE-Zellen in den ipsilateralen Hippocampus von C57BL/6 J-Mäusen im Epizentrum der Verletzung. Dies entspricht dem Zeitraum maximaler Deafferenzierung nach TBI52. Wir untersuchten zunächst Transplantate von SST-Interneuronen, die aus mit Ai6-Reporter gekreuzten E13.5 SST-Cre-Spendermäusen entnommen wurden, um deren Visualisierung nach der Transplantation zu ermöglichen. 35 Tage nach der Transplantation (DAT) wurden transplantierte Interneurone in allen Unterfeldern des Hippocampus gefunden (n = 3 Tiere) (Abb. 7a, b, ergänzende Abb. 15). Die Mehrheit der Ai6-markierten Zellen exprimierte SST (83 ± 2,1 %, Abb. 7c), was die selektive Cre-Expression in der SST-Population transplantierter MGE-Zellen bestätigt.

a Links: Koronaler Abschnitt des dorsalen Hippocampus fünf Wochen nach der Transplantation, markiert für Ai6-exprimierende transplantierte Interneurone (gelb) und DAPI (blau). Repräsentatives Tier von n = 3 Mäusen. Maßstabsleiste, 1 mm. Rechts: Ai6-exprimierende Neuronen (gelb), co-markiert für Somatostatin (magenta). Maßstabsbalken, 100 μm. b Verteilung der transplantierten SST-Interneuronen 35 DAT, n = 3 Mäuse. c Anteil der Ai6-exprimierenden Zellen, die Somatostatin exprimierten, n = 3 Mäuse. Fehlerbalken, sem Siehe auch ergänzende Abbildung 15. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Als nächstes führten wir eine Kartierung des gesamten Gehirns durch, um lokale und weitreichende Eingaben zu transplantierten SST-Interneuronen im verletzten Gehirn zu identifizieren. Für diese Experimente wurden Spenderzellen aus SST-Cre+-Embryonen gewonnen, die den Ai6-Reporter nicht enthielten. Transplantationen wurden 7 Tage nach TBI durchgeführt, Virusinjektionen wurden in den Hippocampus 8 Wochen (AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-eGFP-2A-oG) und 11 Wochen (RVΔG-mCherry) nach der Verletzung durchgeführt und die Tiere wurden verarbeitet zur Gehirnreinigung und -analyse 7 Tage nach der letzten Virusinjektion. Dieser Zeitraum entspricht einer Zeit, in der die MGE-Transplantation starke therapeutische Wirkungen auf das Gedächtnis und Anfälle bei hirngeschädigten Tieren zeigt51. Wir fanden eine beträchtliche Anzahl von Eingabeneuronen im gesamten Gehirn, die mit dem Tollwutvirus markiert waren (Abb. 8a-c). Bemerkenswerterweise wurden Input-Neuronen in 14 verschiedenen Gehirnbereichen identifiziert, einschließlich aller Regionen des Hippocampus, ENTm, ENTl, des medialen Septums und der NDB (Abb. 8c – f, ergänzende Abb. 16). Der Großteil der Eingaben kam vom Hippocampus, einschließlich robuster Eingaben aus den Bereichen CA3 und CA1. Dieses Muster der lokalen Eingabe ähnelte dem, was wir bei hirngeschädigten Tieren beobachteten, die keine Transplantate anstelle von Kontrollen erhielten (ergänzende Abbildung 17). Um festzustellen, ob regionale Eingaben kovariieren, haben wir die Pearson-Korrelationskoeffizienten für jedes Paar von Eingaberegionen berechnet. Dies zeigte eine signifikante positive Korrelation zwischen mehreren Eingaberegionen, einschließlich CA1, CA2, magnozellulärem Kern (MA), Prosubiculum (ProS), Subiculum (SUB) und perirhinalem Kortex (PERI), was darauf hindeutet, dass transplantierte Neuronen Eingaben aus einer Region erhalten erhielten im Allgemeinen Eingaben aus den anderen korrelierten Regionen (Abb. 8g). So erhielten transplantierte SST-Interneuronen orthotope Inputmuster, transplantierte Zellen zeigten jedoch einen verstärkten lokalen Input, der nach TBI beobachtet wurde.

a Ein 100 μm großer sagittaler optischer Schnitt des Gyrus dentatus, markiert für transplantierte Zellen (blau) und Input-Neuronen (orange). Weiße Pfeile, Starterzellen. h, hilus; gcl, Körnerzellschicht; ml, molekulare Schicht. b Links: Gesamthirndarstellung der gesamten ipsilateralen Hemisphäre desselben in (a) gezeigten Tieres, markiert für Eingabeneuronen (weiß). Der gepunktete Kreis markiert die Verletzungsgrenze über dem Hippocampus (HIP). Rechts: Gesamthirndarstellung mit Eingabeneuronen im oberen zentralen Nucleus raphae (CS), im medialen Septum (MS) und im Diagonalband-Nucleus (NDB). Repräsentatives Tier aus n = 5 Mäusen. c Schematische koronale Schnitte (250 μm), die einzelne Starterzellen (rot) und Eingabeneuronen (blau) zeigen, die im standardisierten Atlasraum registriert sind. Ein Punkt repräsentiert ein Neuron. n = 5 Tiere. d Maximalintensitätsprojektionen (100 μm) von Neuronen, die den transplantierten SST-Interneuronen im intakten verletzten Gehirn Input liefern. Repräsentative Tiere aus n = 5 Mäusen. e Oben: Anteil der transplantierten Starterzellen in jeder Schicht des Hippocampus. Unten: Blasendiagramm von Gehirnbereichen, die Tollwut-markierte Input-Neuronen enthalten. f Gaußsches Kernzelldichtediagramm der Verteilung der Eingangsneuronen im gesamten Gehirn entlang der anterior-posterioren Achse. Die graue Schattierung stellt die gepoolte Population dar, wobei einzelne Linien jedes Tier darstellen. g Korrelationsmatrix des Inputs zu transplantierten SST-Interneuronen. Größe und Farbe, Korrelationskoeffizient. *P < 0,05, genaue P-Werte werden in der Quelldatendatei bereitgestellt; zweiseitige Pearson-Korrelation. Maßstabsbalken, 100 μm (a, g), 1 mm (b, c). Eine Liste der Abkürzungen finden Sie in den Zusatzdaten 2. Siehe auch die Zusatzabbildungen 16 und 17, Quelldaten und Zusatzfilm 5. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Unter Verwendung eines Mausmodells für fokale TBI berichten wir über eine systematische Bewertung der groß angelegten Umstrukturierung von Schaltkreisen in einem geschädigten Gehirn. Wir haben den hirnweiten Input auf einen einzelnen Zelltyp mit hoher therapeutischer Relevanz, SST-Interneuronen, bei unverletzten Kontrollpersonen, nach Hirnverletzungen und nach Transplantation in hirnverletzte Tiere abgebildet. Unsere Daten zeigen, dass überlebende SST-Interneuronen nach einer Schädel-Hirn-Trauma neuen lokalen Input erhalten, jedoch weitgehend von entfernten Hirnregionen abgekoppelt sind. Dies geschah an zwei räumlich unterschiedlichen, aber interagierenden Hirnregionen: an der Verletzungsstelle im Hippocampus und weit entfernt von der Verletzung bei PFC, das durch TBI nicht direkt geschädigt wurde. Unsere Beobachtung der Umstrukturierung des Schaltkreises weit entfernt von der Verletzung war unerwartet, da PFC nicht direkt durch TBI beschädigt wurde und Ergebnisse aus Silberfärbungsexperimenten darauf hindeuten, dass interhemisphärenprojektive Projektionen nicht degenerieren46. Daher ist die Neuverdrahtung posttraumatischer Schaltkreise nicht nur auf geschädigte Bereiche beschränkt, sondern findet als Reaktion auf eine fokale Verletzung im gesamten Gehirn statt. Wir zeigen weiterhin, dass die verminderten Fernverbindungen nicht auf Zellverlust in entfernten Hirnregionen oder eine allgemeine Verringerung der Axonkollateralen zurückzuführen sind, die in den beschädigten Hippocampus hineinragen. Transplantierte SST-Interneuronen integrierten sich stabil in den hirngeschädigten Hippocampus und erhielten lokale und weitreichende Wirtseingaben, die den Verbindungen einheimischer Interneuronen ähnelten. Dies steht im Einklang mit früheren Ex-vivo-Funktionsstudien, die einen robusten erregenden Antrieb auf transplantierte Interneurone vom Wirtsgehirn 49,51,52 dokumentieren, obwohl die Quelle dieser Eingaben bisher unbekannt war.

TBI führt zu erheblichen strukturellen und funktionellen Veränderungen in den neuronalen Schaltkreisen, die auf eine fortschreitende Hirnschädigung und sekundäre Neuroplastizitätsreaktionen zurückzuführen sind, die sich im Laufe der Zeit entwickeln53,54. Bis vor kurzem beschränkte sich unser Verständnis darüber, wie TBI den Schaltplan des Gehirns schädigt, auf Standardansätze der Neuroanatomie und der Schichtelektrophysiologie. Diese Studien zeigen, dass Hauptneuronen nach TBI eine anfängliche Deafferentierung erfahren, möglicherweise aufgrund des Verlusts von Eingangsneuronen53,54,55,56. Darauf folgt ein fortschreitender Anstieg der Anzahl synaptischer Kontakte und die Bildung neuer erregender Schaltkreise in verletzten Bereichen des Gehirns54,57,58,59,60,61,62. Der erregende Antrieb auf hippocampale SST-Interneuronen, die normalerweise nur spärlichen Input von lokalen Hauptneuronen erhalten, ist nach einer Hirnverletzung ebenfalls erhöht24. Schichtaufzeichnungen beschränken sich jedoch auf die Auflösung funktioneller Verbindungen einiger weniger Neuronen innerhalb lokaler Schaltkreise, da diese chirurgisch von afferenten Eingaben über große Entfernungen isoliert sind. Durch die umfassende Kartierung gehirnweiter Eingaben zu SST-Interneuronen mit zellulärer Auflösung fanden wir eine signifikante Verstärkung lokaler Eingabeneuronen zu hilären SST-Interneuronen nach TBI, in Übereinstimmung mit früheren elektrophysiologischen Schnittstudien. Darüber hinaus haben wir bisher unbekannte Eingabequellen in Kontrollen identifiziert, beispielsweise einen Rückprojektionsweg von CA1 zu hilären SST-Interneuronen, der nach TBI verstärkt wird. Bemerkenswerterweise sind CA1-Interneuronen auch in der Lage, in Temporallappenepilepsiemodellen auf den Gyrus dentatus zu projizieren25, diese Zellen innervieren jedoch hauptsächlich Körnerzellen.

Frühere Studien zur funktionalen Konnektivität gehen davon aus, dass TBI das Gehirn von einer Small-World-Architektur wegbewegt, die als dicht verbundene lokale Netzwerke definiert ist, die durch spärliche weitreichende Eingaben verbunden sind und diskrete Gehirnbereiche verbinden63. In Übereinstimmung mit diesem Konzept ist die interhemisphärische fMRT-Konnektivität im Ruhezustand nach TBI reduziert64, möglicherweise eine Folge einer diffusen axonalen Schädigung63, und es kommt zu einem vorübergehenden Anstieg der Hyperkonnektivität lokaler Netzwerke, die im Allgemeinen mit der Zeit schwächer wird65. Obwohl diese Methoden für allgemeine Hypothesen zur Gehirnkonnektivität nützlich sind, sind sie nicht in der Lage, eine genaue strukturelle Grundlage für Schaltkreisstörungen bei TBI zu identifizieren und werden wahrscheinlich überproportional von erregenden Neuronen beeinflusst. Unsere Schaltkreiszuordnungsdaten stimmen auf Zelltypebene nicht vollständig mit dieser Idee überein. Sowohl im Hippocampus als auch im PFC stellten wir fest, dass die wichtigsten Quellen für Ferninputs zu SST-Interneuronen, einschließlich Inputs von der kontralateralen Hemisphäre, nach fokaler TBI verringert waren, lokale Verbindungen jedoch chronisch zunehmen. Somit kann TBI die Kleinheit hemmender Schaltkreise dauerhaft verbessern, indem es die lokalen Netzwerkverbindungen erhöht und den Input über große Entfernungen spärlicher macht. Es gibt Unterstützung für diese Idee durch Studien zur funktionalen Konnektivität des Menschen66.

Nach CCI46 liegt eine offensichtliche Axonschädigung vor, die sich wahrscheinlich auf den weitreichenden Input zum Hippocampus auswirkt. Wir können die Möglichkeit nicht ausschließen, dass ein Teil der strukturellen Reorganisation, die wir nach einer Schädel-Hirn-Trauma beobachteten, durch eine Schädigung der Bahnen der weißen Substanz beeinflusst wird. Allerdings kann eine Axonschädigung allein die weitreichenden Schaltkreisveränderungen, die wir bei hirngeschädigten Tieren beobachteten, nicht vollständig erklären. Im Hippocampus fanden wir eine etwa 4-fache Reduktion des Ferninputs zu SST-Interneuronen, die nicht mit einem Zellverlust in entfernten Hirnregionen oder deren Projektionen im Hippocampus (z. B. CHAT+Afferenten) einherging. Dies deutet darauf hin, dass die Eingaberegionen nicht durch einen allgemeinen Verlust von Eingabeneuronen oder eine Axotomie von den SST-Interneuronen getrennt werden. Vielmehr können Eingaben zelltypspezifisch hinzugefügt oder entfernt werden. Es ist möglich, dass Afferenzen mit großer Reichweite durch CCI selektiv geschädigt werden, ansonsten aber intakt bleiben. Es ist beispielsweise bekannt, dass TBI die axonalen Transportmechanismen stört67, und dies könnte den retrograden Transport von Tollwut in weitreichende präsynaptische Eingabeneuronen unverhältnismäßig beeinträchtigen. Unser Befund, dass transplantierte Interneurone überhaupt in der Lage sind, Fernverbindungen aufzubauen, legt jedoch nahe, dass das Potenzial zum erneuten Wachstum dieser verminderten Eingaben bei allen hirngeschädigten Tieren erhalten blieb. Wir fanden bei PFC einen ähnlichen Anstieg des lokalen Inputs und einen Rückgang des Fern-Inputs zu SST-Interneuronen. Im Gegensatz zum Hippocampus werden diese Vorsprünge nach CCI nicht direkt beschädigt und degenerieren nicht46. Von besonderem Interesse ist der anteromediale Thalamus, der nach TBI der einzige Thalamusbereich mit veränderten Inputneuronen war. Der vordere Thalamus (ATN, bestehend aus anteromedialen, anteroventralen und anterodorsalen Unterteilungen) stellt einen subkortikalen Schaltkreis zur Verfügung, der das Gedächtnis und die räumliche Navigation unterstützt68, Verhaltensweisen, die in TBI-Modellen an Nagetieren stark beeinflusst werden. Es ist möglich, dass übermäßige Aktivität im geschädigten Hippocampus zu nachgeschalteten Veränderungen des PFC führen könnte (z. B. über den Hippocampus-ATN-PFC-Kreislauf). Alternativ sind Anfälle in diesem Verletzungsmodell gut dokumentiert und könnten zu einer Neuorganisation der Schaltkreise im gesamten Gehirn führen. Dennoch deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass fokale TBI zu einer weit verbreiteten Neuzuordnung von Eingängen zu SST-Interneuronen im gesamten Gehirn führt, unabhängig davon, ob eine direkte Verletzung oder ein Zellverlust vorliegt.

Da im geschädigten Hippocampus weitaus weniger hemmende Neuronen vorhanden sind, stellt TBI außerordentliche Anforderungen an überlebende Interneuronen. Es gibt drei physiologische Merkmale von SST-Interneuronen, die erklären könnten, warum ein Verlust des Fernimpulses eine kompensatorische Reaktion auf Schäden widerspiegeln könnte. Erstens erhalten SST-Interneuronen einen stark fördernden erregenden synaptischen Input und verfügen über andere Membraneigenschaften, die es diesen Zellen ermöglichen, durch einen Hochfrequenzstoß von nur einem präsynaptischen Neuron aktiviert zu werden69,70. Im Hippocampus kann die Gewinnung von Input von lokalen Hauptneuronen und der Verlust von ENTm-Input dazu beitragen, die lokale Netzwerkaktivität nach TBI71 zu stabilisieren. Zweitens kann eine durch Muskarinsäure vermittelte Depolarisation zu einem längeren Anstieg der SST-Interneuronen führen72. Angesichts der reichhaltigen lokalen Innervationen nach TBI könnte der Verlust des CHAT-Inputs aus dem basalen Vorderhirn eine Strategie zum Ausgleich des erregenden Antriebs für diesen wichtigen Zelltyp im verletzten Gehirn widerspiegeln. Drittens kann sogar ein einzelnes Dendriten-Targeting-Interneuron die Spike-Erzeugung in kortikalen Hauptneuronen kontrollieren7. Somit könnte eine Verschiebung von der Vorwärtskopplung zur Rückkopplungshemmung an Dendriten – durch den Verlust von weitreichenden Eingaben und verstärkten lokalen Rückprojektionen – eine mögliche Strategie widerspiegeln, um die Eingabeintegration zu steuern und die spärliche Aktivierung von Körnerzellen des Zahnfleisches aufrechtzuerhalten, die das Gedächtnis ermöglichen und verhindert Anfälle73,74. Alternativ kann ein erhöhter lokaler Input SST-Interneuronen synchronisieren, pathologische Aktivitätsmuster unterstützen oder die Koordination zwischen einzelnen Gehirnbereichen behindern. Um diese Möglichkeiten zu klären, sind weitere Arbeiten erforderlich, die In-vivo-Neurophysiologie mit selektiver Manipulation von Hippocampus-Zelltypen kombinieren.

Die Fähigkeit transplantierter SST-Interneuronen, sich strukturell in den beschädigten Hippocampus einzubauen, war angesichts der dramatischen Neuorganisation der Hemmkreise im gesamten verletzten Gehirn bemerkenswert. Obwohl die Konnektivität zwischen Wirt und Spenderzelle umfassend dokumentiert wurde75,76, ist der genaue anatomische Input für einzelne Neuronentypen nicht vorhanden. Die Zelltypspezifität ist ein wichtiger Gesichtspunkt, insbesondere für das Verständnis der Schaltkreise von Krankheiten. Trotz massiver reaktiver Plastizität im geschädigten Gehirn stellten wir fest, dass transplantierte Interneurone einen hochgradig orthotopischen Input erhalten, der eher zelltypspezifisch als regionalspezifisch ist. Wir schlagen vor, dass die positiven Auswirkungen der Interneurontransplantation, die in verschiedenen präklinischen Krankheitsmodellen beobachtet wurden, auf der präzisen Integration von Interneuronvorläufern in die Schaltkreise des Wirtshirns beruhen. Diese Ansicht wird durch eine Vielzahl von Beweisen gestützt, die belegen, dass die allgemeine Struktur und Funktion transplantierter Interneurone ihren einheimischen Gegenstücken stark ähnelt49,51,52,77,78,79 sowie kürzlich erfolgte DREADD-Inaktivierung und VGAT-Funktionsverlust Studien belegen, dass therapeutische Wirkungen mit der elektrophysiologischen Integration der transplantierten Interneurone verknüpft sind51,80. Eine alternative Sichtweise legt nahe, dass Interneuronvorläufer nur schwache Kontakte mit dem Gehirn des Wirts herstellen81 und indirekt wirken, indem sie Verjüngungsfaktoren freisetzen, die die Schaltkreise des Wirtshirns modifizieren82. Detaillierte elektrophysiologische Studien berichten jedoch durchweg über starke synaptische Verbindungen51,52,83,84 und es müssen noch direkte Beweise für eine Verjüngung des Schaltkreises gefunden werden. In der aktuellen Studie konnten wir synaptische Verbindungen zwischen transplantierten Interneuronen nicht direkt testen, da es nicht möglich war, Starterzellen von AAV-markierten SST-Neuronen zu unterscheiden, die Tollwut über retrograden Transport erhalten hatten. Allerdings handelte es sich bei der großen Mehrheit der lokalen Eingabeneuronen um mutmaßliche Hauptneuronen und nicht um hemmende Neuronen (basierend auf Morphologie und laminarer Lage). Dies steht im Einklang mit einer umfangreichen Literatur zur MGE-Transplantation unter Verwendung von EM-Ultrastrukturanalyse, Neuroanatomie und Patch-Clamp-Elektrophysiologie, die zeigt, dass die meisten synaptischen Verbindungen mit Hauptzellen des Wirtshirns bestehen51,52,77,81,82,83,84,85.

Das Muster der Neuverdrahtung synaptischer Schaltkreise nach TBI ist komplex. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass fokale Hirnschäden die Hemmkreise auf globaler Ebene neu organisieren. Wir gehen davon aus, dass dieser experimentelle Ansatz als nützlicher Rahmen für die Betrachtung von Ganzhirnanalysen von Netzwerkdysfunktionen bei TBI und damit verbundenen Hirnstörungen dienen wird.

Alle Tierversuche wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University Laboratory Animal Resources an der University of California, Irvine durchgeführt und befolgten die Richtlinien der National Institutes of Health für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die Experimente wurden an erwachsenen Mäusen beiderlei Geschlechts durchgeführt, die in Standardhaltungsbedingungen mit einem 12-stündigen Licht-/Dunkelzyklus gehalten wurden und Futter und Wasser nach Belieben zur Verfügung gestellt wurden. Für die Quantifizierung von SST-Zellen verwendeten wir GIN-Mäuse, die auf einem FVB-Hintergrund gehalten wurden (Jax-Best.-Nr.: 003718). Für die Verfolgung des Tollwutkreislaufs verwendeten wir Sst-IRES-Cre-Mäuse, die auf einem C57BL/6 J-Hintergrund gehalten wurden (Jax-Best.-Nr.: 018973). Wir verwendeten C57BL/6 J-Mäuse (Jax Best.-Nr.: 000664) für Fluorjade-C-Experimente. Für Zelltransplantationen wurde embryonales Spendergewebe durch Kreuzung von Sst-IRES-Cre-J-Mäusen mit C57BL/6-J-Mäusen (Jax-Best.-Nr.: 000664) oder Ai6-ZsGreen-Reportermäusen (Jax-Best.-Nr.: 007906) hergestellt; Wirtsmäuse waren C57BL/6 J-Mäuse (Jax-Best.-Nr.: 000664).

Die Experimente wurden an männlichen und weiblichen Wurfgeschwistern zwischen P55 und P139 durchgeführt. Nach dem Absetzen wurden die Tiere kodiert und zufällig in unverletzte (naive Kontrolle), TBI- oder MGE-injizierte Behandlungsgruppen eingeteilt. Hirngeschädigte Mäuse und gleichaltrige Kontrolltiere wurden zusammen gehalten (2–5 Tiere pro Käfig) in einem Temperatur- (21–22 °C), Luftfeuchtigkeits- (40–51 %) und Licht-Zyklus (12 Stunden Licht:Dunkel). ) kontrolliertes Vivarium. Die Reihenfolge von Verletzung, Virusinjektion und Zelltransplantation wurde ebenfalls randomisiert. Eine Verblindung war aufgrund des Vorliegens einer Verletzung in der TBI-Behandlungsgruppe nicht möglich. CHAT-Immunfärbungsexperimente wurden unter Verwendung einer separaten, unabhängigen Kohorte aus Kontrolltieren und hirngeschädigten Tieren wiederholt. Es wurden keine weiteren Replikationsstudien durchgeführt.

Bei P5518 wurde eine CCI-Verletzung an erwachsenen männlichen und weiblichen Mäusen durchgeführt. Kurz gesagt, Mäuse wurden durch Inhalation von 2 % Isofluran anästhesiert und in einen maßgeschneiderten stereotaktischen Rahmen gebracht. Der Schädel wurde durch einen Mittellinienschnitt freigelegt und eine 4–5 mm lange Kraniotomie wurde etwa 1 mm seitlich der Sagittalnaht und mittig zwischen Bregma und Lambda durchgeführt. Die Schädeldecke wurde entfernt, ohne die darunter liegende Dura zu beschädigen. Das Kontusionsgerät bestand aus einem computergesteuerten, pneumatisch angetriebenen Impaktor, der mit einer abgeschrägten Spitze aus rostfreiem Stahl mit einem Durchmesser von 3 mm ausgestattet war (Precision Systems and Instrumentation; TBI-0310). Mithilfe dieses Geräts wurde eine Hirnverletzung zugefügt, bei der der Kortex mit einer Geschwindigkeit von 3,5 m s−1 und einer Dauer von 500 ms bis zu einer Tiefe von 1,0 mm komprimiert wurde. Der Einschnitt wurde vernäht, ohne die Schädeldecke zu ersetzen, und das Tier konnte sich auf einem Heizkissen erholen. Eine qualitative postoperative Gesundheitsbeurteilung wurde 7 Tage lang nach TBI täglich und danach in regelmäßigen Abständen durchgeführt. Alle operierten Tiere wurden zum Zeitpunkt der Operation und 24 Stunden später mit Buprenorphinhydrochlorid (Buprenex; 0,05 mg/kg, ip verabreicht) behandelt. Alle hirngeschädigten Mäuse überlebten und blieben bis zum Tag des Experiments ansonsten gesund.

AAV8-hSyn-FLEX-TVA-P2A-GFP-2A-oG mit einem Titer von 1,2 × 1013 Genomkopien/ml wurde von der GT3 Core Facility des Salk Institute erhalten und auf einen Titer von 2,4 × 1011 Genomkopien/ml verdünnt Sterilisieren Sie vor der Verwendung 0,9 % NaCl, um Beeinträchtigungen der Rückverfolgungsleistung zu vermeiden86. RVΔG-mCherry wurde wie zuvor beschrieben87 mit einem Titer von 5 × 109 infektiösen Einheiten/ml hergestellt. Das Virus wurde von vorne in abgeschrägte Glasmikropipetten (40 μm Spitzendurchmesser, Wiretol 5 μl, Drummond Scientific) geladen und mit einer Geschwindigkeit von 15 nL min–1 in die Gehirne erwachsener unverletzter Kontrollmäuse und hirnverletzter Mäuse injiziert, wobei die Nadel an Ort und Stelle belassen wurde für 5 Minuten vor dem Zurückziehen. Zielkoordinaten wurden zunächst in einer Reihe vorläufiger Injektionsstudien an Kontrollmäusen und hirnverletzten Mäusen überprüft, um ideale Zielorte (z. B. Hilus) sowie den Titer und das Volumen des Virus zu bestimmen, das in Hilus oder PFC abgegeben werden könnte, ohne in nahegelegene Regionen zu gelangen. AAV-Injektionen (200 nL) wurden in den Hilus des Gyrus dentatus bei den folgenden stereotaktischen Koordinaten durchgeführt: anterior-posterior (AP) –2,0 mm, medial-lateral (ML) 1,30 mm, dorsal-ventral (DV) –1,9 mm. In einer separaten Tierkohorte wurden Injektionen in den prälimbischen Kortex vorgenommen: AP 1,8 mm, ML 0,35 mm und DV –1,4 mm. RVΔG-mCherry (100 nL) wurde 3 Wochen später an derselben Stelle injiziert.

Mäuse wurden transkardial mit 0,1 M PBS perfundiert, das 1 µL/ml 10 mg/ml Heparin-Natrium (Serva Kat.-Nr. 24590.01) enthielt, gefolgt von 4 % PFA in 0,1 M PBS. Die Proben wurden über Nacht in 4 % PFA in 0,1 M PBS nachfixiert. Nachfolgende Schritte wurden in 5-ml-Zentrifugenröhrchen (Eppendorf Kat.-Nr. 0030119401) durchgeführt, wobei jeder Lösung 0,01 % Natriumazid zugesetzt wurde. Zunächst wurden die Proben in 10 % 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS, Anatrace, Kat.-Nr. C316S) und 25 % N-Methyldiethanolamin (MDEA, Alfa-Aesar, Kat.-Nr. L15712) entfärbt ) in 0,1 M PBS für 48 h bei 37 °C mit Nutation. Die Proben wurden dann 24 Stunden lang in 0,1 M PBS gewaschen, jeweils 1 Stunde lang in einem Methanol/Wasser-Gradienten (20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 %, 100 %) dehydriert und in 2:1 DCM entfettet: MeOH über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Proben zweimal 4 Stunden lang in 100 % MeOH gewaschen, um DCM:MeOH zu entfernen, und über Nacht bei 4 °C ohne Schütteln in 5 % H2O2 in 80 % MeOH gebleicht. Anschließend wurden die Proben 1 Stunde lang in 60 % MeOH, 40 % MeOH, 20 % MeOH, 0,1 M PBS und PTx.2 rehydratisiert und in 4 M Guanidinhydrochlorid (Alfa-Aesar Kat.-Nr. A13543-30) und 1 % CHAPS inkubiert in 0,1 M PBS für 24 Stunden gewaschen und über Nacht in 0,1 M PBS mit drei Lösungswechseln gewaschen. Als nächstes wurden die Proben in 10 % CHAPS/25 % MDEA in 0,1 M PBS über Nacht bei 37 °C mit Nutation permeabilisiert und in 3 % NDS/10 % DMSO in PTx.2 mit Nutation über Nacht bei 37 °C inkubiert. Primärantikörper-Inkubationen wurden in heparinisiertem 0,1 M PBS mit 0,2 % Tween-20 (PTwH) mit 0,25 % CHAPS, 3 % NDS und Kaninchen-Anti-DsRed (1:1000) und Hühner-Anti-GFP-Antikörpern (1:1000) für 7 durchgeführt Tage bei 37 °C mit Nutation. Die Proben wurden dann über Nacht in PTwH auf einem Orbitalschüttler (115 U/min) bei Raumtemperatur mit fünf Lösungswechseln gewaschen. Das sekundäre Antikörperverdünnungsmittel wurde in PTwH mit 0,25 % CHAPS, Esel-Anti-Kaninchen 546 (1:1000) und Ziegen-Anti-Huhn 647 (1:1000) hergestellt, mit einer Spritze bei 0,2 μm filtriert und vor dem Waschen 7 Tage lang bei 37 °C mit Nutation inkubiert in PTwH über Nacht mit fünf Lösungswechseln und Schütteln bei Raumtemperatur. Am nächsten Tag wurden die Proben in zunehmenden Methanol/Wasser-Gradienten (20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 100 % für jeweils 1 Stunde) dehydriert und über Nacht bei 4 °C in 100 % MeOH ruhen gelassen. Die Proben wurden dann 3 Stunden lang in 2:1 DCM/MeOH gewaschen, gefolgt von zwei 100 % DCM-Waschvorgängen jeweils 15 Minuten lang und über Nacht bei 4 °C in Dibenzylether (DBE) geklärt. DBE wurde vor der Bildgebung zur Anpassung des Brechungsindex vier weitere Male geändert. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für die Immunfärbung des gesamten Gehirns finden Sie unter: https://github.com/roberthuntlab/clearedbrainanalysis.

Geklärte Proben wurden in einem 3D-gedruckten Probenhalter in einer speziell angefertigten Bildgebungskammer mit derselben Menge DBE-Lösung, die für die Brechungsindexanpassung verwendet wurde, montiert und mit einem Zeiss Z1-Lichtblattmikroskop mit Zeiss Zen-Software abgebildet. Die Proben wurden in sagittaler Ausrichtung mit einseitiger Beleuchtung unter Verwendung eines x5/0,1-Beleuchtungsobjektivs und eines x5/0,16-Detektionsobjektivs mit einer Auflösung von 0,91 μm/Pixel und einer Schrittgröße von 4,97 μm abgebildet. Mit mCherry markierte Eingabeneuronen wurden mit einem 561-nm-Laser abgebildet, der an einen 575–625-nm-BP-Filter gekoppelt war. GFP- und Autofluoreszenzkanäle wurden gleichzeitig mit 488-nm- und 638-nm-Laserlinien erfasst, die an 505–545-nm-BP- und 660-nm-LP-Filter gekoppelt waren. Die Laserleistung wurde für alle Laserlinien bei einer Belichtung von 200 ms auf 40 % Intensität eingestellt. Die Fliesenüberlappung wurde auf 8 % eingestellt.

Rohdaten (.czi) wurden mit Imaris File Converter 9.1 (Bitplane) in das hierarchische Format (.ims) konvertiert. Die 561-nm-Kanaldaten wurden in jeder Dimension um den Faktor zwei heruntergerechnet und mithilfe benutzerdefinierter Python-Skripte als Numpy-Arrays (.npy) exportiert. Einzelne Fliesen wurden mit WobblyStitcher88 nicht starr zusammengenäht. Zusammengefügte Arrays wurden als TIF-Serie exportiert, wobei für jedes Tier ein Hintergrundsubtraktionswert ermittelt wurde. Einzelne Zellpositionen wurden manuell mit cellfinder33 kommentiert. Bildstapel wurden auf eine Auflösung von 10 μm heruntergerechnet und mithilfe von brainreg, einer Python-Portierung von aMAP90, im Allen Reference Atlas89 registriert. Atlasgrenzen wurden auf das ursprüngliche hochauflösende Bild in Bild J hochgerechnet und Bildebenen mit Zellen wurden auf Genauigkeit überprüft. Um den Registrierungsfehler des gesamten Gehirns zu korrigieren, wurden Paare von Korrespondenzpunkten manuell dort markiert, wo Atlasgrenzen von anatomischen Orientierungspunkten abweichen. Die durchschnittliche Vektorlänge wurde berechnet und die mit Anmerkungen versehenen Zellpositionen wurden basierend auf der Vektorlänge des Korrespondenzpunkts linear transformiert. Schematische Darstellungen der anatomischen Position von Starterzellen und Eingabeneuronen wurden mit Brainrender32 aufgezeichnet. Koronale Atlasplatten wurden an ausgewählten Positionen entlang der vorderen/hinteren Achse und einzelnen Zellpositionen ± 125 μm (Hippocampus-Verfolgung) oder ± 50 μm (PFC-Verfolgung) zur ausgewählten Atlasplatte gerendert.

Die registrierten Zellpositionen für jedes Tier wurden mit cellfinder33 zusammengefasst. Die Zellzahlen wurden für laminierte kortikale Strukturen kombiniert. Ipsilaterale und kontralaterale Zellzahlen wurden als separate Regionen analysiert. Bei einer unverletzten Kontrolle (Hippocampus-Injektion) wurde eine kleine Anzahl tollwutmarkierter Zellen in der Nähe des Injektionstrakts im darüber liegenden Neocortex gefunden. Diese Zellen wurden von der Analyse ausgeschlossen, da sie durch die Nadelinjektion und nicht durch die transsynaptische Ausbreitung des Virus markiert wurden. Jeder einzelne zur Quantifizierung verwendete Gehirnbereich und seine Abkürzung im Allen CCF-Atlas sind in den Zusatzdaten 2 angegeben. Für die Berechnung der euklidischen Distanz wurde der Schwerpunkt der Starterzelle berechnet, indem die Atlaskoordinaten jeder registrierten Starterzelle gemittelt und das Ergebnis auf den nächsten Wert gerundet wurden ganze Zahl. Der dreidimensionale euklidische Abstand wurde zwischen dem Starterzellzentriod und jeder präsynaptischen Eingabeneuronenposition unter Verwendung der folgenden Formel berechnet:

wobei (x2,y2,z2) AP, ML und DV des Starterzellzentrios darstellt, (x1,y1,z1) AP, ML und DV jeder registrierten präsynaptischen Zellposition darstellt und d die Länge der berechneten Distanz darstellt Vektor. Zur Analyse der AP- und DV-Abstände wurden die Zellzahlen in 200-μm-Intervallen zusammengefasst und auf die Gesamtzahl der Zellen für jedes Tier normalisiert. Zur Analyse des ML-Abstands wurden die Zellzahlen auf 100 μm aufgeteilt, um eine gerade Anzahl von Behältern für jede Hemisphäre zu erhalten. Schätzungen der Gaußschen Kerneldichte wurden mithilfe des Seaborn-Python-Skripts berechnet und die Bandbreite wurde auf 0,5 eingestellt.

Geklärte Proben wurden aus DBE entfernt und zweimal 15 Minuten lang in DCM gewaschen, gefolgt von einer Inkubation über Nacht in 2:1 DCM/MeOH. Anschließend wurden die Proben jeweils 1 Stunde lang in 100 %, 80 %, 60 %, 40 %, 20 % MeOH/Wasser und 0,1 M PBS auf einem Orbitalschüttler (115 U/min) bei Raumtemperatur rehydratisiert. Frei schwebende Vibratomschnitte (50 μm) wurden mit einem Vibratom bei Raumtemperatur in 0,1 M PBS mit 0,05 % Triton-X geschnitten. Ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für das Reverse Clearing finden Sie unter: https://github.com/roberthuntlab/clearedbrainanalysis.

Mäuse wurden transkardial mit 4 % Paraformaldehyd (v/v) perfundiert und frei schwebende Vibratomschnitte (50 μm) wurden unter Verwendung von Standard-Immunfärbungsverfahren verarbeitet51. Die primären Antikörper waren wie folgt: Huhn-Anti-Grün-Fluoreszenzprotein (GFP; 1:1000; Aves, Kat.-Nr. GFP1020), Huhn-Anti-mCherry (1:1000; Abcam, Kat-Nr. ab205402), Ziege-Anti-Cholin-Acetyltransferase ( CHAT; 1:500; Millipore, Kat.-Nr. AB144P), Maus-Anti-Reelin (1:500; Millipore, Kat.-Nr. MAB5364, Klon G10), Kaninchen-Anti-DsRed (1:1000; Clontech, Kat.-Nr. 632496) , Kaninchen-Anti-Somatostatin (SST; 1:200; Santa Cruz, Kat.-Nr. SC-7819) und Kaninchen-Anti-WFS1 (1:1000; Protein Tech, Kat.-Nr. 11558-1-AP). Alle Antikörper wurden zuvor für die Immunfärbungsanalyse im Gehirn verwendet. Für sekundäre Antikörper (1:1000, Life Technologies) verwendeten wir Alexa 488-konjugierten Ziegen-Antikörper gegen Hühner-IgG (Kat.-Nr. A11039), Ziegen-Antikörper gegen Maus-IgG (Kat.-Nr. A11029) und Esel-Antikörper gegen Ziegen-IgG ( Kat.-Nr. A11055); Alexa 546-konjugierter Ziegen-Antikörper gegen Kaninchen-IgG (Kat.-Nr. A11035), Esel-Antikörper gegen Kaninchen-IgG (Kat.-Nr. A10040), Alexa 594–Esel-Antikörper gegen Ziegen-IgG (Kat.-Nr. A11058) und Alexa 647–konjugiert Ziegen-Antikörper gegen Hühner-IgG (Kat.-Nr. A32933). Die Schnitte wurden dann mit Fluoromount-G, das DAPI enthielt, auf geladene Objektträger (Superfrost plus, Fisher Scientific) montiert. Konfokale Bilder wurden mit einem Olympus FV3000 Laser-Scanning-Mikroskop aufgenommen. Epifluoreszenzbilder wurden mit einem Leica DM6-Mikroskop mit der Leica LAS X-Software aufgenommen. Helligkeit und Kontrast wurden bei Bedarf manuell mit Image J angepasst.

Fluoreszierend markierte Schnitte (50 μm) wurden mit einem Leica DM6-Mikroskop mit einem ×10- oder ×20-Objektiv oder einem Olympus FV3000-Konfokalmikroskop mit einem ×20- oder ×40-Objektiv abgebildet und mit FIJI (ImageJ)51 gezählt. Alle Zellen, die einen Fluoreszenzmarker exprimierten, wurden in jedem sechsten Abschnitt des gesamten Gehirns (also im Abstand von 300 μm) gezählt. Alle Abschnitte, die markierte Zellen enthielten, wurden pro Tier analysiert und die Werte gemittelt, um eine mittlere Zelldichte (Zellen/mm2) zu erhalten.

Mäuse wurden transkardial mit 4 % Paraformaldehyd (v/v) perfundiert und frei schwebende Vibratomschnitte (50 μm) wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Fluoro-Jade-C-Färbung verarbeitet91. Kurz gesagt, Gehirnschnitte wurden 30 Minuten lang bei 50 ° C auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern getrocknet. Die Objektträger wurden 5 Minuten lang in 1 % NaOH in 80 % Ethanol, 2 Minuten lang in 70 % Ethanol, 2 Minuten lang dH2O, 10 Minuten lang in 0,06 % Kaliumpermanganat, 2 Minuten lang dH2O, 0,00015 % Fluorjade C (Histo-Chem Inc., Kat.-Nr. 1FJC) und 0,0001 % DAPI in 0,1 % Essigsäure für 10 Minuten, gefolgt von drei Wäschen in dH2O für jeweils 1 Minute. Anschließend wurden die Objektträger 5 Minuten lang bei 50 °C getrocknet und in Xylolen geklärt, bevor sie mit Eukitt-Eindeckmedium (Sigma, Kat.-Nr. 03989) abgedeckt wurden.

Ventrikuläre und subventrikuläre Schichten des MGE wurden aus E13.5-Embryonen entnommen. Der Zeitpunkt, zu dem der Spermienpfropfen entdeckt wurde, wurde als E0,5 angesehen. Embryonale MGE-Explantate wurden in Leibovitz L-15-Medium präpariert, durch wiederholtes Pipettieren in L-15-Medium mechanisch dissoziiert und durch Zentrifugation (3 Minuten bei 600 × g) konzentriert. Konzentrierte Zellsuspensionen wurden von vorne in abgeschrägte Glasmikropipetten (50 μm Spitzendurchmesser, Wiretol 5 μl, Drummond Scientific) geladen und 7 Tage nach der CCI-Verletzung in den Hippocampus erwachsener hirngeschädigter Mäuse injiziert (3 × 104 Zellen pro Injektion). Zellinjektionen erfolgten in das Stratum radiatum des CA3-Unterfelds bei den folgenden stereotaktischen Koordinaten: AP –2,0 mm, ML 2,45 mm, DV –1,8 mm.

Alle statistischen Tests wurden mit Graphpad Prism 9, R und Microsoft Excel durchgeführt. Die Stichprobengrößen basierten auf früheren Veröffentlichungen38,47,92. Für quantitative Analysen des gesamten Gehirns wurde die Anzahl der Input-Neuronen in jedem einzelnen Gehirnbereich auf die Gesamtzahl der im gesamten Gehirn erkannten Input-Neuronen (% Input) oder auf die Gesamtzahl der Starterzellen (Konvergenzindex) normiert. Die Daten wurden mit einem zweiseitigen Student-T-Test, einer einfaktoriellen ANOVA, gefolgt von einem Tukey-Post-hoc-Test für mehrere Vergleiche, einer zweifaktoriellen ANOVA, gefolgt von einem Tukey-post-hoc-Test für mehrere Vergleiche, und einer anschließenden zweifaktoriellen ANOVA mit wiederholten Messungen verglichen durch einen Bonferroni-Post-hoc-Test, eine Chi-Quadrat-Analyse oder einen exakten Fisher-Test. Die UMAP-Analyse und die Pearson-Korrelation wurden in R berechnet. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt, n = Tiere, sofern nicht anders angegeben, und die Signifikanz wurde auf P < 0,05 festgelegt. Eine vollständige Liste der statistischen Tests und Ergebnisse finden Sie unter Ergänzende Daten 1–9 und Quelldaten.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Alle in dieser Studie generierten Daten werden in der Datei mit ergänzenden Informationen und Quelldaten bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Benutzerdefinierte Python-Skripte sind verfügbar unter: https://github.com/roberthuntlab/clearedbrainanalysis.

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Diese Arbeit wurde durch Mittel der National Institutes of Health-Zuschüsse R01–NS096012 (RFH), F31–NS106806 (JCF) und R01–EY024890 (DCL) sowie durch Stipendien des UCI Summer Undergraduate Research Program (SURP) (SP und QC) unterstützt ) und teilweise durch den Zugang zur Optical Biology Core Facility des Developmental Biology Center ermöglicht, einer gemeinsamen Ressource, die durch den Cancer Center Support Grant (CA-62203) und den Center for Complex Biological Systems Support Grant (GM-076516) am unterstützt wird Universität von Kalifornien, Irvine. Diese Arbeit wurde auch von der GT3 Core Facility des Salk Institute mit Mitteln von NIH-NCI CCSG: P30-014195, einem NINDS R24 Core Grant und Mitteln von NEI unterstützt. Wir danken Dr. Charles Ribak und den Mitgliedern des Hunt-Labors für hilfreiche Diskussionen und Kommentare zu früheren Versionen dieses Manuskripts.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Jan C. Frankowski, Alexa Tierno.

Abteilung für Anatomie und Neurobiologie, University of California, Irvine, CA, 92697, USA

Jan C. Frankowski, Alexa Tender, Shreya Pavani, Quincy Cao, David C. Lyon und Robert F. Hunt

Epilepsie-Forschungszentrum, University of California, Irvine, CA, 92697, USA

Robert F. Hunt

Sue und Bill Gross Stem Cell Research Center, University of California, Irvine, CA, 92697, USA

Robert F. Hunt

Zentrum für Neurobiologie des Lernens und Gedächtnisses, University of California, Irvine, Irvine, CA, 92697, USA

Robert F. Hunt

Center for Neural Circuit Mapping, University of California, Irvine, Irvine, CA, 92697, USA

Robert F. Hunt

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JCF und AT haben gleichermaßen Beiträge geleistet, und diese Autoren sind in alphabetischer Reihenfolge aufgeführt. JCF führte Immunfärbung, iDISCO+ Brain Clearing, konfokale und Lichtblatt-Bildgebung durch; schrieb Python-Code; führte Zellzahlquantifizierungen und erste Datenanalysen durch; steuerte die Stipendienfinanzierung bei und verfasste Entwürfe für Teile der Methoden und erste Zahlen. AT führte Immunfärbung, konfokale und Lichtblatt-Bildgebung durch; bearbeiteter Python-Code; führte Zellzahlquantifizierungen und abschließende Datenanalysen durch; stellte Quelldaten und endgültige Zahlen zusammen und redigierte das Manuskript. SP führte eine Histologie und Datenanalyse durch und redigierte das Manuskript. QC führte eine Datenanalyse durch und redigierte das Manuskript. DCL leistete einen Beitrag zur Finanzierung des Tollwutvirus und redigierte das Manuskript. RFH trug zum Konzept, Design, der Durchführung und Analyse aller Experimente sowie zur Finanzierung bei und verfasste das Manuskript.

Korrespondenz mit Alexa Tender oder Robert F. Hunt.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt MacKenzie Howard, Chris Dulla und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Frankowski, JC, Tender, A, Pavani, S et al. Gehirnweite Rekonstruktion hemmender Schaltkreise nach traumatischer Hirnverletzung. Nat Commun 13, 3417 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-31072-2

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Eingegangen: 11. November 2021

Angenommen: 31. Mai 2022

Veröffentlicht: 14. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-31072-2

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