Das natürliche Pyrazolotriazin-Pseudojodinin aus Pseudomonas mosselii 923 hemmt pflanzliche Bakterien- und Pilzpathogene

Nature Communications Band 14, Artikelnummer: 734 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Naturprodukte, die größtenteils von Pseudomonaden-ähnlichen bodenbewohnenden Mikroorganismen hergestellt werden, sind eine ständige Quelle antimikrobieller Metaboliten und Pestizide. Hier berichten wir über die Isolierung des Pseudomonas mosselii-Stammes 923 aus Reisrhizosphärenböden von Reisfeldern, der spezifisch das Wachstum der bakteriellen Pflanzenpathogene der Art Xanthomonas und des Pilzpathogens Magnaporthe oryzae hemmt. Die antimikrobielle Verbindung wird gereinigt und mithilfe hochauflösender Massenspektren, Kernspinresonanz und Einkristall-Röntgenbeugung als Pseudoiodinin identifiziert. Genomweite Zufallsmutagenese, Transkriptomanalyse und biochemische Tests definieren den Pseudoiodinin-Biosynthesecluster als psdABCDEFG. Es wird angenommen, dass die Pseudoiodinin-Biosynthese ausgehend von Guanosintriphosphat beginnt, und 1,6-Didesmethyltoxoflavin ist ein biosynthetisches Zwischenprodukt. Die Transposon-Mutagenese weist darauf hin, dass GacA der globale Regulator ist. Darüber hinaus regulieren zwei nichtkodierende kleine RNAs, rsmY und rsmZ, die Pseudoiodinin-Transkription positiv, und die Kohlenstoffspeicherregulatoren CsrA2 und CsrA3, die die Expression von psdA negativ regulieren. Eine 22,4-fache Steigerung der Pseudoiodininproduktion wird durch die Optimierung der für die Fermentation verwendeten Medien, die Überexpression des biosynthetischen Operons und die Entfernung der CsrA-Bindungsstellen erreicht. Sowohl der Stamm 923 als auch gereinigtes Pseudoiodinin in Planta hemmen die Krankheitserreger, ohne den Reiswirt zu beeinträchtigen, was darauf hindeutet, dass Pseudoiodinin zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten eingesetzt werden kann.

Reis (Oryza sativa L.) ist ein Grundnahrungsmittel von globaler Bedeutung und wird von der Ernährungs- und Landwirtschaftsorganisation (FAO)1 als strategische Nutzpflanze für die Ernährungssicherheit angesehen. Leider wird die Reisproduktion durch zahlreiche Einschränkungen beeinträchtigt, darunter verheerende Krankheiten wie bakterieller Blattbrand (BLB), bakterieller Blattstreifen (BLS) und Reisbrand, die durch Xanthomonas oryzae pv. ausgelöst werden. oryzae (Xoo), X. oryzae pv. oryzicola (Xoc) bzw. Magnaporthe oryzae2,3. Derzeit scheint der Anbau von Reissorten mit Krankheitsresistenzgenen (R) eine bessere Option zur Bekämpfung von X. oryzae zu sein als andere Bewirtschaftungssysteme2,4; Allerdings sind in China angebaute Sorten häufig anfällig für die Krankheitserreger5. Obwohl chemische Fungizide und Bakterizide häufig zur Bekämpfung von Reiskrankheiten eingesetzt werden6, hat ihr Einsatz zu Umweltverschmutzung, Arzneimittelresistenz und dem Wiederauftreten von Krankheitserregern geführt7,8. Ein umweltfreundlicher Kontrollansatz ist der potenzielle Einsatz antagonistischer Bakterien als Biokontrollmittel (BCAs), die Krankheitserreger durch die Produktion bioaktiver Sekundärmetaboliten, einschließlich Antibiotika, Siderophore und flüchtiger Verbindungen, unterdrücken können9.

Naturstoffe (NPs) sind eine ständige Quelle antimikrobieller Metaboliten und Arzneimittelleitprodukte und werden größtenteils von bodenbewohnenden Mikroorganismen produziert10,11. Pseudomonas-Arten sind gramnegative Bakterien, die im Boden, im Wasser, bei Tieren und in der Rhizosphäre von Pflanzen überleben. Pseudomonaden produzieren viele antimikrobielle NPs, darunter Phenazin, Pyrrolderivate, 2,4-Diacetylphloroglucinol (2,4-DAPG) und wachstumsfördernde Substanzen, wodurch sie gut an Umweltstress angepasst und als BCAs von Pflanzenpathogenen geeignet sind12. Viele Sekundärmetaboliten in Pseudomonas werden durch das GacS/GacA-Zweikomponentensystem (TCS)13, nichtkodierende kleine RNAs (sRNAs) und CsrA/RsmA-Proteine14 reguliert. Mit dem Aufkommen der Genomsequenzierung wurden im globalen Mikrobiom zahlreiche antimikrobielle Wirkstoffe entdeckt15 mit Vorteilen für die moderne Landwirtschaft16 und die menschliche Gesundheit17. Die fortschreitende Entwicklung multiresistenter Krankheitserreger18 hat jedoch die Dringlichkeit der Entdeckung neuer NPs zur Bekämpfung von bakteriellen und Pilzkrankheiten in Nutzpflanzen erhöht.

Mitglieder der natürlich vorkommenden heterocyclischen Pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazin-Familie wurden in den letzten 40 Jahren isoliert und charakterisiert19, darunter Fluviole20, Nostocin A21 und Pseudoiodinin22. Die Pseudoiodininstruktur enthält eine 1,2,4-Triazineinheit, kondensiert mit einem Pyrazolring und zwei Methylgruppen. Derivate der Pyrazolotriazin-Familie weisen ein breites Spektrum biologischer Funktionen auf, darunter Antitumor-, antivirale und antibakterielle Aktivitäten23,24. Insbesondere Pseudoiodinin zeigte starke antineoplutische Aktivitäten gegen Sarkome25. Interessanterweise sind der Biosyntheseweg und die biosynthetischen Gencluster (BGCs) von Pseudoiodinin noch nicht aufgeklärt und stellen nach wie vor eine reichhaltige Ressource für die synthetische Biologie und die Entwicklung bioaktiver Derivate dar.

In dieser Arbeit wird der P. mosselii-Stamm 923 auf die Hemmung von X. oryzae und M. oryzae untersucht und die antagonistische Verbindung als Pseudoiodinin identifiziert. Das biosynthetische Operon, das für die Pseudoiodinin-Assemblierung verantwortlich ist, wird identifiziert. Guanosintriphosphat (GTP) ist nachweislich ein Vorläufer und 1,6-Didesmethyltoxoflavin (1,6-DDMT) ist ein biosynthetisches Zwischenprodukt von Pseudoiodinin. Die Regulierung von Pseudoiodinin wird nachweislich durch GacA, rsmY/Z und CsrA123 vermittelt, was zur genetischen Erzeugung eines Pseudoiodinin-überproduzierenden Stamms führt. Die Ergebnisse zeigen, dass Pseudoiodinin bei der Bekämpfung von Bakterien- und Pilzkrankheiten bei Reis wirksam ist und damit das Spektrum möglicher Möglichkeiten zur Bekämpfung von Reispathogenen erweitert.

Es ist allgemein bekannt, dass Pflanzen nützliche Bakterien rekrutieren, um Krankheitserreger in der Rhizosphäre zu unterdrücken26. Daher untersuchten wir, ob Bodenbakterien das Wachstum der Reispathogene Xoo PXO99A, Xoc RS105 und M. oryzae R01-1 unterdrücken können. Aus 248 Rhizosphärenproben, die in 23 Provinzen Chinas gesammelt wurden, wurden insgesamt 223 kultivierbare Bakterienisolate gewonnen. diese wurden in vitro auf antagonistische Aktivität untersucht. Ein Bakterienisolat mit der Bezeichnung 923 zeigte eine starke Hemmwirkung gegen Xoo PXO99A, . Darüber hinaus zeigte der Stamm 923 einen unterschiedlich starken Antagonismus gegenüber 11 anderen Xanthomonas-Erregern (ergänzende Abbildung 1c).

a, b Antagonistische Aktivität des Stamms 923 gegenüber Xoo PXO99A, c Xoc RS105-Gus-Läsionslängen auf Yuanfengzao-Reis, der mit Stamm 923, ΔpsdA oder 923 SUP beimpft wurde, 7 Tage nach der Inokulation (dpi) im Gewächshaus. „Pre“ steht für Reisblätter, die vor der Pathogenimpfung mit Wasser (MOCK-Pre), 923, ΔpsdA oder 923 SUP (Überstand) vorbehandelt wurden; „Tre“ steht für Reisblätter, die mit Xoc RS105-Gus beimpft und dann mit Wasser (MOCK-Tre), 923, ΔpsdA oder 923 SUP behandelt wurden. d Populationsdynamik von Xoc RS105-Gus in Reisblättern. Bakterienpopulationen wurden durch GUS-Quantifizierung und histochemische Färbung bei 7 dpi überwacht. Fehlerbalken zeigen Mittelwerte ± SD (n = 3 unabhängige Blätter) und signifikante Unterschiede bei ***P < 0,001, ***P = 6,4 × 10−14, = 3,2 × 10−15, = 8,3 × 10−15, = 5,5 × 10−16 in Folge von c, ***P < 0,001, ***P = 1,3 × 10−25, = 2,4 × 10−26, = 1,8 × 10-25, = 3,6 × 10-26 in Folge von d, ns nicht signifikant (P > 0,05). e, f Bereiche mit Krankheitsläsionen auf Feldreis, der mit Stamm 923 und (e) Xoo PXO99A oder (f) Xoc RS105 inokuliert wurde. Die Läsionsflächen wurden bei 15 dpi bestimmt (n = 15 unabhängige Blätter, Mittelwert ± SD), ***P < 0,001, ***P = 1,2×10−15, = 1,3×10−14 in der Reihenfolge von e; ***P < 0,001, ***P = 4,7 × 10−13, = 3,2 × 10−11 in der Reihenfolge von f; ns, nicht signifikant (P > 0,05). Die statistische Signifikanz der mit Xoc oder Xoo beimpften Läsionsbereiche wurde mithilfe der LSD-Testmethode und der einfaktoriellen ANOVA bestimmt; Der mittlere Balken stellt den Mittelwert dar, und es wurden Min. bis Max. von Box und Whiskern verwendet. Die Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Um festzustellen, ob Stamm 923 das Wachstum von Xoo und Xoc in Planta hemmt, wurden im Gewächshaus Biokontrollexperimente durchgeführt. Wenn entweder Stamm 923 oder der Überstand (SUP) als Vorbehandlung (Pre) angewendet wurde, waren die Läsionslängen etwa 50 % kleiner als bei der Kontrolle (Abb. 1c), was mit den Ergebnissen des quantitativen GUS-Tests übereinstimmte (Abb. 1d). ). Darüber hinaus führten sowohl die Vor- als auch die Nachbehandlung mit dem Stamm 923 zu deutlich kleineren Läsionen, die durch Xoo bzw. Xoc auf Reisblättern im Feld verursacht wurden (Abb. 1e, f). Diese Ergebnisse legen nahe, dass der Stamm 923 ein wirksames Biokontrollmittel (BCA) für bakterielle Krankheitserreger ist.

Zur Identifizierung des Stamms 923 wurden mehrere Ansätze verwendet. Die phylogenetische Analyse der 16S-rRNA-Sequenzen zeigte, dass 923 zur Gattung Pseudomonas gehörte und mit P. mosselii DSM17497 gruppiert war, das zu 99, 6% ähnlich war (ergänzende Abbildung 2b). Um die taxonomische Klassifizierung des Stamms 923 weiter zu bestätigen, wurde das gesamte Genom sequenziert (ergänzende Abbildung 2a). Eine genombasierte Analyse der durchschnittlichen Nukleotididentität (ANI) zeigte, dass das 923-Genom im Vergleich zu P. mosselii DSM17497 einen ANI-Wert von 99,25 % aufwies; Dies liegt über dem Schwellenwert von 95 % für die Artabgrenzung und bestätigt, dass es sich bei dem Stamm 923 um P. mosselii handelt. Zusätzliche phylogenomische Tests stützten diese Schlussfolgerungen weiter (ergänzende Abbildung 2c).

Antibiotika-produzierende Bakterien erzeugen im Allgemeinen Hemmzonen, wenn sie auf Medien aufgetragen werden, die mit einem Zielpathogen überschichtet sind27. Wir haben Extrakte aus den Kulturen des Stamms 923 mit verschiedenen organischen Lösungsmitteln hergestellt und diese auf mit Xoo PX099A beimpfte Platten aufgetragen. Ethylacetatextrakte erzeugten die größten Hemmzonen, wenn sie auf die Xoo PX099A-Auflage aufgetragen wurden (ergänzende Abbildung 3a). Darüber hinaus wurde der Ethylacetatextrakt einer C18-Umkehrphasen-Kieselgelsäule unterzogen, um zwölf Fraktionen mit der Bezeichnung A1-A12 zu ergeben. Basierend auf dem Bioaktivitätsprofil wurden die Fraktionen A1 und A5–A6 durch präparative HPLC auf einer C18-Säule weiter gereinigt, um die Verbindungen PM-1 bis PM-7 zu ergeben (Abb. 2a und ergänzende Abb. 3a). Unter den sieben gereinigten Verbindungen zeigte nur PM-3 eine signifikante Hemmaktivität für Xoo PX099A (Abb. 2b). Die Summenformel von PM-3 wurde durch hochauflösende Massenspektren (HRMS) als C6H7N5O bestimmt (m/z 166,0722 [M + H]+, berechnet für C6H8N5O, 166,0729) (Ergänzende Abbildung 4). Die Kernspinresonanzdaten (NMR) (Ergänzende Abbildungen 5–8) und die Einkristall-Röntgenbeugung (Abb. 2c und Ergänzungstabelle 1) bestätigten weiterhin die Struktur von PM-3, das mit Pseudoiodinin identisch war. Darüber hinaus zeigte PM-3 (Pseudoiodinin) Wirksamkeit gegen viele andere pathogene Xanthomonas-Arten, einschließlich X. campestris pv. Phaseoli, X. campestris pv. malvacearum und X. citri subsp. citri (Ergänzende Abbildung 3d).

ein Flussdiagramm für die Extraktion und Isolierung von Verbindungen aus Stamm 923, die PXO99A inhibierten. Abkürzungen und Strukturen sind wie folgt: PE, Petrolether; EtOAc, Ethylacetat; NBA, n-Butylalkohol; MeOH, Methanol; Verbindungen: PM-1, C16H18N2O; PM-2, C15H16N2O; PM-3, C6H7N5O; PM-4, C15H16N2O2; PM-5, C5H5N5O; PM-6, C16H26O3; und PM-7, C18H30O3. b Die antibakterielle Aktivität der Verbindungen PM-1 bis PM-7 für Xoo PXO99A; Als Negativkontrolle wurde Methanol verwendet. c Röntgen-ORTEP-Zeichnung für PM-3.

MHK- (minimale Hemmkonzentration) und EC50-Tests (wirksame Konzentration für 50 % Hemmung) zeigten, dass Pseudoiodinin für Xoo PX099A und Xoc RS105 toxischer war als für andere 11 Xanthomonas spp. mit MHK-Werten von 0,5 und 4 μg/ml und EC50-Werten von 0,17 bzw. 1,36 μg/ml (Ergänzende Abbildungen 9a, b und Tabelle 1). Pseudoiodinin hemmte auch das Wachstum von M. oryzae R01-1 mit MHK- und EC50-Werten von 8,25 bzw. 4,43 μg/ml (ergänzende Abbildung 9c).

Frühere Studien haben gezeigt, dass Phenazin-1-Carbonsäure (PCA; auch bekannt als Shenqinmycin) ein wirksames Bakterizid zur Bekämpfung von BLB und BLS in China ist28,29. Überraschenderweise zeigen unsere Ergebnisse, dass die MHK- und EC50-Werte von Pseudoiodinin deutlich niedriger waren als die von PCA (Tabelle 1), was das Potenzial von Pseudoiodinin als umweltfreundliches Biopestizid weiter untermauert.

P. mosselii 923 und Pseudoiodinin wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, die Krankheitserreger Xoc und Xoo zu hemmen, und es wurde gezeigt, dass sie die Läsionsfläche von Reisblättern bei 15 dpi signifikant reduzieren (ergänzende Abbildung 10a – c). Unterdessen zeigte die Messung der Bakterienpopulation in Reisblättern, dass die Tre- (Behandlung) oder Vorbehandlungen die Besiedlung durch Xoo und Xoc bei 14 und 21 dpi deutlich reduzierten (ergänzende Abbildung 10b – d). Um herauszufinden, ob Pseudoiodinin ausreicht, um Reisblätter vor Läsionen zu schützen, haben wir die Biokontrollaktivität des mutierten ΔpsdA und WT von P. mosselii 923 an Reissämlingen und erwachsenen Pflanzen erneut getestet. Mit der Deletionsmutante ΔpsdA inokulierte Blätter zeigten Läsionslängen und eine GUS-Aktivität, die der MOCK-Behandlung entsprachen (Abb. 1c, d). In der Zwischenzeit haben wir die Auswirkungen der Mutante ΔpsdA, WT P. mosselii 923 und Pseudoiodinin auf die Wachstumshemmung von Xoo in Planta getestet. Wie vorhergesagt, induzierte die Deletionsmutante ΔpsdA Läsionen, deren Größe der der MOCK-Behandlung ähnelte (ergänzende Abbildung 11), was darauf hindeutet, dass nur Pseudoiodinin zum Pflanzenschutz beiträgt. Die Wirksamkeit von Pseudoiodinin wurde weiter analysiert, indem Konzentrationen von 0 bis 20 μM angewendet und die Krankheit in mit Xoo PXO99A geimpftem Feldreis als Vor- oder Nachbehandlung bewertet wurden. Pseudoiodinin verursachte bei Konzentrationen> 5 μM eine signifikante Verringerung der Läsionsgröße (ergänzende Abbildung 3b, c), was darauf hinweist, dass Pseudoiodinin das Wachstum von Xoo PXO99A und Xoc RS105 im Reisgewebe wirksam hemmt. Interessanterweise beobachteten wir, dass Pseudoiodinin auch die durch den Pilz M. oryzae R01-1 verursachte Läsionsfläche der Reisexplosion signifikant reduzierte (ergänzende Abbildung 12). Die oben genannten Daten zeigen, dass die Verbindung ein vielversprechendes Biopestizid sowohl gegen bakterielle als auch Pilzkrankheiten in Reis ist.

Obwohl Pseudoiodinin erstmals in P. fluorescens var. identifiziert wurde. Pseudoiodinin22, die an seiner Synthese beteiligten Gene wurden nicht charakterisiert. Das Genom von P. mosselii 923 wurde mit dem antiSMASH-Programm30 (https://antismash.secondarymetabolites.org/) auf Sekundärmetaboliten analysiert. Es war jedoch nicht sicher, welcher Cluster mit der Pseudoiodinin-Biosynthese verbunden war.

Um Gene im Pseudoiodininweg zu identifizieren, wurde das EZ-Tn5-Transposomensystem verwendet, um zufällige Mutationen in P. mosselii 923 zu erzeugen. Ungefähr 10.000 Mutanten des Stamms 923 wurden auf antimikrobielle Aktivität gegenüber Xoo PXO99A untersucht, und Mutante 34-6 war frei von dieser antagonistische Aktivität in vitro (Abb. 3a). Der Ort der Einzelkopie-Tn5-Insertion in der Mutante 34-6, kartiert auf gacA im Genom (Abb. 3a); Interessanterweise kodiert gacA einen Reaktionsregulator, der in Pseudomonas spp. stark konserviert ist. und gehört zur Familie der zweikomponentigen Regulierungssysteme (TCS)13. Um die Funktion von gacA bei der Pseudoiodininsynthese weiter zu bestätigen, haben wir eine markerlose Knockout-Mutante erzeugt, bei der das vollständige gacA durch doppelte homologe Rekombination aus P. mosselii 923 gelöscht wurde. Die Pseudoiodininproduktion wurde in der resultierenden Mutante, die als ΔgacA bezeichnet wurde, aufgehoben (ergänzende Abbildung 13b, c). Die Komplementierung der ΔgacA-Mutante mit gacA in trans stellte die antibakterielle Aktivität und Pseudoiodininproduktion auf das Wildtyp-Niveau wieder her, aber die Überproduktion von gacA in trans erhöhte die Pseudoiodininproduktion im Stamm 923 nicht (ergänzende Abbildung 13a – c). Diese Ergebnisse legen nahe, dass GacA die Pseudoiodinin-Biosynthese reguliert, was mit der Rolle von GacA bei der Regulierung anderer Sekundärmetaboliten in Pseudomonas übereinstimmt13,31,32.

Einem Mutanten 34–6 von P. mosselii 923 fehlt die antimikrobielle Aktivität für Xoo PXO99A und er enthält eine Tn5-Insertion in gacA. b Antibakterielle Aktivitätstests von P. mosselii 923, ΔpsdA, ΔpsdB, ΔpsdC, ΔpsdD, ΔpsdE, ΔpsdF und ΔpsdG-Mutanten und ihren entsprechenden komplementierten Stämmen (CΔpsdA – CΔpsdG). c HPLC-Analyse (Methode B, nachgewiesen bei 500 nm) der Mutanten ΔpsdA, ΔpsdB, ΔpsdC, ΔpsdD, ΔpsdE, ΔpsdF und ΔpsdG. d HPLC-Analyse (Methode B, nachgewiesen bei 500 nm) der komplementierten Mutanten CΔpsdA – CΔpsdG. e Schematische Darstellung des Pseudoiodinin-Biosynthese-Genclusters in P. mosselii 923. Die Zahlen über den Gennamen geben die ORF-Länge an. Farben kennzeichnen Genfunktionen wie folgt: Rot, primäre Biosynthesegene; grau, zusätzliche biosynthetische Gene. Die sieben Genanmerkungen werden wie folgt angezeigt: psdA, Methyltransferase Typ 12; psdB, Glyoxylase-Bleomycin-Resistenzprotein, Protein der Dioxygenase-Superfamilie; psdC, Sulfatase-modifizierendes Faktorprotein; psdD, GTP-Cyclohydrolase; psdE, WD-40-Wiederholungsprotein; psdF, Methyltransferase-Domäne; psdG, Riboflavin-Biosyntheseprotein RibD.

Um den biosynthetischen Gencluster, der für die Pseudoiodininproduktion verantwortlich ist, weiter zu identifizieren, wurden die Transkriptome von P. mosselii 923 (WT) und der ΔgacA-Knockout-Mutante (KO) verglichen. Dieses Ergebnis zeigte, dass 604 Gene in der gacA-Mutante herunterreguliert waren (ergänzende Abbildung 13d, e); und 29 differentiell exprimierte Gene (DEGs) waren im WT im Vergleich zur KO-Mutante stark hochreguliert (ergänzende Abbildung 14 und ergänzende Tabelle 2). Um die RNA-seq-Daten zu verifizieren, wurden fünfzehn DEGs zufällig zur sekundären Bestätigung durch RT-qPCR-Analyse ausgewählt (ergänzende Abbildung 15). Neunzehn Gene wurden in den Suizidvektor p2P24Km kloniert und sind in den Zusatzdaten 1 als p24-orf2059 – p24-orf2077 aufgeführt. Die Löschung dieser 19 Gene führte zu den P. mosselii-Mutanten Δorf2059–Δorf2077 (Supplementary Data 1). Die 19 Mutanten wurden auf antimikrobielle Aktivität und Pseudoiodinin-Biosynthese untersucht, und sieben Mutanten (Δorf2064–Δorf2070) waren in der Produktion von Pseudoiodinin beeinträchtigt und hatten einen Mangel an antimikrobieller Aktivität. Diese sieben Mutanten wurden wie folgt umbenannt: ΔpsdA (Δorf2064); ΔpsdB (Δorf2065); ΔpsdC, (Δorf2066); ΔpsdD (Δorf2067); ΔpsdE (Δorf2068); ΔpsdF (Δorf2069); und ΔpsdG (Δorf2070). Die sieben für Pseudoiodinin kodierenden Gene, nämlich psdA, psdB, psdC, psdD, psdE, psdF und psdG, wurden in das Plasmid pBSPPc stromabwärts des psdA-Promotors kloniert, was zu pBS-psdA, pBS-psdB, pBS-psdC und pBS-psdD führte , pBS-psdE, pBS-psdF bzw. pBS-psdG. Diese Klone wurden in die sieben entsprechenden Mutanten transformiert, um die entsprechenden komplementierten Stämme (CΔpsdA-CΔpsdG) zu erhalten, die wegen antibakterieller Aktivität und Pseudoiodininproduktion gerettet wurden (Abb. 3b – d).

RT-PCR bestätigte, dass psdABCDEFG im psd-Gencluster von einem einzelnen Operon stammte (Abb. 3e und ergänzende Abb. 13f). Dieser Cluster (psdABCDEFG) wurde durch heterologe Expression in P. putida KT2440 validiert. Das psdABCDEFG unter nativem Promotor verleiht P. putida KT2440 die Fähigkeit, Pseudoiodinin zu produzieren, was zeigt, dass die sieben Gene ausreichend sind (Abb. 4a).

ein Pseudoiodinin-Biosynthesecluster im Konstrukt pBSPPc-ABCDEFG und HPLC-Analyse (Methode B, nachgewiesen bei 500 nm) der Fermentationsextrakte von WT, KT2440 und dem manipulierten heterologen Expressionsstamm sowie der Standardprobe (Pseudoiodinin). Standard, Pseudoiodinin, isoliert aus P. mosselii 923; WT, Wildtyp P. mosselii 923; KT2440, P. putida; und KT2440/pBSPPc-ABCDEFG, P. putida, das den Pseudoiodinin-Gencluster in pBSPPc enthält. b Vorgeschlagener Weg für die Pseudoiodinin-Biosynthese. 1: 2,5-Diamino-6-(5-phospho-d-ribosylamino)pyrimidin-4(3H)-on; 2: 5-Amino-6-(5-phospho-d-ribitylamino)uracil; 3: 5-Amino-6-d-ribitylaminouracil; 1,6-DDMT: 1,6-Didesmethyltoxoflavin.

Weitere Ergebnisse der Homologieanalyse zeigten, dass der psdABCDEFG-Gencluster in anderen Pseudomonaden konserviert war; insbesondere im Typstamm P. mosselii DSM17497, der eine Aminosäureähnlichkeit von 99 % aufweist (Ergänzende Abbildung 16). P. mosselii DSM17497 erzeugte jedoch keine nachweisbaren Mengen an Pseudoiodinin und hemmte Xoo PXO99A nicht (ergänzende Abbildung 17a, b). Durch die Ergänzung des DSM17497-psd-Operons (orf2184-orf2190) in den P. mosselii 923-Mutanten ΔpsdB, ΔpsdC und ΔpsdG können die bakteriostatische Aktivität und die Pseudoiodininproduktion auf das Wildtyp-923-Niveau wiederhergestellt werden (ergänzende Abbildung 17a, b). Darüber hinaus wurden die sieben Gene von orf2184-orf2190 in P. mosselii DSM17497 exprimiert (ergänzende Abbildung 17c), was darauf hinweist, dass der Pseudoiodinin-Gencluster in P. mosselii DSM17497 transkribiert wurde. Die obigen Ergebnisse zeigten, dass der psdABCDEFG-Gencluster im P. mosselii DSM17497 funktionsfähig war, das Fehlen einer Pseudoiodininproduktion erfordert jedoch weitere Untersuchungen.

Die BLAST-Analyse zeigte, dass die Aminosäuresequenzen von PsdD und PsdG erhebliche Ähnlichkeit mit der GTP-Cyclohydrolase II bzw. der GTP-Deaminase aufweisen, die an der Riboflavin- und Toxoflavinsynthese beteiligt sind33,34. Unter Berücksichtigung der Korrelation zwischen den Strukturen von Pseudoiodinin und 1,6-Didesmethyltoxoflavin (1,6-DDMT) präsentieren wir einen hypothetischen Biosyntheseweg für Pseudoiodinin, der auf der Ähnlichkeit zur Toxoflavin-Biosynthese basiert33 (Abb. 4b). Im vorgeschlagenen Weg nutzen PsdD und PsdG GTP, um 2,5-Diamino-6-(5-phospho-d-ribosylamino)pyrimidin-4(3H)-on (Struktur 1, Abb. 4b) und 5-Amino- 6-(5-Phospho-d-ribitylamino)uracil (Struktur 2, Abb. 4b) in den ersten beiden Schritten. Anschließend vermitteln entweder PsdE und/oder PsdC die Bildung der N-N-Bindung, indem sie die Konjugation von Struktur 2 oder des dephosphorylierten Produkts 5-Amino-6-d-ribitylaminouracil (Struktur 3, Abb. 4b) mit Glycin katalysieren, um 1 zu erzeugen ,6-DDMT. Schließlich würde 1,6-DDMT einer Reihe von Ringkontraktions- und Methylierungsschritten unterzogen, um Pseudoiodinin herzustellen. Obwohl 1,6-DDMT weder im Wildtyp P. mosselii 923 noch in Mutantenstämmen beobachtet wurde, wurde die Pseudoiodininproduktion wiederhergestellt, als 1,6-DDMT den Mutantenstämmen ΔpsdC und ΔpsdE zugeführt wurde (ergänzende Abbildung 18), was dies zeigt 1,6-DDMT ist ein wichtiges Zwischenprodukt.

Das GacS/GacA TCS steuert die Expression von Genen, die an der Biosynthese mehrerer antimikrobieller Verbindungen und lytischer Enzyme beteiligt sind35. Als Reaktion auf Reize autophosphoryliert GacS den Reaktionsregulator GacA und aktiviert ihn durch Phosphotransfer31. GacA aktiviert die Expression der rsmX-, rsmY- und rsmZ-sRNAs durch Bindung einer konservierten Upstream-Aktivierungssequenz (UAS) TGTAAGNNATNNCTTACA32, die die Expression von Zielgenen reguliert.

In P. mosselii 923 enthielten zwei nichtkodierende kleine RNAs, rsmY und rsmZ, das GacA-Bindungsmotiv (5'TGTAAGCNAANGCTTACA3') in ihren Promotorregionen (ergänzende Abbildung 19b, c). Um die mögliche Wechselwirkung von rsmY und rsmZ mit GacA zu untersuchen, wurde letzteres in E. coli BL21 (DE3) überproduziert, gereinigt und es wurde gezeigt, dass es die rsmY- und rsmZ-Promotorregionen in elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstests (EMSA) bindet (ergänzende Abbildung 19a). -C). Interessanterweise interagierte GacA nicht mit dem psdA-Promotor (Daten nicht gezeigt). Deletionen in rsmY und rsmZ wurden konstruiert, um ihre Rolle bei der Produktion und Aktivität von Pseudoiodinin weiter zu untersuchen. Einzelne ΔrsmY- und ΔrsmZ-Mutanten hatten keinen Einfluss auf die antibakterielle Aktivität; Der Doppelmutante ΔrsmYZ fehlte jedoch fast vollständig die antibakterielle Aktivität gegen Xoo PXO99A (Abb. 5a). Die antibakterielle Aktivität wurde in den drei komplementierten Stämmen CΔrsmY, CΔrsmZ und CΔrsmYZ auf das Wildtyp-Niveau wiederhergestellt (Abb. 5a). Die Pseudoiodininproduktion war in der ΔrsmY-Mutante signifikant reduziert, nicht jedoch in der ΔrsmZ-Mutante. Wie aus den antibakteriellen Tests vorhergesagt, produzierte die ΔrsmYZ-Doppelmutante kein Pseudoiodinin. Die beiden komplementierten Stämme (CΔrsmY und CΔrsmZ) wurden teilweise für die Pseudoiodininproduktion gerettet, wohingegen die gleichzeitige Komplementierung mit rsmY und rsmZ die Pseudoiodininproduktion auf Wildtypniveau wiederherstellte (Abb. 5b, c). Diese Daten deuten darauf hin, dass GacA die Pseudoiodinin-Biosynthese durch direkte Bindung an die rsmY- und rsmZ-Promotoren positiv regulierte, was die Transkription des Operons in P. mosselii 923 aktiviert.

a Antibakterielle Aktivitätstests der Mutanten P. mosselii 923, ΔrsmY, ΔrsmZ und ΔrsmYZ sowie der komplementierten Mutanten CΔrsmY, CΔrsmZ und CΔrsmYZ. Tafeln b, d: HPLC-Profile (Methode B, nachgewiesen bei 500 nm) der Mutanten und komplementierten Stämme im Vergleich zum Wildtyp 923. Tafeln c, e: Pseudoiodininproduktion durch verschiedene Stämme. Die Zahlen auf der Y-Achse zeigen die Pseudoiodinin-Ausbeuten. c Die Wildtyp-923-, rsmY-, rsmZ- und rsmYZ-Mutanten und ihre entsprechenden komplementierten Stämme in LB-Medium. Fehlerbalken zeigen Mittelwerte ± SD (n = 3 biologisch unabhängige Replikate) und signifikante Unterschiede bei ***P < 0,001, ***P = 0,0002, = 2,5 × 10−14, = 1,5 × 10−10 in der Reihenfolge. e Pseudoiodinin-Ausbeuten in Wildtyp-P. mosselii 923 in LB- und TSB-Medium, den csrA1-, csrA2-, csrA3-, csrA1A2-, csrA1A3-, csrA2A3- und csrA1A2A3-Mutanten sowie überexprimierenden und RBS-getauschten Stämmen in TSB-Medium. Fehlerbalken zeigen Mittelwerte ± SD (n = 3 biologisch unabhängige Replikate) und signifikante Unterschiede bei ***P < 0,001, **P < 0,01, **P = 0,005, ***P = 4,5 × 10−10, = 1,1 × 10−9, = 9,3 × 10−17 in Folge. Einfaktorielle ANOVA, gefolgt von einem LSD-Test. Die Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. f Vorgeschlagenes Modell der GacA/CsrA-vermittelten Regulierung der Pseudoiodinin-Biosynthese in P. mosselii 923. Im Stamm 923 reagiert das GacS/GacA-TCS auf nicht charakterisierte Signale und GacA aktiviert die Transkription von zwei nichtkodierenden RNAs (rsmY und rsmZ) durch Bindung an ihre Promotoren, wodurch die Pseudojodininproduktion positiv reguliert wird. Die beiden CsrA/RsmA-Homologen CsrA2 und CsrA3 hemmen die Initiierung der Pseudoiodininsynthese. CsrA2 und CsrA3 interagieren vorwiegend mit GGA-haltigen Sequenzen/Schleifen in der 5'-untranslatierten Region von psdA-mRNAs; Diese Site überlappt die RBS und stört die Übersetzung des psdA-Transkripts. RsmY und RsmZ enthalten mehrere CsrA/RsmA-Bindungsstellen innerhalb der vorhergesagten Stammschleifen, die mit mRNAs um die Bindung von CsrA2 und CsrA3 konkurrieren und so die Unterdrückung der Translation antagonisieren.

RsmA (Repressor sekundärer Metaboliten)36 und sein Homolog CsrA (Kohlenstoffspeicherregulator A)37 sind RNA-bindende Proteine, die mit dem 5'-untranslatierten GGA-Motiv von mRNAs in der Nähe der Ribosomenbindungsstelle (RBS) von Zielgenen interagieren und so blockieren Ribosomenzugang38. CsrA/RsmA-Proteine ​​können durch regulatorische RNAs sequestriert werden, was die translationale Unterdrückung von Ziel-mRNAs verringert39. Wir untersuchten, ob CsrA/RsmA zur Pseudoiodininsynthese in P. mosselii 923 beitrug. BLAST-Algorithmen wurden verwendet, um nach CsrA/RsmA-Orthologen im Genom von P. mosselii 923 zu suchen, und drei homologe Gene wurden identifiziert, nämlich csrA1, csrA2 und csrA3. CsrA2 und CsrA3 zeigten eine Aminosäureähnlichkeit von mehr als 75 %, während CsrA1 weniger als 50 % ähnlich war (ergänzende Abbildung 19d).

Deletionsmutagenese und eine psdA::uidA-Transkriptionsfusion wurden verwendet, um zu untersuchen, ob CsrA1, CsrA2 und CsrA3 an der psdA-Expression beteiligt waren. Wir analysierten die csrA1-, csrA2- und csrA3-Expression im Wildtyp 923 und in den ΔcsrA1-, ΔcsrA2- und ΔcsrA3-Mutanten durch Messung der Aktivität des psdA-Promotors. Quantitative GUS-Assays zeigten, dass die durch den psdA-Promotor gesteuerte GUS-Aktivität in den ΔcsrA1-, ΔcsrA2- und ΔcsrA3-Mutanten dramatisch höher war als im Wildtyp-Stamm 923 (ergänzende Abbildung 19f). Diese Ergebnisse zeigten, dass die Deletion von csrA1, csrA2 und csrA3 die Expression von psdA erhöhte, was darauf hindeutet, dass die CsrA-Proteine ​​​​die Transkription des Pseudoiodinin-Biosyntheseoperons unterdrücken. Um weiter zu untersuchen, ob CsrA1, CsrA2 und CsrA3 für die Verbesserung der Pseudoiodininproduktion erforderlich sind, wurden zusätzliche Deletionsmutanten konstruiert, nämlich ΔcsrA1A2, ΔcsrA1A3, ΔcsrA2A3 und ΔcsrA1A2A3. Die Pseudoiodininproduktion war in ΔCSRA2, ΔCSRA3, ΔCSRA1A2, ΔCSRA1A3, ΔCSRA2A3 und ΔCSRA1A2A3 -Mutanten, aber nicht die ΔCSRA -Mutantenstamm (Abb. 5D, E), die mit Antibacterials gegen δCSRA1 -Mutanten stand. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CsrA1, CsrA2 und CsrA3 die psdA-Expression und die Pseudoiodininproduktion negativ beeinflussen und dass CsrA2 und CsrA3 als Hauptregulatoren fungieren (Abb. 5e, f).

Das psdABCDEFG-Operon wurde verwendet, um den genetisch veränderten Stamm P. mosselii ΔcsrA1A2A3-pBSPPc-P2064-RBS-Pseu-ORF zu konstruieren, der auf der Grundlage des GacA-rsmY/Z-CsrA123-Regulationssystems für eine höhere Pseudoiodininproduktion optimiert wurde. Die Kultivierung von P. mosselii 923 in Tryptic-Soja-Brühe (TSB) führte nach einer 36-stündigen Fermentation zu einem gesteigerten Wachstum und deutlich höheren Pseudoiodininspiegeln im Vergleich zu LB-Medium (ergänzende Abbildung 20a, b); Daher wurde für weitere Experimente das TSB-Medium ausgewählt. Als nächstes wurden die Gene csrA1, csrA2 und csrA3 im Stamm 923 gelöscht, was zu 12,5 mg/l Pseudoiodinin gegenüber 1,9 mg/l führte, die vom Wildtyp-Stamm 923 produziert wurden (Abb. 5e). Das psdABCDEFG-Operon wurde dann in die ΔcsrA1A2A3-Mutante eingeführt, um den Stamm ΔcsrA1A2A3-pBSPPc-ABCDEFG (Ergänzungsdaten 1) zu erhalten, was zu einem 16,6-fachen Anstieg der Pseudoiodininproduktion im Vergleich zum Stamm 923 führte (Abb. 5e). Da die RBS-Sequenz des uidA-Gens40 durch RsmA14 gebunden und negativ reguliert werden könnte, haben wir die GUS-Aktivität auf Transkriptions- und Posttranskriptionsebene im Wildtyp-923- und ΔcsrA1A2A3-Mutanten gemessen. Die quantitativen Tests zeigten, dass die GUS-Aktivität auf der Transkriptionsebene dramatisch höher war als auf der Posttranskriptionsebene (ergänzende Abbildung 20c); Dies weist darauf hin, dass die Ribosomenbindung an uidA höher war als die Bindung an psdA. Daher wurde die RBS des Operons so bearbeitet, dass sie durch CsrA1, CsrA2 und CsrA3 durch einstufige Klonierungstechnologie negativ reguliert wird (ergänzende Abbildung 20d). Schließlich wurde die Pseudoiodininausbeute des modifizierten Stamms auf 42,5 mg/l erhöht, was mehr als 22,4-fach höher war als beim Wildtyp P. mosselii 923 (1,9 mg/l) (Abb. 5e). In der Zwischenzeit verglichen wir die antibakterielle Aktivität und das Wachstum für den WT und die überproduzierenden Stämme. Die Ergebnisse zeigten, dass die Überproduktion von Pseudoiodinin die antibakterielle Aktivität sowohl gegen die Krankheitserreger Xoo PXO99A als auch Xoc RS105 verbesserte (ergänzende Abbildung 21a – c). In den ersten 14 Stunden der Fermentation war jedoch ein Rückgang des Wachstums von P. mosselii zu verzeichnen (ergänzende Abbildung 21d – f).

Nützliche Mikroorganismen sind in Agrarökosystemen reichlich vorhanden und dienen der Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten und der Förderung des Pflanzenwachstums26. Die Entdeckung biokontrollierender Mikroorganismen und die Entwicklung natürlich vorkommender Biopestizide ist ein wirksames Mittel zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten und zur Aufrechterhaltung der globalen landwirtschaftlichen Sicherheit. In dieser Studie berichten wir über eine potenzielle BCA von P. mosselii 923 mit spezifischer antagonistischer Aktivität für Xoo, Xoc und M. oryzae. Pseudoiodinin ist die wichtigste antagonistische Verbindung, die von P. mosselii 923 produziert wird, und das psdABCDEFG-Operon reicht für seine Produktion aus.

Von Pseudomonas spp. produzierte biologische Schädlingsbekämpfungsmittel. wurden zur Bekämpfung landwirtschaftlicher Krankheiten eingesetzt, darunter Phenazine, Lipopeptid-Antibiotika und andere Sekundärmetaboliten41. Phenazinderivate (z. B. PCA und Pyocyanin) wurden zur biologischen Bekämpfung von Pilzkrankheiten eingesetzt und an P. fluorescens 2–79, P. chlororaphis PCL1391 und P. aeruginosa 30–8442 untersucht. P. mosselii gilt als ein opportunistischer menschlicher Krankheitserreger, der im Rhizosphärenboden verbreitet ist und bekanntermaßen Krankheitserreger und Insekten hemmt43,44. Beispielsweise wurde der c-xtl-Gencluster, der an der Xantholysin-Biosynthese beteiligt ist, in P. mosselii BS011 entdeckt und hemmte die Entwicklung von M. oryzae45. Kürzlich unterdrückte ein manipulierter P. mosselii-Stamm, der das ripAA-Gen exprimierte, wirksam die bakterielle Welke bei Tabak46. Darüber hinaus war ein neuartiges insektizides Protein aus P. mosselii mit der Bezeichnung PIP-47Aa wirksam bei der Bekämpfung des Maiswurzelbohrers47. In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass der Wildtyp P. mosselii 923 die Fähigkeit besitzt, Xoo (PXO99A), Xoc (RS105) und M. oryzae (R01-1) zu hemmen (Abb. 1a, b). Die von P. mosselii 923 produzierte antimikrobielle Verbindung Pseudoiodinin kann sowohl Xoo (PXO99A) als auch Xoc (RS105) mit EC50-Werten von 0,17 μg/ml bzw. 1,36 μg/ml hemmen (Tabelle 1). Pseudoiodinin zeigt auch eine starke fungizide Aktivität gegen M. oryzae mit einem EC50 von 4,43 μg/ml (ergänzende Abbildung 9c). Unseres Wissens ist dies der erste Bericht, der P. mosselii 923 und Pseudoiodinin als antimikrobielle Mittel für das Wachstum von Bakterien und Pilzen beschreibt.

Vor vierzig Jahren wurde die antimikrobielle Verbindung Pseudoiodinin als Produkt von P. fluorescens var. identifiziert. Pseudoiodinin22. Pseudoiodinin ist ein Mitglied der Pyrazolo[4,3-e][1,2,4]triazin-NP-Familie19. Obwohl über die chemische Synthese von Pseudoiodinin berichtet wurde19, ist die Ausbeute im Allgemeinen niedrig und die Kosten hoch, was die Durchführbarkeit einer synthetischen Quelle einschränkt. Interessanterweise wurden die genetischen Grundlagen der Pseudoiodinin-Biosynthese und des Aufbaus des Moleküls nicht gut untersucht. In dieser Studie wurde gezeigt, dass GacA die Pseudoiodinin-Biosynthese positiv reguliert (Abb. 3a und ergänzende Abb. 13a – c). Frühere Studien haben gezeigt, dass das konservierte GacS/GacA-TCS die Expression mehrerer antimikrobieller Wege in Pseudomonas, einschließlich Genclustern in P. fluorescens48, P. chlororaphis49 und P. aureofaciens50, positiv reguliert. In der aktuellen Studie war die Pseudoiodininproduktion der ΔgacA-Mutante in P. mosselii 923 beeinträchtigt (ergänzende Abbildung 13b, c), was uns dazu veranlasste, die Biosynthese und Regulation von Pseudoiodinin weiter zu untersuchen.

Um die an der Pseudoiodinin-Biosynthese beteiligten BGC zu identifizieren, analysierten wir das Genom und Transkriptom von P. mosselii im Stamm 923 und der ΔgacA-Mutante und stellten fest, dass Gene, die für GTP-Cyclohydrolase und Methyltransferase kodieren, in der ΔgacA-Mutante signifikant unterdrückt waren (Ergänzungstabelle 2). Mutationen wurden in einer Reihe herunterregulierter Gene erzeugt und auf Pseudoiodinin-Biosynthese und antibakterielle Aktivität untersucht; Dies führte zur Identifizierung des psdABCDEFG-Operons (Abb. 3e). psdA und psdF kodieren Methyltransferasen, psdB kodiert ein Mitglied der Glyoxylase-Bleomycin-Resistenzprotein-Dioxygenase-Superfamilie, psdC kodiert einen Sulfatase-modifizierenden Faktor, psdD kodiert eine GTP-Cyclohydrolase und psdE kodiert ein WD-40-Repeat-Protein. Durch die Löschung dieser sechs psd-Gene wurde die Pseudoiodininproduktion stark aufgehoben und die Komplementierung stellte die Produktion wieder her (Abb. 3c, d), was darauf hinweist, dass psdABCDEF für die Pseudoiodininbiosynthese notwendig ist. Die antibakterielle Aktivität und die Pseudoiodininproduktion der ΔpsdG-Mutante waren nur teilweise abgeschwächt (Abb. 3b, c). Die Sequenzanalyse von psdG zeigt, dass es ein RibD-Protein kodiert, das bei der Riboflavin-Biosynthese eine Rolle spielt. Es ist allgemein bekannt, dass Riboflavin (Vitamin B2) als Cofaktor und Signalmolekül fungiert51 und psdG könnte eine Rolle bei der strukturellen oder funktionellen Stabilität von Pseudoiodinin spielen. Pseudoiodinin wurde in P. putida KT2440 produziert, als das psdABCDEFG-Operon in trans exprimiert wurde (Abb. 4a), was bestätigt, dass das psdABCDEFG-Operon für die Pseudoiodinin-Biosynthese in Pseudomonas ausreicht.

Die vorhergesagten Aminosäuresequenzen von PsdD und PsdG weisen eine signifikante Ähnlichkeit mit Genen auf, die für die Toxoflavin-Biosynthese kodieren, was darauf hindeutet, dass Pseudoiodinin teilweise über einen Biosyntheseweg synthetisiert werden könnte, der mit Toxoflavin gemeinsam oder diesem ähnlich ist33. Wir schlagen vor, dass diese Reaktion durch eine Abfolge von Ringkontraktions- und Methylierungsschritten Pseudoiodinin erzeugt (Abb. 4b). 1,6-DDMT wird als biosynthetisches Zwischenprodukt von Pseudoiodinin bestätigt, wenn die Mutantenstämme ΔpsdC oder ΔpsdE damit gefüttert wurden und die Pseudoiodininproduktion wiederhergestellt wurde (ergänzende Abbildung 18). Allerdings wurde 1,6-DDMT weder im Wildtyp P. mosselii 923 noch in Mutantenstämmen nachgewiesen, von denen wir annahmen, dass sie sich schnell in das nächste Zwischenprodukt verwandeln. Es sollte darauf hingewiesen werden, dass die durch PsdE und PsdC vermittelte Bildung von 1,6-DDMT unklar bleibt und ein detaillierter Ringkontraktionsweg zu Pseudoiodinin weiterer Untersuchung bedarf.

Frühere Studien haben gezeigt, dass GacA und CsrA/RsmA auf der posttranskriptionellen Ebene eine gegensätzliche regulatorische Rolle bei Zielgenen spielen52,53. Unsere EMSA-Ergebnisse zeigten, dass GacA an die Promotorregionen von zwei nichtkodierenden kleinen RNAs, rsmY und rsmZ, bindet (ergänzende Abbildung 19b, c) und die Bindung die Transkription des synthetischen Pseudoiodinin-Genclusters aktiviert. Weitere bioinformatische Studien zeigten, dass P. mosselii 923 drei homologe csrA-Gene enthielt, nämlich csrA1, csrA2 und csrA3 (ergänzende Abbildung 19d). Deletionsmutagenese und posttranskriptionelle uidA-Fusionen wurden verwendet, um zu zeigen, dass CsrA1, CsrA2 und CsrA3 die psdA-Expression und Produktion von Pseudoiodinin negativ regulierten (Abb. 5d, e und ergänzende Abb. 19e, f). Interessanterweise war eine GGA-Stelle in der 5'-untranslatierten Region des psdA-RBS vorhanden, was darauf hindeutet, dass CsrA die psdA-Expression unterdrücken könnte, indem es an das Leader-Transkript bindet und den Ribosomenzugang blockiert (Abb. 5f). Weitere Experimente sind erforderlich, um festzustellen, wie CsrA mit der Ziel-mRNA interagiert. Der Mechanismus, durch den Pseudoiodinin seine antimikrobielle Aktivität ausübt, wurde jedoch noch entdeckt, was weitere Untersuchungen erfordert. Dieser Bericht identifiziert GacA und CsrA weiter als wichtige Regulatoren der Pseudoiodinin-Biosynthese und erweitert unser Verständnis von Pseudoiodinin als antimikrobielles Mittel sowohl für Bakterien als auch für Pilze.

Mikroorganismen sind die Quelle vieler bioaktiver Sekundärmetaboliten, darunter Antibiotika, Antitumor- und antivirale Verbindungen, die in der Landwirtschaft und Medizin verwendet werden können54. Aus der Natur isolierte Wildtyp-Stämme produzieren jedoch im Allgemeinen begrenzte Mengen an Sekundärmetaboliten, was Strategien zur Verbesserung der Metabolitenausbeute erfordert55. In der aktuellen Studie verwendeten wir einen mehrstufigen Ansatz zur Verbesserung der Pseudoiodininausbeute, einschließlich der Entwicklung eines überexprimierenden Stamms, der Löschung der negativen regulatorischen Gene, der Modifikation des RBS und der Optimierung des Kulturmediums. Diese Ansätze führten zur Entwicklung eines gentechnisch veränderten Stamms, der 22,4-fach mehr Pseudoiodinin produzierte als der Wildtyp mit durchschnittlichen Ausbeuten von 42,5 mg/l (Abb. 5e). Weitere Methoden zur Steigerung der Produktivität von Pseudoiodinin sind erforderlich, einschließlich der Fermentation im industriellen Maßstab. Weitere Strategien zur Maximierung der Produktausbeuten umfassen Promotormanipulation, Genomik, Protein-Engineering, Metabolomik und Metabolitenprofilierung56,57, die zur Steigerung der PCA-Ausbeuten durch den P. aeruginosa-Stamm PA120157 eingesetzt wurden.

Pestizide werden nicht nur in China, sondern auch weltweit häufig zur Bekämpfung von Pflanzenkrankheiten eingesetzt. Beispielsweise wurde Shenqinmycin (PCA) verwendet, um Reis- und Gemüsepflanzen vor Reisscheidenfäule, Pfefferfäule und Keimlingsfäule zu schützen58. Unsere Studie hat gezeigt, dass Pseudoiodinin BLB, BLS und Reisbrand, verursacht durch die Krankheitserreger Xoo, Xoc und M. oryzae, verhindern kann, ohne den Reis im Gewächshaus negativ zu beeinflussen (Ergänzende Abbildungen 10–12); Unsere Feldversuche zeigen, dass Pseudoiodinin die Läsionsbereiche von BLB mit einer Biokontrolleffizienz von mehr als 50 % bei Konzentrationen > 5 μM deutlich reduzieren kann (ergänzende Abbildung 3b, c).

Bei der Analyse anderer Pseudomonaden für den psdABCDEFG-Gencluster stellten wir fest, dass dieser konserviert war; Allerdings gibt es in P. fluorescens keine Homologen des psd-Operons. Insbesondere der Typstamm P. mosselii DSM17497 beherbergte einen 6931 bp großen Gencluster (orf2184, orf2185, orf2186, orf2187, orf2188, orf2189, orf2190) mit 99 % Aminosäureähnlichkeit zum Pseudoiodinin-Operon. In den Genclustern P. mosselii 923 und DSM17497 wurden mehrere Unterschiede wie folgt festgestellt: (i) die Aminosäure an Position 39 in Orf2185 ist in DSM17497 von Lys (K) zu Asn (N) mutiert (ergänzende Abbildung 16a); (ii) der Rest an Position 89 in Orf2186 ist von Thr (T) zu Ala (A) mutiert (ergänzende Abbildung 16b); und Reste an den Positionen 158 und 208 in Orf2190 werden von Tyr (Y) zu His (H) bzw. Ser (S) zu Val (V) mutiert (ergänzende Abbildung 16c).

Interessanterweise produzierte P. mosselii DSM17497 keine nachweisbaren Mengen an Pseudoiodinin und hemmte Xoo PXO99A nicht. Um zu untersuchen, ob der psd-Cluster von P. mosselii DSM17497 funktionsfähig war, erzeugten wir jeweils zwei Replikatstämme der P. mosselii 923-Mutanten ΔpsdB, ΔpsdC und ΔpsdG, die eine eingeführte Kopie des psd-Operons DSM17497 enthielten. Überraschenderweise wurden die bakteriostatische Aktivität und die Pseudoiodininproduktion in den komplementierten Stämmen auf das Niveau des Wildtyps 923 wiederhergestellt (ergänzende Abbildung 17a, b). Darüber hinaus wurden orf2184-orf2190 in P. mosselii DSM17497 exprimiert (ergänzende Abbildung 17c), was darauf hinweist, dass der Pseudoiodinin-Gencluster in P. mosselii DSM17497 transkribiert wurde. Es bleibt möglich, dass in DSM17497 Inhibitoren oder Repressoren existieren, die die Synthese oder den Export von Pseudoiodinin oder seinen Vorläufern unterdrücken. Das Fehlen einer Pseudoiodininproduktion durch P. mosselii DSM17497 erfordert weitere Untersuchungen, die hoffentlich die Wirksamkeit von Pseudomonas als Biokontrollmittel verbessern werden.

Zusammenfassend beschreibt unsere Studie P. mosselii 923 als Biokontrollmittel und Pseudoiodinin als potenzielles grünes Biopestizid. Der Pseudoiodinin-BGC und der vorhergesagte Biosyntheseweg könnten weitere Studien zum Wege-Engineering und zur Produktion im großen Maßstab anregen. Darüber hinaus kann das zugrunde liegende regulatorische Netzwerk GacA-rsmY/Z-CsrA123 eingesetzt werden, um höhere Ausbeuten an Pseudoiodinin zu erzielen (Abb. 5f). Dies ist dringend erforderlich, da die durch X. oryzae und M. oryzae verursachten Krankheiten weiterhin die Reiserträge begrenzen und wachsame Interventionsmethoden erfordern.

Phytopathogene Xanthomonas spp. wurden in Nähragar (NA) bei 28 °C59 kultiviert, und die E. coli-Stämme DH5α und BL21(DE3) wurden in Luria Bertani (LB)60-Medium bei 37 °C kultiviert. Tryptische Sojabrühe (TSB; 30 g/L) wurde zur Kultivierung von Pseudomonas-Stämmen bei 30 °C verwendet. Der Pilz M. oryzae R01-1 wurde in Haferflocken (OAM)61-Medium bei 25 °C gezüchtet. Die in dieser Studie verwendeten Stämme, Plasmide und Primer sind in den Zusatzdaten 1 und 2 aufgeführt. Bei Bedarf wurden Antibiotika in den folgenden Endkonzentrationen (µg mL−1) zugesetzt: Kanamycin (Km), 25; Rifampicin (Rif), 75; Gentamicin (Gm), 20; und Spectinomycin (Sp), 25. Chemische Reagenzien einschließlich Petrolether, Ethylacetat, n-Butylalkohol und Methanol wurden von Macklin (Shanghai, China) bezogen. Phenazin-1-carbonsäure (PCA) wurde von Dr. Yawen He (School of Life Sciences and Biotechnology, Shang Hai Jiao Tong University) bereitgestellt. Restriktionsenzyme wurden von Takara Bio (Europe AB) gekauft.

NMR-Spektren wurden mit einem Bruker Avance III 600 MHz-Spektrometer (Deutschland) aufgezeichnet. Die Proben wurden in deuteriertem Methanol (CD3OD) oder deuteriertem Chloroform (CDCl3) gelöst. Die ESI-MS-Analyse der Verbindungen wurde auf einem Agilent UPLC 1290 Infinity II/6545 Q-TOF (USA) durchgeführt. Sowohl die semipräparative HPLC als auch die analytische HPLC wurden mit einer Agilent Technologies 1260 Infinity II HPLC mit einem DAD-Detektor durchgeführt. Die Säulen waren wie folgt: Fisher Wharton C18-Säule (250 × 10 mm, 5 μm, USA) (für semipräparative HPLC) und Agilent C18-Säule (150 × 4,6 mm, 5 μm, USA) (für analytische HPLC). 1,6-DDMT wurde von Princeton Biomolecular Research erworben (Katalog-Nr. PBMR 232664).

Um Bakterien mit antimikrobieller Aktivität für Xoc RS105 zu isolieren, wurden Bodenproben (n = 248) aus der Rhizosphäre entnommen5. Kurz gesagt, 10 g Probe wurden gleichmäßig mit 90 ml sterilisiertem Wasser gemischt, dann wurde diese Suspension mit sterilisiertem Wasser auf verschiedene Gradienten verdünnt. 100 μl obige Lösung wurden auf NA-Medium mit RS105 ausplattiert. Der Antagonismus von Bodenbakterien gegenüber Xoc, Xoo und anderen Krankheitserregern wurde mit der Kirby-Bauer (KB)62-Methode bewertet. Alle Stämme wurden dreifach getestet und die Hemmzonen gegenüber pathogenen Bakterien wurden 2–3 Tage nach der Kultivierung bei 28 °C auf NA und M. oryzae R01-1 5 Tage nach der Kultivierung bei 25 °C auf OAM gemessen.

Die 16S-rRNA des Stamms 923 wurde mit den Universalprimern 27F und 1492R (Supplementary Data 2) unter Verwendung etablierter Methoden amplifiziert5. Das vollständige Gen wurde von BioSune Biotech (Shanghai, China) gereinigt und sequenziert und für Blast-Suchen in der Datenbank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) verwendet. Die 16S-rRNA-Sequenzen für 14 repräsentative Pseudomonas spp. wurden aus der NCBI-Datenbank erhalten und ein phylogenetischer Baum basierend auf 16 S-rRNA wurde mithilfe von Neighbor-Joining-Analysen mit MEGA 7.063 erstellt. Zur Bewertung des Konfidenzniveaus wurde ein Bootstrap-Test mit 1000 Replikaten verwendet, und die Internodien der Zweige stellten einen Konfidenzprozentsatz von > 50 % dar. Das gesamte Genom von 923 wurde mithilfe der Sequenzierungsplattform Illumina Miseq PacBio bei Personalbio (Shanghai, China) sequenziert. Die durchschnittlichen Nukleotididentitätswerte (ANI) wurden mithilfe des J Species WS-Onlinedienstes64 berechnet. Um die genaue phylogenetische Position des Stamms 923 zu bestimmen, wurden alle öffentlich verfügbaren Pseudomonas-Genomsequenzen und verwandten Stämme aus der NCBI-GenBank-Datenbank abgerufen und in die phylogenetischen Analysen gemäß Type Genome Server (TYGS) (https://tygs.dsmz) einbezogen. de). Die Gesamtgenomsequenz des Stamms 923 wurde in der NCBI BioProject Database (BioProject ID: PRJNA826312) hinterlegt.

Stamm 923 wurde in 50 ml LB-Brühe bei 30 °C unter Belüftung bei 220 U/min 12 Stunden lang kultiviert, dann 1:100 in 2-l-Kolben mit 300 ml LB-Brühe verdünnt und 24 Stunden bei 30 °C und 220 U/min inkubiert. Die Fermentation wurde dreimal mit jeweils gleichen Volumina Petrolether, Ethylacetat und n-Butylalkohol bei Raumtemperatur extrahiert. Die organische und die wässrige Phase wurden mit einem Rotationsverdampfer konzentriert, gefriergetrocknet und in 1 ml Methanol bzw. sterilem Wasser resuspendiert. Fünfzig Mikroliter der oben genannten vier Proben wurden entnommen und mit Xoo PX099A wie zuvor beschrieben auf antibakterielle Aktivität untersucht5.

Der Ethylacetatextrakt zeigte die größte antagonistische Aktivität gegen Xoo PX099A. Es wurde eine groß angelegte Fermentation durchgeführt und eine 10-l-Charge der Fermentation wurde weiter mit Ethylacetat extrahiert. Der gelatineartige Rohextrakt wurde dann auf eine C18-Umkehrphasen-Kieselgelsäule (MeOH/H2O, 3:7 bis 9:1) geladen. Aus der Säule wurden zwölf Fraktionen gewonnen und durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer C18-Säule (Agilent C18-Säule, 250 × 20 mm, 5 μm, USA) weiter gereinigt (Methode A). Mit diesem Ansatz wurden sieben Verbindungen isoliert und als PM-1, PM-2, PM-3, PM-4, PM-5, PM-6 und PM-7 bezeichnet. Die antagonistische Aktivität jeder Verbindung wurde gegen PX099A nach Konzentration mit Methanol als Kontrolle getestet.

HPLC-Vorbereitung und Analysemethode: Methode A (Vorbereitung): Die Anfangskonzentration von 15 % Methanol wurde 2 Minuten lang aufrechterhalten und die Elutionsgradienten verliefen wie folgt: linearer Methanolgradient von 15 bis 100 %, 2–18 Minuten; 100 % Methanol, 18–22 Min.; 100 bis 15 % Methanol, 22–26 Min.; und 15 % Methanol, 26–30 Min. Die Flussrate betrug 5 ml/min mit einem UV-Detektor (Wellenlänge: 210 und 500 nm). Methode B (Analyse): HPLC unter Verwendung der Lösungsmittel A (Wasser) und B (Methanol) mit einer Flussrate von 0,4 ml/min (Agilent C18-Säule, 150 × 4,6 mm, 5 μm, USA, 210 und 500 nm). Die anfängliche Konzentration von 5 % Methanol wurde 4 Minuten lang aufrechterhalten, gefolgt von den folgenden Gradienten: 5 bis 20 % Methanol, 4–25 Minuten; 20 bis 100 % Methanol, 25–26 Min.; 100 % Methanol, 26–32 Min., 100–5 % Methanol, 32–33 Min. und 5 % Methanol, 33–40 Min.

Die Summenformel von PM-3 wurde durch UPLC/Q-TOF-MS als C6H7N5O bestimmt (m/z 166,0722 [M + H]+, berechnet für C6H8N5O, 166,0729) mit sechs IHDs (Index für Wasserstoffmangel). Die 1H- und 13C-NMR-Daten (Ergänzende Abbildungen 5, 6) zeigten das Vorhandensein von zwei Methylgruppen (δH 4,27, 4,44; δC 43,3, 57,7) und einem aromatischen Proton (δH 9,14). Da das Molekül zu viele quartäre Kohlenstoff- und Stickstoffatome enthält, war es schwierig, die planare Struktur von PM-3 weiter zu bestimmen. Glücklicherweise wurde nach vielen Versuchen durch Lösungsmittelverdampfung ein winziger Kristall im Methanol-Lösungsmittel erzeugt. Schließlich wurde die vollständige Struktur von PM-3 durch Röntgenbeugung bestimmt (Abb. 2c) und war mit Pseudoiodinin identisch.

Impfkulturen (500 μl) wurden in 250-ml-Kolben in 50 ml LB oder TSB geimpft. Um Pseudoiodinin zu extrahieren und zu quantifizieren, wurde 1 ml Kultur gesammelt und zweimal mit gleichen Volumina Ethylacetat extrahiert. Anschließend wurde die organische Phase gesammelt und bei 30 °C getrocknet. und der resultierende Rückstand wurde in 100 μl Methanol gelöst. Rohextrakte (5 μl) wurden für die HPLC-Analyse (Methode B) gesammelt. Die Pseudoiodininproduktion wurde anhand der Peakfläche (A) im HPLC-Eluat gemäß der folgenden Formel quantifiziert: A = 776,86 Pseudoiodinin (mM) + 52,234. Die Formel wurde aus einer Kalibrierungskurve mit gereinigtem Pseudoiodinin abgeleitet, das einen Korrelationskoeffizienten (R2) von 0,999 aufwies. Das Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander wiederholt.

P. mosselii-Stämme wurden 12 Stunden lang in 3 ml LB bei 30 °C und 220 U/min kultiviert. Geerntete Zellen wurden unter Verwendung von TSB-Medium auf eine Endkonzentration von OD600 = 2,0 suspendiert. Es wurden Reihenverdünnungen hergestellt und 100-μl-Aliquots auf LB-Medium, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika, über Nacht bei 30 °C inkubiert. Für die Wachstumskurve wurden 10 ml Fermentationskulturen in 50 ml-Kolben mit TSB wie oben beschrieben hergestellt und bei 30 °C und 220 U/min inkubiert. Das Wachstum der Kulturen wurde durch regelmäßige Messungen innerhalb von 36 Stunden mittels Spektrophotometrie bei 600 nm (OD600) verfolgt. Dieses Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander wiederholt.

Zwanzig Samen der Reissorte Yuanfengzao wurden in Plastiktöpfe (16 × 12 cm) gesät, die im Gewächshaus bei 14 Stunden Licht (30 °C)/10 Stunden Dunkelheit (28 °C) und 65 % relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wurden. Reissämlinge wurden nach 21-tägiger Kultivierung (3–6-Blatt-Stadium) für Biokontrolltests verwendet. Reispflanzen im Dreiblattstadium eignen sich sowohl für Xoo- als auch für Xoc-Biokontrolltests. Reispflanzen im Sechsblattstadium eignen sich für Xoo- und Xoc-Sprühimpfungen im Gewächshaus. Zellsuspensionen von Xoc RS105 und Xoo PXO99A (OD600 = 0,6) und P. mosselii 923 (OD600 = 0,5) wurden im Voraus hergestellt. Kurz gesagt, diese Stämme wurden bis zur mittleren exponentiellen Phase kultiviert, zentrifugiert und zweimal mit sterilem destilliertem Wasser bis zu einer OD600 von 0,5–0,6 gewaschen. Der Überstand der 923-Kultur (SUP) wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 13.800 × g hergestellt. Es wurden Pseudoiodinin-Stammlösungen mit MHK-Werten von 4 µg/ml für Xoc RS105 und 0,5 µg/ml für PXO99A hergestellt. Als Kontrolle wurde steriles destilliertes Wasser (MOCK) verwendet.

Biokontrolltests an Reissämlingen im Dreiblattstadium wurden durch Spritzeninjektion inokuliert. Kurz gesagt, Yuanfengzao-Reisblätter wurden 3 Stunden vor (Tre) und nach (Vor-)Inokulation mit Wasser, 923, ΔpsdA (OD600 = 0,5) oder 923 SUP mit einer nadellosen Spritze mit Xoc RS105-Gus (OD600 = 0,6) beimpft und dann beibehalten im Gewächshaus. Die Länge der Krankheitsläsionen wurde nach 7 Tagen gemessen. Yuanfengzao-Reispflanzen im Sechsblattstadium wurden mit Bakterienzellsuspensionen (2 ml von 1,0 × 108 KBE ml−1) besprüht. Die Behandlungen waren wie folgt: (1) Reispflanzen, die mit den Stämmen RS105 oder PXO99A inokuliert wurden; (2) Reis, der mit den Krankheitserregern RS105 oder PXO99A beimpft und dann mit Wasser, Stamm 923 (2 ml Suspension) oder Pseudoiodinin (5 ml) als Tre-Behandlungen behandelt wurde; (3) Reis, der 12 Stunden vor der Sprühimpfung mit RS105 oder PXO99A als Vorbehandlung mit Wasser, Stamm 923 (2 ml) oder Pseudoiodinin (5 ml) beimpft wurde; und (4) sterile, mit destilliertem Wasser inokulierte Kontrollen (MOCK). Bei jeder Behandlung wurde 0,05 % (v:v) Tween-20 (Sangon Biotech, Kat.-Nr. A600560) verwendet. Krankheitsläsionsbereiche wurden auf Blättern (n = 20) 15 Tage lang gemessen und das Bakterienwachstum wurde 7, 14 und 21 Tage nach der Inokulation gemessen. Kurz gesagt, drei 4 cm lange Stücke aus den Blattspitzen wurden mit einer sterilen chirurgischen Schere herausgeschnitten und mit 75 % Ethanol (30 Sekunden), 3 % Natriumhypochlorit (3 Minuten) und sterilem destilliertem Wasser (1 Minute) behandelt. Das Blattmaterial wurde dann mit einem Gewebezerkleinerer (JX-FSTPRP) bei 55 Hz (zweimal für 1 Minute) mazeriert und dann 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gehalten. Es wurden Reihenverdünnungen hergestellt und auf NA, ergänzt mit den entsprechenden Antibiotika, 3–4 Tage lang bei 28 °C inkubiert, bis einzelne Kolonien gezählt werden konnten (>100/Platte). Die oben genannten Inokulationsexperimente wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt.

Für Biokontrolltests im Feld wurde die Reissorte Yuanfengzao in Reisfelder (1 × 2 m) gesät. Im Feldversuch wurden nur die Fahnenblätter von Reispflanzen für die Messung in einem Fünf-Punkte-Probenahmeverfahren ausgewählt, wobei ein Punkt 10 Reispflanzen und ein Fahnenblatt pro Pflanze umfasst. Für jede Behandlung wurden insgesamt 50 Blätter ausgewertet. Der Schweregrad der BLS- und BLB-Erkrankung wurde anhand der Läsionsfläche auf den Blättern (n = 15) 15 Tage nach der Inokulation untersucht. Die Feldversuche wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt.

Rice Lebenslauf. CO39 (Oryza sativa L. subsp. indica) ist sehr anfällig für M. oryzae und wurde für Infektionsstudien ausgewählt. Konidiensuspensionen wurden in einer Endkonzentration von 1 × 105 Konidien ml–1 hergestellt, indem 10 Tage alte M. oryzae-Kulturplatten mit sterilem destilliertem Wasser, das 0,05 % (v:v) Tween-20 enthielt, wie oben geflutet wurden. Die Suspension wurde dann auf 2 Wochen alte Pflanzen gesprüht. Pseudoiodinin wurde 24 Stunden vor (Pre) und nach (Tre) der Inokulation mit M. oryzae R01-1-Sporen in einer Konzentration von 40 μM auf die Oberfläche von Reisblättern gesprüht. Die Pflanzen wurden 24 Stunden lang in Lagerkästen gestellt, um eine hohe Luftfeuchtigkeit mit einer Hell-Dunkel-Photoperiode von 14:10 Stunden bei 25 °C und 90 % relativer Luftfeuchtigkeit aufrechtzuerhalten. Der Schweregrad der Erkrankung wurde mittels Bildgebung mit 7 dpi aufgezeichnet. Die relative Fläche der Läsionen wurde mit Adobe Photoshop CS5 berechnet. Das Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander wiederholt.

Unsere früheren Untersuchungen haben gezeigt, dass von pHM1 abgeleitete Vektorsysteme, einschließlich pHG1, effizient, stabil und für die Genexpressionsanalyse in X. oryzae-Stämmen und für die Verfolgung von Infektionen in Reisblättern geeignet sind40. Frühere Untersuchungen mit pHM1-Vektoren zeigten, dass die Intensität der GUS-Färbung in Reisblättern mit der Bakterienvermehrung korrelierte; Daher wurde die GUS-Aktivität von Xoc RS105-Gus-markierten Stämmen in den Reisgeweben gemäß unseren vorherigen Protokollen getestet65. Die detaillierte Methode wurde in den ergänzenden Methoden beschrieben. Jede Behandlung wurde an drei Blättern wiederholt und es wurden drei unabhängige Experimente durchgeführt.

Die GUS-Aktivität in P. mosselii-Stämmen wurde mithilfe eines modifizierten Protokolls bewertet. Kurz gesagt, P. mosselii 923 und Mutanten wurden in LB, das Spectinomycin enthielt, über Nacht bei 30 ° C kultiviert. Bakterienzellen wurden in 2-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gesammelt (drei Replikate), zweimal mit 1 ml sterilem Wasser gewaschen und auf eine OD600 von 0,5 eingestellt. Qualitative und quantitative GUS-Analysen von P. mosselii 923 und Mutanten wurden wie in den ergänzenden Methoden beschrieben durchgeführt.

Die multiplen Klonierungsstellen (MCS) im Promotorsondenvektor pNG1 wurden stromaufwärts von uidA positioniert und die NdeI-Stelle überlappte mit der Translationsstartstelle (ATG). Daher haben wir uidA-Promotor-Sonden-Fusionen auf Transkriptions- und Posttranskriptionsebene erstellt. Die psdA-Promotorregion wurde als EcoRI/KpnI-Fragment in pNG1 kloniert, um pNG1-P2064 mit der psdA-Promotor-uidA-Fusion zu erzeugen (Supplementary Data 1). Mit einem ähnlichen Ansatz wurde der psdA-Promotor als EcoRI/NdeI-Fragment in pNG1 kloniert, was zu einer translatorischen Fusion mit uidA führte; Das resultierende Konstrukt wurde als pNG1-P2064-post bezeichnet (Supplementary Data 1).

Die Mutagenese des P. mosselii-Stammes 923 mit EZ-Tn5 und die Charakterisierung der Insertionsstellen wurden unter Verwendung etablierter Protokolle5 durchgeführt. Kurz gesagt, 1 μl EZTn5 aus dem EZ-Tn5™ Tnp Transposome™ Kit (Lucigen, TSM08KR) wurde in 923 kompetente Zellen elektroporiert und anschließend Mutanten gescreent, die die antagonistische Aktivität gegen Xoo PXO99A vollständig verloren oder teilweise abgeschwächt hatten. Die gerettete Klonierung der EZ-Tn5 -Transposon-Insertionsstelle in der 923-Genom-DNA erfolgte gemäß den Protokollen des Herstellers.

Eine gacA-Deletionsmutante wurde durch sacB-vermittelte doppelte homologe Rekombination erzeugt. Sequenzen, die gacA bei 716 bp stromaufwärts und 487 bp stromabwärts flankieren, wurden durch PCR unter Verwendung der Primer gacA-up-F1/gacA-up-R1 bzw. gacA-down-F2/gacA-down-R2 (Supplementary Data 2) amplifiziert. Die stromaufwärts und stromabwärts amplifizierten Produkte wurden gelgereinigt, mit NdeI/KpnI bzw. Nach der Ligation wurde dieses Konstrukt in DH5α-kompetente E. coli-Zellen eingeführt und auf Km enthaltendem LB kultiviert. Kolonien, die p24-gacA enthielten, wurden durch PCR mit M13-F- und M13-R-Primern (Supplementary Data 2) bestätigt und sequenziert. Das Plasmid p24-gacA wurde durch Elektroporation in P. mosselii 923 eingeführt und Kolonien mit Kanamycinresistenz und Saccharoseempfindlichkeit wurden nacheinander auf NAN (NA ohne Saccharose) mit Km (NAN + Km) und NAS (NA mit 10 % Saccharose) selektiert. NAS-überlebende Kolonien wurden einzeln auf NA und NA + Km kultiviert, und Kolonien, die auf NA, aber nicht auf NA + Km wuchsen, wurden durch PCR mit Primern in Supplementary Data 2 bestätigt. Die Deletion von gacA wurde durch Sequenzanalyse bestätigt und durch Tests weiter verifiziert Bakteriostase und Pseudoiodininproduktion wie oben beschrieben.

Ein 1074-bp-Fragment, das gacA und die Upstream-Promotorregion enthielt, wurde durch PCR mit den Primern gacA-com-F und gacA-com-R amplifiziert (Supplementary Data 2). Das PCR-Produkt wurde als EcoRI/KpnI-Fragment in pUFR034 kloniert, um das rekombinante Plasmid pUFR-gacA zu ergeben; Dieses Konstrukt wurde durch PCR mit M13-Primern bestätigt, sequenziert und dann durch Elektroporation in P. mosselii 923 und den ΔgacA-Mutanten eingeführt. Kolonien wurden auf Km enthaltendem LB ausgewählt, durch PCR identifiziert und durch Tests auf Bakteriostase und Pseudoiodininproduktion weiter bestätigt. Die komplementierten mutierten und gacA-überexprimierenden Stämme wurden als CΔgacA bzw. 923 pUFR-gacA bezeichnet.

Wildtyp P. mosselii 923 (WT) und die Knockout-Mutante ΔgacA (KO) wurden 24 Stunden lang in LB kultiviert. Von jedem Stamm wurden drei biologische Replikate hergestellt. Bakterienzellen (1 ml) wurden gesammelt und 2 Minuten lang bei 9600 × g und 4 ° C zentrifugiert; Dies wurde mit einem weiteren 1-ml-Aliquot an Zellen wiederholt. Die Überstände wurden entfernt, 15 Minuten in flüssigem Stickstoff eingefroren und bis zur Verwendung bei –80 °C gelagert.

Die RNA-Seq wurde von Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd. mit dem Illumina HiSeq-System durchgeführt. Das DEseq R-Paket wurde verwendet, um DEGs von KO im Vergleich zu WT zu analysieren, und ein korrigierter P-Wert (q-Wert) <0,005 und eine log2-fache Änderung >1 wurden verwendet, um die Signifikanz festzustellen. Vulkandiagramme wurden mit dem R-Sprachpaket ggplots2 und plot_volcano von soothsayer (https://github.com/jolespin/soothsayer) in Python v. 3.6.6 erstellt. Heatmaps wurden mit der R-Sprache und dem Pheatmap-Softwarepaket (https://rdrr.io/cran/pheatmap/) erstellt. Zur Berechnung der Entfernung bzw. der Clusterbildung wurden euklidische und vollständige Verknüpfungsmethoden verwendet.

Um die RNA-seq-Daten zu verifizieren, wurden drei unabhängige quantitative Echtzeit-PCR-Analysen (RT-qPCR) an WT- und KO-Proben durchgeführt, wobei die gleichen Behandlungen wie für die RNA-seq verwendet wurden. Fünfzehn DEGs wurden zufällig zur sekundären Bestätigung durch RT-qPCR-Analyse ausgewählt. Die Gesamt-RNA von WT- und KO-Proben wurde mit dem EasyPure RNA Kit (Transgen Biotech) extrahiert. cDNA wurde mit dem cDNA Synthesis Super Mix Kit (Transgen Biotech) hergestellt. Mit SYBR grün markierte PCR-Fragmente wurden amplifiziert und RT-qPCR wurde mit einem ABI7500 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, USA) durchgeführt. rpoD wurde als internes Kontroll- und Referenzgen verwendet und die 2−ΔΔCt-Methode wurde zur relativen Quantifizierung verwendet67. Alle RT-qPCR-Reaktionen wurden dreimal oder mehrmals unabhängig voneinander unter Verwendung der in den Ergänzungsdaten 2 aufgeführten Primer durchgeführt.

Die Löschung einzelner psd-Gene wurde durch sacB-vermittelte doppelte homologe Rekombination wie oben beschrieben erreicht. Die zur Amplifikation der jedes Gen flankierenden Sequenzen verwendeten Primer sind in den Zusatzdaten 2 aufgeführt. Deletionsmutanten wurden durch PCR mit entsprechenden Primern (Ergänzungsdaten 2) identifiziert und weiter auf Bakteriostase und Pseudoiodininproduktion untersucht. Die anderen in dieser Studie beschriebenen Deletionsmutanten wurden ebenfalls mithilfe der sacB-vermittelten doppelten homologen Rekombination erzeugt.

Für Komplementationsanalysen wurden psdA, psdB, psdC, psdD, psdE, psdF und psdG sowie der psdA-Promotor amplifiziert und in pBSPPc kloniert, um die Plasmide pBS-psdA, pBS-psdB, pBS-psdC, pBS-psdD und pBS-psdE zu erhalten , pBS-psdF bzw. pBS-psdG. (Ergänzende Daten 1). Anschließend wurden die Konstrukte in die entsprechenden Deletionsmutanten eingeführt und auf Komplementierung getestet. Die rsmY- und rsmZ-Mutanten wurden durch Klonierung in pUFR034 unter Verwendung desselben Protokolls ergänzt.

Die Plasmide pBSPPc-Pseu-ORF und pNG1-P2064 wurden wie oben beschrieben konstruiert. Die verwendeten Primer sind in den Zusatzdaten 2 aufgeführt und wurden von Shanghai Generay Biotech Co., Ltd. synthetisiert. Linearisiertes pBSPPc-Pseu-ORF wurde durch umgekehrte PCR mit den Primern pBS-Pseu-F2 und pBS-Pseu-R2 erhalten und mit linearisiertem pNG1 gemischt -P2064 (Ergänzende Abbildung 20d); Die Rekombination erfolgte unter Verwendung der Protokolle, die mit dem ClonExpress II One Step Cloning Kit (Vazyme, Nanjing, China) geliefert wurden. Das Rekombinationsprodukt pBSPPc-P2064-RBS-Pseu-ORF wurde zur Transformation von Empfängerzellen verwendet.

Das Sieben-Gen-Operon (psdABCDEFG) wurde mit seinem nativen Promotor in pBSPPc kloniert. Das 7,2-kb-DNA-Fragment wurde mit den Primern pBS-Pseu-F und pBS-Pseu-R (Supplementary Data 2) amplifiziert und unter Verwendung eines Gelextraktionskits gereinigt. Das 7,2-kb-Fragment wurde in XbaI/BamHI-verdautes pBSPPc eingefügt und gemäß den Anweisungen des ClonExpressII One Step Cloning Kit kloniert. Das resultierende Konstrukt wurde als pBSPPc-ABCDEFG bezeichnet; Dies wurde durch Elektroporation in P. putida KT2440 eingeführt und durch PCR verifiziert.

Der manipulierte P. putida-Stamm wurde in 20 ml TSB, ergänzt mit 20 μg/ml Gentamicin, kultiviert und die Zellen wurden 24 Stunden lang bei 30 °C und 220 U/min gezüchtet. Die Fermentationsbrühe wurde zentrifugiert und der Überstand dreimal mit gleichen Volumina Ethylacetat extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen wurden konzentriert und zur HPLC-Analyse (Methode B) in Methanol gelöst.

Für Überexpressionsexperimente enthielt das Plasmid pBSPPc-ABCDEFG (Supplementary Data 1) das psdABCDEFG-Operon und sein nativer Promotor wurde wie oben beschrieben in P. mosselii ΔcsrA1A2A3 eingeführt und auf Pseudoiodininproduktion analysiert.

Der homologe Pseudoiodinin-Gencluster (orf2184-2190) von P. mosselii DSM17497 und sein nativer Promotor wurden als XbaI/BamHI-Fragment in pBSPPc kloniert, was zu pBS-DSM17497-Pseu führte (Ergänzungsdaten 1). Dieser Klon wurde in die P. mosselii 923 ∆psdB-, ∆psdC- und ∆psdG-Mutanten eingeführt, um zu bestimmen, ob das DSM17497-psd-Operon die 923-Mutantenstämme ergänzen könnte. Zwei Stämme jeder Mutante (PsdB-comp.1 und PsdB-comp.2; PsdC-comp.1 und PsdC-comp.2 und PsdG-comp.1 und PsdG-comp.2) wurden durch Einführung des Plasmids pBS- DSM17497-Pseu in die entsprechenden Mutanten durch Elektroporation (Supplementary Data 1). Komplementierte Mutanten wurden wie oben beschrieben auf Bakteriostase und Pseudoiodininproduktion untersucht.

DSM17497 enthält sieben Gene, die zum Pseudoiodinin-Operon in P. mosselii 923 homolog sind, nämlich orf2184 (psdA), orf2185 (psdB), orf2186 (psdC), orf2187 (psdD), orf2188 (psdE), orf2189 (psdF) und orf2190 (psdG). . RT-PCR wurde verwendet, um zu bestimmen, ob die sieben mutmaßlichen Pseudoiodinin-Gene in P. mosselii DSM17497 exprimiert wurden. Die Gesamt-RNA von P. mosselii DSM17497 wurde mit dem EasyPure RNA Kit (Transgen Biotech) extrahiert und cDNA wurde mit dem cDNA Synthesis Super Mix Kit (Transgen Biotech) hergestellt. Zur Normalisierung wurde das 16S-rRNA-Gen verwendet. Die für die RT-PCR verwendeten Primer sind in den Zusatzdaten 2 aufgeführt und das Experiment wurde dreimal unabhängig voneinander wiederholt.

Der gacA-ORF wurde durch PCR mit den Primern gacA-F und gacA-R (Supplementary Data 2) amplifiziert und als NdeI/XhoI-Fragment in pET28a kloniert. Das resultierende Konstrukt, pET28-gacA, wurde in E. coli BL21 (DE3) transformiert. Zur Überexpression wurde eine Einzelkolonie E. coli BL21-Kolonie in 20 ml LB mit Km inokuliert und über Nacht bei 37 °C kultiviert. Zellen (5 ml) wurden dann in 500 ml LB überführt und bei 37 °C, 220 U/min bis zu einer OD600 = 0,6–0,8 gezüchtet; Die Zellen wurden dann mit 0,5 mM IPTG induziert und über Nacht bei 16 °C kultiviert. Die Pellets wurden durch 10-minütige Zentrifugation bei 4 °C und 3.500 × g geerntet, zweimal in PBS gewaschen und in Puffer A (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, pH 7,5) mit einer Endkonzentration von 1 mM PMSF suspendiert ( Phenylmethansulfonylfluorid). Die Zellen wurden durch Ultraschallbehandlung aufgeschlossen und zellfreie Extrakte wurden durch 30-minütige Zentrifugation bei 4 ° C und 13.800 × g erhalten. Die Überstände wurden auf His Sep Ni-NTA-Agaroseharz (Yeasen Biotechnology) aufgetragen, das vor der Verwendung mit Puffer A äquilibriert wurde. Die Ni-NTA-Säule wurde dreimal mit Puffer A gewaschen und die Säule mit einem Gradienten von 20–250 mM Imidazol in Puffer A eluiert. Fraktionen von 20 bis 250 mM wurden gepoolt und durch SDS-PAGE getrennt. Die GacA enthaltende Fraktion wurde konzentriert und mit Lagerpuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 % Glycerin, pH 7,5) ausgetauscht. Die Proteinkonzentration wurde mit einem Nano-300-Mikrospektrophotometer (Hangzhou Allsheng Instruments Co.) geschätzt und das Präparat bis zur Verwendung bei –80 ° C gelagert.

Cy5-markierte Promotorsonden, die das UAS-Motiv (TGTAAG-N6-CTTACA) in rsmY und rsmZ enthalten, wurden kommerziell synthetisiert (Shanghai DNA Bioscience Co. Ltd). EMSA wurde unter Verwendung etablierter Protokolle68 durchgeführt. Kurz gesagt, das gereinigte His-GacA wurde mit Cy5-markierten rsmY- bzw. rsmZ-Promotorfragmenten gemischt und dann zur Elektrophorese auf ein 4,5 % nicht denaturierendes Polyacrylamidgel geladen. Der Cy5-Fluorophor wurde mit einem Amersham Typhoon RGB Biomolecular Imager (Cytiva, Schweden) nachgewiesen. EMSA-Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander wiederholt.

Die MHKs von Pseudoiodinin und PCA für Xanthomonas spp. wurden durch Reihenverdünnung bestimmt. Es wurde NA hergestellt, das Pseudoiodinin in einer Menge von 0–64 μg/ml oder PCA in einer Menge von 0–256 μg/ml enthielt. Zwei Mikroliter Bakteriensuspension (OD600 = 1,0) wurden dreifach verdünnt und auf NA-Platten getupft. Nach einer 48-stündigen Inkubation bei 28 °C wurden MHKs als die niedrigste Konzentration definiert, bei der kein Wachstum sichtbar war.

Die EC50-Werte von Pseudoiodinin und PCA wurden entsprechend der Wachstumshemmung bestimmt. Kurz gesagt, 10 μl Bakteriensuspension wurden zu 5 ml NB gegeben, das verdünnte Konzentrationen von Pseudoiodinin und PCA enthielt. Die OD600-Werte der getesteten Suspensionen wurden gemessen, als die Kontrollsuspensionen auf OD600 = 1,0 anstiegen. Der Logarithmus der prozentualen Hemmung basierend auf den OD600-Werten wurde auf den Logarithmus der Verbindungskonzentrationen zurückgeführt und die EC50-Werte wurden berechnet. Dieses Experiment wurde dreimal oder mehrmals unabhängig voneinander durchgeführt.

Der EC50-Wert von M. oryzae R01-1 wurde in vitro bestimmt, indem Myzelpfropfen (0,5 cm2 Durchmesser) aus einer aktiv wachsenden Pilzkolonie auf eine Reihe von OAM-Platten übertragen wurden, die Pseudoiodinin bei 10, 15, 20, 25, 30, 35 enthielten. 40, 45 und 50 μM. Die Durchmesser der Pilzkolonien wurden nach einer fünftägigen Inkubation bei 25 °C im Dunkeln gemessen und die Hemmung als Prozentsatz des Kontrollwachstums berechnet. Die EC50-Werte wurden auf der Grundlage einer linearen Regression des Koloniedurchmessers anhand logarithmisch transformierter Pseudoiodininkonzentrationen berechnet. Die Experimente wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt.

Die statistische Signifikanz wurde mithilfe der LSD-Testmethode (Least Significant Difference) und der einfaktoriellen ANOVA-Analyse für mehrere Vergleiche unter Verwendung von SPSS v. 22.0 berechnet. Der statistische Testwert wird in den Legenden der Abbildungen wie folgt als statistisch signifikant dargestellt: *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001, einfache ANOVA, gefolgt von einem LSD-Test. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Statistische Daten wurden mit GraphPad Prism Version 8.00 analysiert. Die Läsionsflächen wurden aus infizierten Blättern mit Adobe Photoshop CS5 berechnet. Alle Experimente wurden mindestens dreimal unabhängig voneinander wiederholt, um die Reproduzierbarkeit zu bestätigen.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind in diesem Manuskript und seiner Zusatzinformationsdatei verfügbar. Die in dieser Studie verwendeten Genomsequenzdaten von Pseudomonas mosselii 923 wurden in der NCBI GenBank-Datenbank unter dem BioProject-Zugangscode PRJNA826312 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NZ_CP095556) hinterlegt. Die Transkriptomdaten wurden im NCBI Sequence Read Archive hinterlegt und sind mit dem Code PRJNA880759 zugänglich. Die in diesem Artikel beschriebenen kristallographischen Daten zur Struktur von Pseudoiodinin wurden beim Cambridge Crystallographic Data Centre unter der Hinterlegungsnummer CCDC 2175188 hinterlegt. Kopien der Daten können kostenlos über www.ccdc.cam.ac.uk bezogen werden. Die in dieser Studie verwendeten Stämme, Plasmide und Primer sind in den Ergänzungsdaten 1–2 aufgeführt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt. Daten sind auf Anfrage auch beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Pérez-Montaño, F. et al. Förderung des Pflanzenwachstums bei landwirtschaftlich wichtigen Getreide- und Hülsenfruchtpflanzen: von der Fähigkeit von Mikroorganismen bis zur Pflanzenproduktion. Mikrobiol. Res. 169, 325–336 (2014).

Artikel PubMed Google Scholar

NIÑO-LIU, DO, Ronald, PC & Bogdanove, AJ Xanthomonas oryzae pathovars: Modellpathogene einer Modellpflanze. Mol. Pflanzenpathol. 7, 303–324 (2006).

Artikel PubMed Google Scholar

Talbot, NJ Auf den Spuren eines Getreidekillers: Erkundung der Biologie von Magnaporthe grisea. Annu. Rev. Microbiol. 57, 177–202 (2003).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shanti, M. et al. Markergestützte Züchtung zur Resistenz gegen bakteriellen Krautfäule bei beliebten Sorten und Elternlinien von Hybridreis. J. Plant Pathol. 92, 495–501 (2010).

Yang, R. et al. Bakterizide Wirkung von Pseudomonas oryziphila sp. nov., eine neuartige Pseudomonas-Art gegen Xanthomonas oryzae reduziert die Krankheitsschwere des bakteriellen Blattstreifens von Reis. Vorderseite. Mikrobiol. 12, 3234 (2021).

Xu, S. et al. Auswirkungen von Phenazin-1-carbonsäure auf die Biologie des pflanzenpathogenen Bakteriums Xanthomonas oryzae pv. oryzae. Pestisch. Biochem. Physiol. 117, 39–46 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Yamaguchi, I. Rice Blast: Interaction with Rice and Control 1–13 (Springer, 2004).

Kumar, S. Biopestizide: ein Bedarf an Lebensmittel- und Umweltsicherheit. J. Biofertil. Biopestic. 3, 1–3 (2012).

Artikel CAS Google Scholar

Weller, DM Pseudomonas-Biokontrollmittel für bodenbürtige Krankheitserreger: Rückblick auf über 30 Jahre. Phytopathology 97, 250–256 (2007).

Artikel PubMed Google Scholar

Harvey, A. Strategien zur Entdeckung von Arzneimitteln aus bisher unerforschten Naturstoffen. Arzneimittelentdeckung. Heute 5, 294–300 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

MLot, C. Antibiotika in der Natur: jenseits der biologischen Kriegsführung. Science 324, 1637–1639 (2009).

Artikel ADS CAS PubMed Google Scholar

Gross, H. & Loper, JE Genomik der Sekundärmetabolitenproduktion durch Pseudomonas spp. Nat. Prod. Rep. 26, 1408–1446 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

De Souza, JT Verteilung, Diversität und Aktivität von Antibiotika produzierenden Pseudomonas spp. (Universität und Forschung Wageningen, 2002).

Vakulskas, CA, Potts, AH, Babitzke, P., Ahmer, BM & Romeo, T. Regulierung der bakteriellen Virulenz durch Csr (Rsm)-Systeme. Mikrobiol. Mol. Biol. Rev. 79, 193–224 (2015).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hover, BM et al. Kulturunabhängige Entdeckung der Malacidine als kalziumabhängige Antibiotika mit Wirkung gegen multiresistente grampositive Krankheitserreger. Nat. Mikrobiol. 3, 415–422 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hawkins, N. & Fraaije, B. Fitnesseinbußen bei der Entwicklung der Fungizidresistenz. Annu. Rev. Phytopathol. 56, 339–360 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Fisher, MC, Hawkins, NJ, Sanglard, D. & Gurr, SJ Das weltweite Auftreten von Resistenzen gegen Antimykotika stellt eine Herausforderung für die menschliche Gesundheit und die Ernährungssicherheit dar. Wissenschaft 360, 739–742 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lam, YC & Crawford, JM Entdeckung von Antibiotika aus dem globalen Mikrobiom. Nat. Mikrobiol. 3, 392–393 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Kelly, TR, Elliott, EL, Lebedev, R. & Pagalday, J. Synthese der Pyrazolo-[4, 3-e][1, 2, 4]-Triazin-Familie von Naturstoffen: Nostocin A, Fluviol A und Pseudoiodinin. Marmelade. Chem. Soc. 128, 5646–5647 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Smirnov, VV, Kiprianova, EA, Garagulya, AD, Esipov, SE & Dovjenko, SA Fluviols, bizyklische stickstoffreiche Antibiotika, produziert von Pseudomonas fluorescens. FEMS Mikrobiol. Lette. 153, 357–361 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hirata, K. et al. Neuartiges violettes Pigment, Nostocin A, ein extrazellulärer Metabolit des Cyanobakteriums Nostoc spongiaeforme. Heterocyclen 7, 1513–1519 (1996).

Google Scholar

Lindner, H. J. & Schaden, G. Pyrazolo [4.3‐e] as‐triazin, ein neues heterocyclisches System aus Pseudomonas fluorescens var. pseudoiodinum. Chem. Ber. 105, 1949–1955 (1972).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Bernat, Z. et al. Chirale Pyrazolo[4, 3-e][1, 2, 4]triazinsulfonamide – ihre biologische Aktivität, Lipophilie, Proteinaffinität und metabolische Transformationen. Appl. Wissenschaft. 11, 2660 (2021).

Artikel CAS Google Scholar

Mojzych, M. Bewertung der antiviralen Aktivität von Pyrazolo[4, 3-e][1, 2, 4] Triazinen. J. Chem. Soc. Pak. 33, 698 (2011).

CAS Google Scholar

Dembitsky, VM, Gloriozova, TA & Poroikov, VV Pharmakologische und vorhergesagte Aktivitäten natürlicher Azoverbindungen. Nat. Prod. Bioprospekt. 7, 151–169 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mendes, R., Garbeva, P. & Raaijmakers, JM Das Rhizosphären-Mikrobiom: Bedeutung pflanzennützlicher, pflanzenpathogener und humanpathogener Mikroorganismen. FEMS Mikrobiol. Rev. 37, 634–663 (2013).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Imai, Y. et al. Ein neues Antibiotikum tötet selektiv gramnegative Krankheitserreger ab. Natur 576, 459–464 (2019).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pan, X. et al. Screening und Charakterisierung von Xanthomonas oryzae pv. Oryzae-Stämme mit Resistenz gegen Pheazin-1-carbonsäure. Pestisch. Biochem. Physiol. 145, 8–14 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Pan, X., Wu, J., oryzae und X. oryzae pv. Oryzicola. Phytopathology 107, 163–172 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Blin, K. et al. antiSMASH 5.0: Aktualisierungen der Sekundärmetaboliten-Genom-Mining-Pipeline. Nukleinsäuren Res. 47, W81–W87 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heeb, S. & Haas, D. Regulatorische Rollen des GacS/GacA-Zweikomponentensystems in pflanzenassoziierten und anderen gramnegativen Bakterien. Mol. Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. 14, 1351–1363 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, D. et al. Rollen des Gac-Rsm-Signalwegs bei der Regulierung der Phenazin-Biosynthese in Pseudomonas chlororaphis 30-84. MicrobiologyOpen 2, 505–524 (2013).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Suzuki, F., Sawada, H., Azegami, K. & Tsuchiya, K. Molekulare Charakterisierung des Tox-Operons, das an der Toxoflavin-Biosynthese von Burkholderia glumae beteiligt ist. J. Gen. Plant Pathol. 70, 97–107 (2004).

Artikel CAS Google Scholar

Su, C. et al. Charakterisierung der N-Methyltransferasen, die an der Biosynthese von Toxoflavin, Fervenulin und Reumycin aus Streptomyces hiroshimensis ATCC53615 beteiligt sind. Org. Biomol. Chem. 17, 477–481 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Blumer, C., Heeb, S., Pessi, G. & Haas, D. Die globale GacA-gesteuerte Kontrolle der Cyanid- und Exoproteaseproduktion in Pseudomonas fluorescens umfasst spezifische Ribosomenbindungsstellen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 96, 14073–14078 (1999).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cui, Y., Chatterjee, A., Liu, Y., Dumenyo, CK & Chatterjee, AK Identifizierung eines globalen Repressorgens, rsmA, von Erwinia carotovora subsp. carotovora, das extrazelluläre Enzyme kontrolliert, N-(3-Oxohexanoyl)-L-homoserinlacton und Pathogenität bei weich verrottenden Erwinia spp. J. Bakteriol. 177, 5108–5115 (1995).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Romeo, T., Gong, M., Liu, MY & Brun-Zinkernagel, A.-M. Identifizierung und molekulare Charakterisierung von csrA, einem pleiotropen Gen aus Escherichia coli, das die Glykogenbiosynthese, Gluconeogenese, Zellgröße und Oberflächeneigenschaften beeinflusst. J. Bakteriol. 175, 4744–4755 (1993).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kusmierek, M. & Dersch, P. Regulierung von Wirt-Pathogen-Interaktionen über das posttranskriptionelle Csr/Rsm-System. Curr. Meinung. Mikrobiol. 41, 58–67 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Reimmann, C., Valverde, C., Kay, E. & Haas, D. Posttranskriptionelle Repression von GacS/GacA-kontrollierten Genen durch das RNA-bindende Protein RsmE, das zusammen mit RsmA im Biokontrollstamm Pseudomonas fluorescens CHA0 wirkt. J. Bakteriol. 187, 276–285 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zou, L. et al. Ein verbessertes, vielseitiges und effizientes modulares Plasmid-Assemblierungssystem für Expressionsanalysen von Genen in Xanthomonas oryzae. Mol. Pflanzenpathol. 22, 480–492 (2021).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Thomashow, LS & Weller, DM Aktuelle Konzepte bei der Verwendung eingeführter Bakterien zur biologischen Krankheitsbekämpfung: Mechanismen und antimykotische Metaboliten. Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. 1, 187–235 (1996).

Artikel Google Scholar

Chin-A-Woeng, TF, Bloemberg, GV & Lugtenberg, BJ Phenazine und ihre Rolle bei der Biokontrolle durch Pseudomonas-Bakterien. N. Phytologist 157, 503–523 (2003).

Artikel Google Scholar

Khmel, I. et al. Biologische Bekämpfung der Wurzelhalsgalle bei Weinreben und Himbeeren durch zwei Pseudomonas-Arten. mit einem breiten Spektrum antagonistischer Aktivität. Biokontrollwissenschaft. Technol. 8, 45–57 (1998).

Artikel Google Scholar

Dandurishvili, N. et al. Breitbandantagonistische Rhizobakterien Pseudomonas fluorescens und Serratia plymuthica unterdrücken Agrobacterium-Kronengallentumoren auf Tomatenpflanzen. J. Appl. Mikrobiol. 110, 341–352 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wu, L. et al. Identifizierung von Pseudomonas mosselii BS011-Genclustern, die zur Unterdrückung des Reisbrandpilzes Magnaporthe oryzae erforderlich sind. J. Biotechnologie. 282, 1–9 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhuo, T., Chen, S., Fan, X., Hu, Vorabdruck unter https://doi.org/10.1101/510628. (2019).

Wei, JZ et al. Ein selektives insektizides Protein aus Pseudomonas mosselii zur Bekämpfung des Maiswurzelbohrers. Pflanzenbiotechnologie. J. 16, 649–659 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Laville, J. et al. Globale Kontrolle bei Pseudomonas fluorescens, die die Antibiotikasynthese und die Unterdrückung der Schwarzwurzelfäule von Tabak vermittelt. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. USA 89, 1562–1566 (1992).

Artikel ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chin-A-Woeng, TFC et al. Die Wurzelbesiedlung durch das Phenazin-1-carboxamid-produzierende Bakterium Pseudomonas chlororaphis PCL1391 ist für die biologische Bekämpfung von Tomatenfuß- und Wurzelfäule unerlässlich. Mol. Interaktion zwischen Pflanzen und Mikroben. 13, 1340–1345 (2000).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Parkins, MD, Ceri, H. & Storey, DG Pseudomonas aeruginosa GacA, ein Faktor bei der Multiwirt-Virulenz, ist auch für die Biofilmbildung essentiell. Mol. Mikrobiol. 40, 1215–1226 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Sepúlveda-Cisternas, I. & Lozano Aguirre, L. Fuentes Flores, A., Vásquez Solis de Ovando, I. & García-Angulo, VA Transkriptomik zeigt einen kreuzmodulatorischen Effekt zwischen Riboflavin und Eisen und skizziert Reaktionen auf die Biosynthese und Aufnahme von Riboflavin bei Vibrio cholerae. Wissenschaft. Rep. 8, 1–14 (2018).

Artikel Google Scholar

Pessi, G. et al. Der globale posttranskriptionelle Regulator RsmA moduliert die Produktion von Virulenzdeterminanten und N-Acylhomoserinlactonen in Pseudomonas aeruginosa. J. Bakteriol. 183, 6676–6683 (2001).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Reimmann, C. et al. Der globale Aktivator GacA von Pseudomonas aeruginosa PAO steuert positiv die Produktion des Autoinduktors N‐Butyrylhomoserinlacton und die Bildung der Virulenzfaktoren Pyocyanin, Cyanid und Lipase. Mol. Mikrobiol. 24, 309–319 (1997).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Berdy, J. Bioaktive mikrobielle Metaboliten. J. Antibiotika 58, 1–26 (2005).

Artikel CAS Google Scholar

Olano, C., Lombo, F., Mendez, C. & Salas, JA Verbesserung der Produktion bioaktiver Sekundärmetaboliten in Actinomyceten durch Metabolic Engineering. Metab. Ing. 10, 281–292 (2008).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Adrio, JL & Demain, AL Genetische Verbesserung von Prozessen zur Herstellung mikrobieller Produkte. FEMS Mikrobiol. Rev. 30, 187–214 (2006).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Jin, K. et al. Entwicklung der zentralen Biosynthese- und sekundären Stoffwechselwege des Pseudomonas aeruginosa-Stamms PA1201 zur Verbesserung der Phenazin-1-Carbonsäure-Produktion. Metab. Ing. 32, 30–38 (2015).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xu, Y. Genomische Merkmale und Regulierung der Phenazinbiosynthese im Rhizosphärenstamm Pseudomonas aeruginosa M18. Mikrob. Phenazine 3, 177–198 (2013).

Artikel Google Scholar

Cai, L. et al. Ein Transkriptionsaktivator-ähnlicher Effektor Tal7 von Xanthomonas oryzae pv. Oryzicola aktiviert das Reis-Gen Os09g29100, um die Reisimmunität zu unterdrücken. Wissenschaft. Rep. 7, 1–13 (2017).

Artikel Google Scholar

Miller, JH Experimente in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, 1972).

da Costa, R. et al. Genetische Kontrolle der Resistenz von Sorghum gegen Blattanthracnose. Pflanzenpathol. 60, 1162–1168 (2011).

Artikel Google Scholar

Li, H., Balan, P. & Vertes, A. Molekulare Bildgebung von Wachstum, Stoffwechsel und Antibiotikahemmung in Bakterienkolonien durch Laserablations-Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie. Angew. Chem. 128, 15259–15263 (2016).

Artikel ADS Google Scholar

Kumar, S., Stecher, G. & Tamura, K. MEGA7: Molekulare evolutionäre Genetikanalyse Version 7.0 für größere Datensätze. Mol. Biol. Entwicklung 33, 1870–1874 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Richter, M., Rosselló-Móra, R., Oliver Glöckner, F. & Peplies, J. JSpeciesWS: ein Webserver für die Umschreibung prokaryotischer Arten basierend auf paarweisem Genomvergleich. Bioinformatik 32, 929–931 (2016).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Li, Y. et al. Der Xanthomonas oryzae pv. Das Oryzae-Typ-IV-Pilus-Alignment-Subkomplexprotein PilN trägt zur Regulierung des bakteriellen Oberflächenverhaltens und des T3SS-Systems bei. Pflanzenpathol. 69, 744–755 (2020).

Artikel CAS Google Scholar

Li, X. et al. Das äußere Membranprotein OprF und der Sigmafaktor SigX regulieren die Antibiotikaproduktion in Pseudomonas fluorescens 2P24. Mikrobiol. Res. 206, 159–167 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Livak, KJ & Schmittgen, TD Analyse relativer Genexpressionsdaten mittels quantitativer Echtzeit-PCR und der 2− ΔΔCT-Methode. Methoden 25, 402–408 (2001).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Xu, Z. et al. Ein variiertes AvrXa23-ähnliches TALE ermöglicht es dem Erreger der Bakterienfäule, nicht durch das Xa23-Resistenzgen in Reis gefangen zu werden. J. Adv. Res. https://doi.org/10.1016/j.jare.2022.01.007 (2022).

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Wir danken Prof. Carol Bender (Oklahoma State University), Prof. Feng Ge (Institut für Zoologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften) und Prof. Xuewen Gao (Nanjing Agricultural University) für ihre kritische Sicht auf dieses Projekt. Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse des National Key Research and Development Program of China (2022YFD1400200, 2017YFD0200400), der National Natural Science Foundation of China (31830072) und des Shanghai Agriculture Applied Technology Development Program of China (2020‐02‐08‐00) unterstützt ‐08‐F01462).

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Ruihuan Yang, Qing Shi.

Shanghai Collaborative Innovation Centre of Agri-Seeds/School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, China

Ruihuan Yang, Yichao Yan, Shengzhang Li, Yuan Fang, Ying Li, Linlin Liu, Longyu Liu, Yongzheng Peng, Jiangbo Fan, Lifang Zou und Gongyou Chen

Staatliches Schlüssellabor für mikrobiellen Stoffwechsel, School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, 200240, China

Qing Shi, Tingting Huang, Xiaozheng Wang, Lifang Zou, Shuangjun Lin und Gongyou Chen

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GC und LZ überwachten die Studie. RY, YY, Sie. L., YF, YL, Li. L., Lo. L. und YP sammelten Bodenproben. RY und sie. L. isolierte Bakterienstämme. RY und LZ führten Gen-Knockout-, Komplementär- und biochemische Assay-Experimente durch. RY und QS identifizierten Verbindungen. RY und JF führen Biokontrolltests durch. QS, TH und XW führten Biosyntheseexperimente durch. RY und QS analysierten die Daten und verfassten das Manuskript. TH, Shu. L. und GC überarbeiteten das Manuskript.

Korrespondenz mit Lifang Zou oder Gongyou Chen.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Yang, R., Shi, Q., Huang, T. et al. Das natürliche Pyrazolotriazin-Pseudojodinin aus Pseudomonas mosselii 923 hemmt pflanzliche Bakterien- und Pilzpathogene. Nat Commun 14, 734 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-36433-z

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Eingegangen: 12. Juni 2022

Angenommen: 01. Februar 2023

Veröffentlicht: 09. Februar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-36433-z

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