Eine Pore

Communications Biology Band 5, Artikelnummer: 730 (2022) Diesen Artikel zitieren

1210 Zugriffe

4 Zitate

10 Altmetrisch

Details zu den Metriken

Die Aufrechterhaltung des Wasserhaushalts ist für Amphibien in terrestrischen Umgebungen eine echte Herausforderung. Unsere früheren Studien mit der Kröte Bombina maxima entdeckten einen porenbildenden Protein- und Kleeblattfaktorkomplex βγ-CAT, der unter strenger Regulierung in Abhängigkeit von Umwelteinflüssen zusammengesetzt wird. Hier berichten wir über eine unerwartete Rolle von βγ-CAT bei der Wasserhaltung von Kröten. Die Löschung der Hautsekrete von Kröten, in denen βγ-CAT ein Hauptbestandteil ist, erhöhte die Tiersterblichkeit unter hypertonem Stress. βγ-CAT wurde in den osmoregulatorischen Organen der Kröte konstitutiv exprimiert, was unter Variation der osmotischen Bedingungen induzierbar war. Das Protein induzierte in vivo und in vitro die Makropinozytose und beteiligte sich daran. Während der extrazellulären Hyperosmose stimulierte βγ-CAT die Makropinozytose, um den Wasserimport und die Freisetzung von Exosomen zu erleichtern, was gleichzeitig die Aquaporinverteilung regulierte. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass neben membranintegriertem Aquaporin ein sekretorisches porenbildendes Protein die Wassererhaltung von Kröten durch Makropinozytose-Induktion und Exozytose-Modulation erleichtern kann, insbesondere als Reaktion auf osmotischen Stress.

Die Aufrechterhaltung des Wasserhaushalts ist eine zentrale Herausforderung für Amphibien beim Übergang vom Wasser zum Land1,2. Bei diesen Tieren führt die koordinierte Funktion des Nerven-, Hormon- und Lymphsystems sowie der am Wasser-Salz-Gleichgewicht und der Osmoregulation beteiligten Organe (einschließlich Haut, Blase und Nieren) zu einer verbesserten Wasserspeicherung und -nutzung sowie einer verringerten Verdunstung1,3. Amphibien können Wasser über ihre Haut aufnehmen1,2. Darüber hinaus wird Wasser aus der tubulären Flüssigkeit in der Niere und aus gespeichertem Urin in der Harnblase (UB)2,3 resorbiert. Wasserkanalproteine, Aquaporine (AQPs), spielen eine Schlüsselrolle bei der transepithelialen Wasserabsorption/-rückreabsorption in diesen Organen und bei der Regulierung des Zellvolumens4,5. Die physiologische Funktion von Proteinkomponenten aus Amphibienhautsekreten bei der Regulierung der integumentalen Wasserhomöostase wurde jedoch nur selten untersucht.

Makropinozytose ist ein Mechanismus, der die Massenaufnahme und Internalisierung von extrazellulärer Flüssigkeit und den darin enthaltenen gelösten Stoffen vermittelt und endozytische Vesikel mit Durchmessern von 0,2–5 μm erzeugt6,7. Makropinozytose ist ein Aktin-abhängiger Endozytoseweg, der durch die Aktivierung der Signalwege Ras und Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) vermittelt wird und entweder durch endogene Wirkstoffe wie Wachstumsfaktoren oder durch invasive Mikroben induziert wird6,8. Es wurde dokumentiert, dass dieser grundlegende zelluläre Prozess in einer Reihe normaler und bösartiger Zellen verschiedene pathophysiologische Rollen spielt, darunter Nährstoffaufnahme, Zellwachstum, Verkehr und Erneuerung von Membrankomponenten, Eindringen von Krankheitserregern, Immunüberwachung und Zellmotilität6,9, 10. Allerdings sind die physiologischen Rollen der Makropinozytose, einer sehr alten Form der Endozytose, noch immer unvollständig verstanden11,12.

Porenbildende Proteine ​​(PFPs) sind normalerweise sekretorische Proteine, die in einer wasserlöslichen Monomerform vorliegen und unter Bildung von Transmembranporen (Kanälen) oligomerisieren13,14. Aerolysine sind bakterielle β-Barrel-PFPs, die von Aeromonas-Arten produziert werden13,14. Interessanterweise wurden zahlreiche PFPs der Aerolysin-Familie (abgekürzt af-PFPs, früher als Aerolysin-Like Proteins, ALPs bezeichnet), die eine mit anderen Domänen fusionierte Aerolysin-Membraninsertionsdomäne beherbergen, bei verschiedenen Tieren und Pflanzen identifiziert15,16. Unsere früheren Studien mit den Hautsekreten der Kröte Bombina maxima entdeckten ein Interaktionsnetzwerk zwischen af-PFPs und Kleeblattfaktoren (TFFs)17. BmALP1, ein af-PFP aus der Kröte, kann reversibel zwischen der aktiven und inaktiven Form reguliert werden, wobei sein Paralog BmALP3 abhängig von der Sauerstoffspannung in der Umgebung ein negativer Regulator ist18. Insbesondere interagiert BmALP1 mit BmTFF3 und bildet einen membranaktiven PFP-Komplex namens βγ-CAT19,20, in dem BmTFF3 als extrazelluläres Chaperon fungiert, das das BmALP1-Monomer stabilisiert und dieses PFP an seine richtigen Membranziele liefert18,21.

Dieser sekretorische PFP-Komplex βγ-CAT zielt in einem Doppelrezeptor-Bindungsmodell auf Ganglioside und Sulfatide in Zellmembranen21. Dann wird die BmALP1-Untereinheit endozytiert und dieses PFP oligomerisiert, um Kanäle auf Endolysosomen zu bilden, wodurch der Inhalt und die biochemischen Eigenschaften dieser intrazellulären Organellen moduliert werden21,22,23,24,25. Somit ist βγ-CAT ein sekretorisches Endolysosomenkanalprotein (SELC). Wir haben die Hypothese aufgestellt, dass dieser PFP-Komplex tatsächlich einen bisher unbekannten SELC-Weg darstellt, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er den Import und Export von Zellmaterial über endolysosomale Wege vermittelt17. Abhängig vom Zellkontext und der Umgebung wurde vorgeschlagen, dass βγ-CAT die Wahrnehmung und Aufnahme von Umweltmaterialien (wie Nährstoffen und Antigenen) durch die Kröte fördert und den Export importierter Frachtmoleküle in ihrer intakten Form und/oder verarbeiteten Produkten erleichtert Stimulierung der Freisetzung extrazellulärer Vesikel17. Somit könnten die zellulären Wirkungen des SELC-Proteins βγ-CAT den Materialaustausch zwischen Zellen und Umgebungen vermitteln und gleichzeitig die Barrierefunktion der Schleimhaut aufrechterhalten und die Immunabwehr erfüllen17. Dementsprechend wurde die Rolle von βγ-CAT bei der Immunabwehr erstmals dokumentiert22,23,24,25,26.

Amphibienhaut ist ein wichtiges Organ, das für die Wasseraufnahme und -erhaltung verantwortlich ist1,3, und βγ-CAT ist ein Hauptbestandteil der Hautsekrete von B. maxima18. In der vorliegenden Studie haben wir herausgefunden, dass die Expression und Lokalisierung von βγ-CAT in B. maxima der Kröte mit osmotischen Umweltbedingungen zusammenhängt und dass dieses Protein in der Lage ist, der zellulären Dehydrierung unter extrazellulärer Hyperosmose entgegenzuwirken. βγ-CAT stimulierte die Zellmakropinozytose und die Exosomenfreisetzung und beteiligte sich daran, förderte die Wasser- und Na+-Aufnahme und regulierte die AQP-Lokalisierung. Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass ein sekretorisches PFP die Wasseraufnahme und -erhaltung vorantreiben kann.

Amphibienhaut hat während der evolutionären Anpassung an Landumgebungen eine doppelte Rolle bei der Osmoregulation gespielt27. Dementsprechend verloren Kröten (B. maxima) schnell an Gewicht, wenn sie hypertoner Ringer-Lösung ausgesetzt wurden, was sich allmählich erholte, als das Tier dann in isotonische Ringer-Lösung gegeben wurde (Abb. 1a). Dies deutet darauf hin, dass die Kröte unter osmotischem Stress Wasser durch ihre Haut transportiert. Hautsekrete spielen eine zentrale Rolle bei den physiologischen Funktionen der Amphibienhaut2. Darüber hinaus ist βγ-CAT ein wichtiger Proteinbestandteil der Hautsekrete der Kröte B. maxima18. Es wurde geschätzt, dass zwei Untereinheiten von βγ-CAT zusammen etwa 50 % der Proteine ​​in B. maxima-Hautsekreten ausmachen (ergänzende Abbildung 1a). Wir vermuteten, dass die Hautsekrete der Kröte, insbesondere βγ-CAT, eine aktive Rolle im Wasserhaushalt spielen könnten. Osmotische Stressexperimente wurden durchgeführt, um die möglichen Funktionen von βγ-CAT-haltigen Hautsekreten bei der Aufrechterhaltung des Wasserhaushalts der Kröte zu testen. Kröten B. maxima verloren 20 % ihres Körpergewichts und 50 % der Tiere starben, als sie 24 Stunden lang in die hypertone Ringer-Lösung gelegt wurden (Abb. 1b und ergänzende Abb. 1b). Die Hautsekrete der Kröten wurden durch Elektrostimulation 30 Minuten vor dem Einlegen der Kröten in verschiedene osmotische Lösungen aufgebraucht. Obwohl nach der Elektrostimulation in der isotonischen Ringer-Lösung keine Todesfälle durch Kröten verzeichnet wurden, kam es in der hypertonen Ringer-Lösung zu Todesfällen (Abb. 1b). Daher scheint es, dass Hautsekrete für die Kröte von entscheidender Bedeutung sind, um mit hypertonen Umgebungen zurechtzukommen. Um die mögliche Beteiligung von βγ-CAT am Wasserhaushalt der Kröte weiter zu untersuchen, wurde qPCR verwendet, um die Expression von zwei βγ-CAT-Untereinheiten in der Haut, UB und Niere von B. maxima der Kröte während der Dehydrierung und Gewichtserholung (Wasseraufnahme danach) nachzuweisen Dehydrierung). Es wurde festgestellt, dass die Expression der βγ-CAT-α-Untereinheit in Haut und Niere während der Gewichtserholung durch Wasseraufnahme nach Dehydrierung hochreguliert war (Abb. 1c und ergänzende Abb. 1c). Im Gegensatz dazu war die Expression der mRNA der βγ-CAT-β-Untereinheit in der Krötenhaut während der Dehydrierung oder Wasseraufnahme hochreguliert (Abb. 1d), jedoch nicht in der Niere (ergänzende Abb. 1d). Interessanterweise stiegen in der UB die mRNA-Spiegel beider Untereinheiten, wenn Kröten hypertoner Ringer-Lösung ausgesetzt wurden, und kehrten auf den normalen Wert zurück, wenn Kröten anschließend in isotonische Ringer-Lösung gegeben wurden (Abb. 1e, f). Daher ist die βγ-CAT-Expression mit Veränderungen der externen osmotischen Bedingungen verbunden.

a Gewichtsveränderungen der Kröten wurden gemessen, nachdem sie in isotonische, hypertonische und hypertonische/isotonische Ringer-Lösungen gegeben wurden. Das Anfangsgewicht der Kröten beträgt 19 ± 5 g (n = 5). b Die Überlebensraten von Kröten in isotonischer (i) und hypertoner (h) Ringer-Lösung wurden nach 48 Stunden bestimmt. Kröten wurden nach 30 Minuten mit (+) oder ohne (-) Elektrostimulation in jede der Lösungen gegeben, um Krötenhautsekrete zu entfernen (n = 6). c–f Die Expression von βγ-CAT-Untereinheiten in Krötenhaut und UB wurde durch quantitative Echtzeit-Fluoreszenz-PCR analysiert (n = 6). Die Kröten wurden 3 Stunden lang in isotonische oder hypertonische Ringer-Lösung gelegt, bevor die Proben gesammelt wurden. In der hypertonischen/isotonischen Gruppe wurden die Kröten zunächst 3 Stunden lang in die hypertonische Lösung gelegt und dann weitere 3 Stunden lang in die isotonische Lösung überführt, bevor die Proben gesammelt wurden. g, h Nach dem Einlegen von Kröten in isotonische, hypertonische oder hypertonische/isotonische Ringer-Lösung, wie oben beschrieben, wurden die Lokalisierung und Expression von βγ-CAT in den Geweben der Krötenhaut (g) und UB (h) durch Immunhistofluoreszenz (IHF) analysiert. Ep-Epidermis, De-Dermis, Mg-Schleimdrüse, Gg-Körnerdrüse, Lu-Lumen, Te-Übergangsepithel. Maßstabsbalken, 200 μm. *P < 0,05 und **P < 0,01 nach dem Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test in der Überlebensratenanalyse. ns (P ≥ 0,05); *P < 0,05, **P < 0,01 und ***P < 0,001 durch ungepaarten t-Test in anderen Experimenten. Alle Daten stellen den Mittelwert ± SD dar und sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. Siehe auch ergänzende Abbildung 1.

Darüber hinaus analysierten wir die Expression und Lokalisierung des βγ-CAT-Proteins unter den gleichen Behandlungsbedingungen mittels Immunhistofluoreszenz (IHF). βγ-CAT war hauptsächlich in der Epidermis und den Drüsen der Haut konzentriert und wurde bei osmotischem Stress in der Epidermis und der Basalmembran hochreguliert (Abb. 1g). βγ-CAT war vorwiegend im Übergangsepithel der UB lokalisiert. Die Expression des βγ-CAT-Proteins in Kröten-UB wurde in hypertonischer Ringer-Lösung hochreguliert und herunterreguliert, als die Kröte dann in isotonische Ringer-Lösung gegeben wurde (Abb. 1h). Insgesamt zeigten diese Ergebnisse eine Beteiligung von βγ-CAT an den Reaktionen der Kröte auf osmotischen Stress.

βγ-CAT ist ein lebenswichtiges funktionelles Protein von B. maxima der Kröte, und seine konstitutive Expression kann in verschiedenen Krötengeweben nachgewiesen werden22,23, einschließlich Hautsekreten und Epithelzellen aus der Haut und UB sowie Nieren- und Peritonealzellen. Die endogene Sekretion von βγ-CAT in diesen von Kröten abgeleiteten Zellen wurde weiter durch einen Hämolysetest analysiert, eine empfindliche Methode zum Nachweis des Vorhandenseins von biologisch aktivem βγ-CAT18,19. Alle Medien dieser kultivierten Krötenzellen zeigten eine starke hämolytische Aktivität, die durch Anti-βγ-CAT-Antikörper vollständig gehemmt wurde, was das Vorhandensein von sekretiertem βγ-CAT bestätigte (ergänzende Abbildung 2a). Darüber hinaus haben wir die Zytotoxizität von βγ-CAT gegenüber B. maxima-Zellen gemessen. Zuvor wurde berichtet, dass βγ-CAT bei Dosierungen von bis zu 400 nM22 keine Zytotoxizität gegenüber Peritonealzellen der Kröte zeigte. Die vorliegende Studie stellte außerdem fest, dass eine Zytotoxizität von βγ-CAT gegenüber Haut- und UB-Epithelzellen sowie Nierenzellen von B. maxima nur auftrat, wenn seine Konzentration 2 μM erreichte (ergänzende Abbildung 2b), ein Wert, der viel höher ist als die physiologischen Konzentrationen (20–100). nM, bestimmt im Peritoneum der Kröte)22. Im Gegensatz dazu reagieren Säugetierzellen viel empfindlicher auf βγ-CAT. Obwohl βγ-CAT bei 10 nM keine Zytotoxizität gegenüber MDCK-, Caco-2- und T24-Zellen zeigte, verursachte das Protein Zelltod, wenn die verwendeten Dosierungen höher als 50–100 nM waren (ergänzende Abbildung 2c). Daher wurden in allen nachfolgenden Experimenten, die die Zugabe von gereinigtem βγ-CAT zu Zellen betrafen, folgende Proteindosierungen verwendet: Epithelzellen aus Krötenhaut, 100 nM; UB-Epithelzellen, 50 nM; Peritonealzellen, 50 nM; Säugetier-MDCK, 10 nM; Caco-2, 10 nM; und T24, 5 nM.

Um die mögliche Rolle von βγ-CAT beim Wassertransport weiter zu untersuchen, untersuchten wir, ob das Protein in der Lage ist, der Zelldehydrierung unter extrazellulärer Hyperosmose entgegenzuwirken. Wir haben die Wirkung von βγ-CAT auf Kröten-UB-Epithelzellen, Säugetier-MDCK-, Caco-2- und T24-Zellen bestätigt, wie durch die Bildung von βγ-CAT-Oligomeren nach Behandlung mit dem Protein bestimmt (Abb. 2a und ergänzende Abb. 2d). βγ-CAT-Oligomere wurden in Kröten-UB-Epithelzellen ohne Zusatz des Proteins nachgewiesen, möglicherweise verursacht durch endogen sezerniertes βγ-CAT (Abb. 2a). Die Zugabe von gereinigtem βγ-CAT erhöhte die Konzentration an Oligomeren des Proteins in den UB-Epithelzellen weiter (Abb. 2a). Anschließend analysierten wir die elektrophysiologischen Eigenschaften von βγ-CAT-Oligomeren auf Outside-Out-Patches von HEK293-Zellen. Durch βγ-CAT induzierte makroskopische Ströme wurden aufgezeichnet und normalisiert, was die Eigenschaft einer Gleichrichtung nach innen aufweist (Abb. 2b). Diese bewiesen, dass βγ-CAT Transmembranporen (Kanäle) bilden und den Ionenfluss nach der Oligomerisierung auf der Membran vermitteln kann. Wir haben die Ionenselektivität von βγ-CAT-Kanälen durch Ionenaustauschexperimente weiter untersucht. Asymmetrische 150:15 mM NaCl-Lösungen verschoben das Umkehrpotential nach links von 0 mV auf −61,2 mV, was sehr nahe am theoretischen Gleichgewichtspotential von Na+ liegt, was darauf hindeutet, dass die βγ-CAT-Kanäle für Na+, aber nicht für Cl− durchlässig sind ( Abb. 2c). Diese Ergebnisse zeigten, dass die βγ-CAT-Kanäle den Na+-Fluss ermöglichten.

a Krötenharnblasenzellen und MDCK-Zellen wurden 15 Minuten lang mit oder ohne βγ-CAT behandelt. Das Auftreten von βγ-CAT-Oligomeren in den behandelten Zellen wurde durch Western Blot bestimmt. b Normalisierte Strom-Spannungs-Kurven von Kanälen, die durch 100 nM βγ-CAT auf HEK293-Zellen gebildet wurden. Ströme wurden durch ein 500-ms-Rampenprotokoll zwischen –100 mV und +100 mV alle 2 Sekunden bei einem Haltepotential von 0 mV (n = 3) erzeugt. c Normalisierte Strom-Spannungs-Kurven von βγ-CAT-Kanälen in angegebenen Lösungen (Pipette/Bad) (n = 3). Na+(150:15 mM) entspricht 150 mM Na+ in der Pipette und 15 mM Na+ im Bad. d Durchmesseränderungen von MDCK-, Caco-2- und T24-Zellen in isotonischem (295 mOsm) oder hypertonischem (400 mOsm) PBS in Gegenwart oder Abwesenheit von βγ-CAT, bestimmt mit einem Zellzähler. Verdaute Zellen wurden zunächst 15 Minuten lang in PBS suspendiert, bevor sie in diesem Experiment verwendet wurden. e, f Durchmesseränderungen von Kröten-UB-Epithelzellen in isotonischer (schwarz) und hypertoner (grün) Ringer-Lösung in Gegenwart von 50 μg mL−1 Kaninchen-Antikörper (blau) oder Anti-βγ-CAT-Antikörper (magenta). In (f) wurden die Zellen zunächst 10 Minuten lang mit 0,3 mM HgCl2 behandelt, bevor der Zelldurchmesser mit einem Zellzähler gemessen wurde. In allen in Abb. 2 gezeigten Experimenten betrugen die verwendeten βγ-CAT-Dosierungen 10 nM für MDCK und Caco-2, 5 nM für T24 und 50 nM für Kröten-UB-Epithelzellen. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD von dreifachen Proben in b–e dar. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD von drei unabhängigen Replikaten in f dar. ns (P ≥ 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 durch den ungepaarten t-Test. Alle Daten sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. Siehe auch ergänzende Abbildung 2.

Auf dieser Grundlage untersuchten wir die mögliche Rolle von βγ-CAT, wenn Zellen durch extrazelluläre Hyperosmose unter Verwendung hypertoner Lösung herausgefordert wurden. Wir beobachteten, dass βγ-CAT die Volumenwiederherstellung von MDCK-, Caco-2- und T24-Zellen in hypertonischer Lösung förderte (Abb. 2d), was die Fähigkeit des Proteins offenbarte, die Wasseraufnahme unter hyperosmotischen Bedingungen zu erleichtern. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen verringerte die Immundepletion von endogenem βγ-CAT die Zelldurchmesser von Kröten-UB-Epithelzellen in hypertoner Ringer-Lösung im Vergleich zu denen ohne Anti-βγ-CAT-Antikörper weiter (Abb. 2e). Es ist gut dokumentiert, dass AQPs den schnellen zellulären Wasserfluss vermitteln können28. Daher muss geklärt werden, ob die Wiederherstellung des Zellvolumens durch Wasseraufnahme, vermittelt durch βγ-CAT unter osmotischem Stress, mit der AQP-Funktion zusammenhängt. Da die quecksilberempfindlichen Stellen von B. maxima-AQPs (BmAQPs) im UB evolutionär konserviert waren (ergänzende Abbildung 2e, f), wurde HgCl2 verwendet, um die Funktion von BmAQPs zu hemmen. Das Zellvolumen blieb in der hypertonen Ringer-Lösung nach der Blockierung von BmAQPs mit HgCl2 unverändert. Umgekehrt war die Zellvolumenwiederherstellung von Kröten-UB-Epithelzellen durch Wasseraufnahme nach der Immundepletion von endogenem βγ-CAT deutlich verringert (Abb. 2f). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse die Fähigkeit von βγ-CAT, die Wiederherstellung des Zellvolumens durch Stimulierung der Wasseraufnahme während der extrazellulären Hyperosmose zu fördern, und zeigten, dass die Wirkung unabhängig vom Wasserfluss über Plasmamembran-AQPs war.

βγ-CAT ist an der Regulierung des Zellvolumens beteiligt, was auf eine Beteiligung am Wassertransport schließen lässt. Als nächstes analysierten wir den möglichen zellulären Mechanismus hinter diesem Phänomen. Die Wasseraufnahme kann durch AQPs und/oder Makropinozytose schnell erfolgen12,28,29. Zuvor verstärkte βγ-CAT die Pinozytose in einem Mausmodell mit dendritischen Zellen (DC)24. In der vorliegenden Studie haben wir sorgfältig die Fähigkeit von βγ-CAT untersucht, die Makropinozytose in verschiedenen Arten von B. maxima-Zellen zu stimulieren und daran teilzunehmen. Zunächst ergab die Immunelektronenmikroskopie (IEM), dass βγ-CAT in zellulären Pseudopodien und Makropinosomen mit Durchmessern von bis zu 300 nm lokalisiert war, die durch Makropinozytose in Krötenhaut und UB-Geweben gebildet wurden (Abb. 3a). βγ-CAT war auch in den Interzellularräumen von Epithelzellen vorhanden (Abb. 3a). 70-kDa-Dextran ist ein Marker für Makropinozytose, während Lucifer Yellow (LY) als Marker für Endozytose in der flüssigen Phase einschließlich Makropinozytose verwendet werden kann30,31. In aus Krötenhaut und UB gewonnenen Epithelzellen sowie in Nieren- oder Peritonealzellen von Kröten verringerte die Immundepletion von endogenem βγ-CAT durch Anti-βγ-CAT-Antikörper die Internalisierung von LY und FITC-Dextran im Vergleich zu Zellen, die in Gegenwart der Kontrolle beobachtet wurden, erheblich Kaninchen-IgG (Abb. 3b, c und ergänzende Abb. 3a, b). Überraschenderweise kann exogen zugesetztes Kontroll-Kaninchen-IgG eine Pinozytose induzieren. Das weitverbreitete Vorhandensein von IgG-Rezeptoren (z. B. FcRn) in Zellen könnte einen Teil der Wirkung beitragen32. Tatsächlich war das FcRn-ähnliche Gen von B. maxima auch in Krötenzellen vorhanden (ergänzende Abbildung 3c). Aus unbekannten Gründen trägt Kaninchen-IgG als exogenes Protein zur Pinozytose von Krötenzellen bei. Wir fanden heraus, dass Kontroll-Kaninchen-IgG und von Kaninchen stammende Anti-βγ-CAT-Antikörper gleichermaßen wirksam bei der Induktion von Makropinozytose in MDCK-Zellen waren (ergänzende Abbildung 3d). Daher zeigten diese, dass von Kaninchen stammende Anti-βγ-CAT-Antikörper die βγ-CAT-induzierte Makropinozytose durch Immundepletion von endogenem βγ-CAT reduzieren können. Darüber hinaus verstärkte die Zugabe von βγ-CAT zu Zellen aus Krötenhaut und UB sowie zu MDCK- und T24-Zellen von Säugetieren die Internalisierung von LY und FITC-Dextran (Abb. 3d, e und ergänzende Abb. 3e, f). Wir fanden heraus, dass βγ-CAT endozytiert wurde und sich in den Makropinosomen von MDCK-Zellen befand (ergänzende Abbildung 3g). Darüber hinaus betrugen die gesamten Na+-Konzentrationen in Kröten-UB-Epithelzellen und MDCK-Zellen, die mit βγ-CAT behandelt wurden, das 3,5- bzw. 1,1-fache der Werte der Vehikelgruppe (Abb. 3f).

a Ultrastrukturelle Lokalisierung von βγ-CAT in Krötenhaut und UB-Geweben, analysiert durch IEM. Vehikel (Kaninchen-IgG-Kontrolle). Durch Makropinozytose gebildete endozytische Vesikel (schwarze Sternchen) und Verteilung von βγ-CAT auf Vesikel (rote Pfeile) und Interzellularräume (rote Dreiecke). b, c Die Immundepletion von endogenem βγ-CAT verringerte die Makropinozytose. Krötenhaut- (b) und UB-Epithelzellen (c) wurden 30 Minuten lang mit 50 μg mL-1 Anti-βγ-CAT-Antikörper zur Immundepletion von endogenem βγ-CAT inkubiert. Die mittlere Fluoreszenzintensität wurde durch Durchflusszytometrie mit 100 μg mL−1 70 kDa FITC-markiertem Dextran und Lucifer Yellow (LY) für 30 Minuten bestimmt. Kaninchen-IgG (Antikörperkontrolle). Vehikel (Antikörper ohne Kontrolle). d, e Die Zugabe von gereinigtem βγ-CAT verstärkte die Makropinozytose. Die mittlere Fluoreszenzintensität von LY- und FITC-markiertem Dextran in Epithelzellen der Krötenhaut (d) und UB (e) wurde durch Durchflusszytometrie mit oder ohne zusätzliche 100 nM bzw. 50 nM βγ-CAT bestimmt. f-fache Veränderungen von [Na+] in Kröten-UB-Epithelzellen (n = 6) und MDCK-Zellen (n = 8) mit und ohne Zugabe von 50 nM bzw. 10 nM βγ-CAT für 3 Stunden. g, h Die Wirkung von Inhibitoren auf die durch βγ-CAT induzierte Makropinozytose. Kröten-UB-Epithelzellen (g) und MDCK-Zellen (h) wurden 1 Stunde lang mit und ohne 100 μM EIPA oder 20 μM WORT inkubiert. Anschließend wurden die Zellen mit 100 μg mL-1 FITC-markiertem Dextran mit 50 nM (Kröten-UB-Zellen) oder 10 nM (MDCK-Zellen) βγ-CAT 30 Minuten lang kultiviert. i Rac123 und Phosphorylierung von Akt und PI3K als Reaktion auf 10 nM βγ-CAT in MDCK-Zellen für 15, 30 oder 60 Minuten, wie durch Western Blot bestimmt, und die Banden wurden mit ImageJ semiquantifiziert. Die schwarz gepunktete Linie bezieht sich auf die Blindkontrolle und die Daten stellen den Mittelwert ± SD von dreifachen Proben in be, g, h dar. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen Replikaten in f und i dar. ns (P ≥ 0,05), *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 und ****P < 0,0001 durch den ungepaarten t-Test. Alle Daten sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. Siehe auch ergänzende Abbildung 3.

Als nächstes wurde der molekulare Mechanismus der durch βγ-CAT induzierten Makropinozytose mithilfe pharmakologischer Wirkstoffe untersucht. 5-(N-Ethyl-N-isopropyl)amilorid (EIPA, ein Na+/H+-Austauscher-Inhibitor) und Wortmannin (WORT, ein PI3K-Inhibitor) werden üblicherweise zur Hemmung der Makropinozytose eingesetzt33,34. Wir fanden heraus, dass EIPA und WORT die durch βγ-CAT induzierte Makropinozytose in Kröten-UB-Epithelzellen und Säugetier-MDCK-Zellen reduzierten (Abb. 3g, h). Darüber hinaus stimulierte βγ-CAT die Phosphorylierung von Akt und PI3K und die Expression von Rac123 in MDCK-Zellen (Abb. 3i). Zusammengenommen zeigten diese Ergebnisse, dass βγ-CAT, ein endogen sezernierter Komplex aus PFP und TFF, die Makropinozytose in verschiedenen Zellen von B. maxima sowie in verschiedenen Säugetierzellen stimuliert und daran beteiligt ist.

AQPs und Ionenfluss sind am Wassertransport und der Volumenregulierung von Kröten-UB-Zellen unter Stimulation durch mehrere Hormone beteiligt35,36,37. Die Internalisierung durch Makropinozytose ist unselektiv, wohingegen Übergangsepithelzellen polar sind. Daher haben wir den Zusammenhang zwischen βγ-CAT-stimulierter Makropinozytose und BmAQP2 untersucht. Wir beobachteten, dass sich die Position von βγ-CAT und BmAQP2 in Kröten-UB-Epithelzellen zwischen isotonischen, hypertonischen und „hypertonischen/isotonischen“ (hypertonischen, gefolgt von einer Rückkehr zu isotonischen) Ringer-Lösungen unterschied (Abb. 4a). Wenn Kröten isotonischer Ringer-Lösung ausgesetzt wurden, befanden sich βγ-CAT und BmAQP2 zusammen und waren sowohl auf der apikalen als auch auf der basalen Seite des Übergangsepithels im UB der Kröte verteilt. In hypertoner Ringer-Lösung verlagerten βγ-CAT und BmAQP2 ihre Position auf die basalen oder lateralen Seiten des UB-Übergangsepithels. Im Gegensatz dazu begannen βγ-CAT und BmAQP2, zur apikalen Seite des Übergangsepithels zu wandern, als die Kröten von hypertoner Ringer-Lösung wieder in isotonische Ringer-Lösung überführt wurden. Diese Beobachtung legt nahe, dass durch βγ-CAT induzierte Makropinozytose an der Internalisierung und dem Transport von BmAQP2 im UB beteiligt ist. Bei MDCK wurde auch eine intrazelluläre Kolokalisierung von βγ-CAT und AQP2 beobachtet (Abb. 4b). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die durch βγ-CAT stimulierte Makropinozytose eine Rolle bei der Regulierung von AQPs unter verschiedenen osmotischen Bedingungen spielt, was einen weiteren Aspekt dieses Proteins bei der Modulation des Wasserhaushalts der Kröte offenbart.

a Kolokalisierung von βγ-CAT und BmAQP2 im UB-Gewebe der Kröte B. maxima, nachdem die Kröten 3 Stunden lang in isotonische, hypertonische oder hypertonische/isotonische Ringerlösung gegeben wurden, wie durch Immunhistofluoreszenz analysiert. Maßstabsbalken, 25 μm. b Intrazelluläre Kolokalisierung von βγ-CAT und AQP2 in MDCK-Zellen mit oder ohne Behandlung mit 10 nM βγ-CAT für 15 Minuten, bestimmt durch Immunfluoreszenz. Maßstabsbalken, 30 μm. Alle Daten sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente.

Die Sekretion von Exosomen ist ein wichtiger Aspekt der Zellexozytose, der als Mittel zum selektiven Materialtransport zwischen Zellen und als Modus der interzellulären Kommunikation angesehen werden kann38. Da βγ-CAT die Makropinozytose fördert, haben wir das zelluläre Schicksal und die Rolle von βγ-CAT-haltigen Vesikeln weiter untersucht. βγ-CAT wurde sowohl in multivesikulären Körpern (MVBs) als auch in intraluminalen Vesikeln (ILVs) von UB-Epithelzellen nachgewiesen (Abb. 5a). In Anbetracht der Tatsache, dass 98% der UB-Epithelzellen der Kröte 3 Stunden in vitro bei Raumtemperatur überlebten (ergänzende Abbildung 4a), wurden von diesen Zellen abgesonderte Exosomen gesammelt und beobachtet (Abb. 5b), die typische Exosomenmarker CD63, TSG101 und Flotillin enthielten -1, und die Anzahl der Exosomen wurde erhöht, wenn diese Zellen mit gereinigtem βγ-CAT behandelt wurden (Abb. 5c). Die Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) ergab, dass die Immundepletion von endogenem βγ-CAT die Exosomenfreisetzung aus Kröten-UB-Epithelzellen und Peritonealzellen abschwächte (Abb. 5d und ergänzende Abb. 4b), während die Zugabe von βγ-CAT die Exosomenfreisetzung aus diesen Zellen erheblich steigerte (Abb. 5e und ergänzende Abb. 4c). Keine dieser Behandlungen veränderte den durchschnittlichen Exosomendurchmesser. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in MDCK- und T24-Zellen von Säugetieren erzielt (ergänzende Abbildungen 4d, e). Insgesamt zeigten diese Ergebnisse, dass βγ-CAT die Produktion und Freisetzung von Exosomen sowohl in Kröten- als auch in Säugetierzellen fördert.

a Ultrastrukturelle Lokalisierung von βγ-CAT im UB-Gewebe der Kröte mittels IEM. βγ-CAT (Pfeil) konnte problemlos in MVBs (Sternchen) oder ILVs nachgewiesen werden. Vehikel (Kaninchen-IgG-Kontrolle). b TEM-Analyse von Exosomen aus dem Überstand von Kröten-UB-Epithelzellen, die 3 Stunden lang in vitro kultiviert wurden. c Western-Blot-Analyse von Flotillin-1-, TSG101- und CD63-Molekülen in Exosomen, die aus dem Überstand von Kröten-UB-Epithelzellen isoliert wurden, die 3 Stunden lang in vitro mit oder ohne Zugabe von 50 nM βγ-CAT kultiviert wurden. d, e Analyse der Konzentration und Partikelgröße (30–200 nm) von Exosomen aus Kröten-UB-Epithelzellen mit und ohne 50 μg mL−1 Anti-βγ-CAT-Antikörper (d) oder der Zugabe von 50 nM βγ-CAT ( e) von NTA. f, g Der Prozentsatz (f) und die mittlere Fluoreszenzintensität (g) von Dextran enthaltenden Exosomen aus Kröten-UB-Epithelzellen in einem Kulturmedium, das 1 mg mL-1 FITC-markiertes Dextran enthält, mittels Nanoflow-Zytometrie mit oder ohne Zusatz von 50 nM βγ-CAT. h Western-Blot-Analyse von βγ-CAT und BmAQP2 in Exosomen von Kröten-UB-Epithelzellen, die 3 Stunden lang in vitro mit oder ohne Zugabe von 50 nM βγ-CAT kultiviert wurden. i IEM-Bestimmung von βγ-CAT und BmAQP2 in Exosomen (Sternchen) aus Kröten-UB-Epithelzellen. BmAQP2 und βγ-CAT wurden mit 10 nm (Pfeil) bzw. 5 nm (Dreieck) großen kolloidalen Goldpartikeln markiert. j, k Veränderungen der gesamten (j) und mittleren (k) Na+-Konzentrationen in Exosomen aus der gleichen Anzahl von MDCK-Zellen mit oder ohne 10 nM βγ-CAT für 3 Stunden. lfache Veränderungen der gesamten Na+-Konzentrationen in Exosomen aus der gleichen Anzahl von MDCK-Zellen unter dem hypertonischen Medium mit oder ohne 10 nM βγ-CAT für 3 Stunden. Die Balken stellen den Mittelwert ± SD von dreifachen Proben in d–g dar. Die Daten stellen den Mittelwert ± SD von mindestens drei unabhängigen Replikaten in j–l dar. ns (P ≥ 0,05), *P < 0,05 und ****P < 0,0001 durch den ungepaarten t-Test. Alle Daten sind repräsentativ für mindestens zwei unabhängige Experimente. Siehe auch ergänzende Abbildung 4.

Wir untersuchten weiter die Eigenschaften von Exosomen, die durch βγ-CAT stimuliert wurden. Die Größenverteilung von Exosomen, die aus Kröten-UB-Epithelzellen stammen, wurde mittels Durchflusszytometrie für die Nanopartikelanalyse bestimmt. Die Durchmesser dieser Exosomen lagen hauptsächlich im Bereich von 50–150 nm (ergänzende Abbildung 4f). Wenn 1 mg ml FITC-Dextran mit isolierten Exosomen inkubiert wurde, enthielten die Exosomen kein FITC-Dextran (ergänzende Abbildung 4g). Im Gegensatz dazu wurde FITC-Dextran in von den Zellen sezernierten Exosomen identifiziert, als Dextran unter den gleichen Bedingungen zur Kultur von Kröten-UB-Epithelzellen hinzugefügt wurde (ergänzende Abbildung 4g). Diese Beobachtung zeigte, dass isolierte Exosomen kein 70-kDa-Dextran aufnahmen, sondern dass Dextran durch Makropinozytose von Kröten-UB-Epithelzellen aufgenommen und in Form von Exosomen aus den Zellen freigesetzt wurde. Interessanterweise blieb der Anteil der FITC-Dextran enthaltenden Exosomen in Kröten-UB-Epithelzellen mit oder ohne Zusatz von gereinigtem βγ-CAT unverändert (Abb. 5f), und es gab keinen Unterschied in der mittleren Fluoreszenzintensität dieser Exosomen (Abb. 5g). ). Diese Ergebnisse legen nahe, dass βγ-CAT die Exozytose fördert und den transzellulären Transport extrazellulärer Substanzen wie Dextran erleichtert, indem es die Exosomenfreisetzung erhöht. Allerdings scheinen sich die scheinbaren Eigenschaften der freigesetzten Exosomen gemäß den Untersuchungen zum gegenwärtigen Zeitpunkt nicht verändert zu haben.

Sowohl BmAQP2- als auch βγ-CAT-Oligomere wurden durch Western Blot in Exosomen nachgewiesen, die aus Kröten-UB-Epithelzellen freigesetzt wurden, was das Vorhandensein von endogenem βγ-CAT widerspiegelt. Die Zugabe von βγ-CAT zu Zellen erhöhte die Menge der nachgewiesenen BmAQP2- und βγ-CAT-Oligomere erheblich (Abb. 5h). IEM zeigte die Kolokalisierung von BmAQP2 und βγ-CAT in einzelnen Exosomen (Abb. 5i). Diese Beobachtungen legen nahe, dass βγ-CAT das extrazelluläre Recycling und/oder die interzelluläre Kommunikation von AQPs über die Freisetzung von Exosomen steuert.

Darüber hinaus analysierten wir die Wirkung von βγ-CAT auf die Na+-Spiegel in Exosomen von MDCK-Zellen. Es wurde kein Unterschied bei den gesamten Na+-Konzentrationen in Exosomen beobachtet, die von der gleichen Anzahl von Zellen produziert wurden, die mit oder ohne 10 nM βγ-CAT behandelt wurden (Abb. 5j). Allerdings erhöhte βγ-CAT die Exosomenfreisetzung von MDCK um das 6,8-fache (ergänzende Abbildung 4d), sodass die mittleren Na + -Konzentrationen der Exosomen verringert wurden (Abb. 5k). Darüber hinaus wurde in hypertonen Medien unter den gleichen Bedingungen ein durch βγ-CAT induzierter Anstieg der gesamten Na+-Konzentrationen in Exosomen festgestellt (Abb. 5l).

Amphibien leben sowohl an Land als auch im Wasser. Ihre Haut ist nackt und fungiert als wichtiges Organ für den Wasserhaushalt, die Atmung (Gasaustausch) und die Immunabwehr1,3. Obwohl der PFP-Komplex βγ-CAT ursprünglich in B. maxima-Hautsekreten identifiziert wurde, wird er in großem Umfang in den Wasserhaushaltsorganen von B. maxima exprimiert, einschließlich Haut, UB und Niere (Abb. 1c – h und ergänzende Abb. 1c, 1d). Frühere Studien zeigten die Expression von βγ-CAT in verschiedenen B. maxima-Geweben22,23. Interessanterweise zeigt βγ-CAT im Gegensatz zu seiner starken Zytotoxizität gegenüber verschiedenen Säugetierzellen 19, 39 nur toxische Wirkungen in Krötenzellen in einer Dosierung von bis zu 2 μM (ergänzende Abbildung 2b), was viel höher ist als die beobachteten physiologischen Konzentrationen von βγ-CAT 22 . Seine Toxizität für Säugetierzellen könnte auf das Fehlen regulatorischer Mechanismen für dieses exogene PFP-Protein zurückzuführen sein, die normalerweise in der Kröte vorhanden sind18,21. Diese Beobachtungen stützen die Annahme, dass der PFP-Komplex βγ-CAT nicht einfach als Auslöser des Zelltods und/oder als Mikrobizid angesehen werden kann und dass das Protein neben seiner Rolle bei der Immunabwehr22,23,24,25,26 auch andere wesentliche physiologische Funktionen aufweist Funktionen in dieser Kröte.

Die Haut von B. maxima ist mit Hautsekreten bedeckt, die verschiedene biologische Moleküle enthalten, die eine Reihe physiologischer Funktionen erfüllen, darunter hormonähnliche Peptide, antimikrobielle Peptide, af-PFPs, TFFs und Häm-b-haltiges Albumin16,40,41. Tatsächlich zeigten unsere Ergebnisse, dass die Hautsekrete notwendig sind, um eine Dehydrierung zu verhindern (Abb. 1b). Wir haben außerdem gezeigt, dass eine Hauptkomponente der Hautsekretion, βγ-CAT, eine Rolle bei der Wasserhomöostase von Kröten in osmoregulatorischen Organen spielt. Obwohl die meisten Amphibien nicht in hypertonen Umgebungen leben und ihre Haut selten durch extremen Wasserverlust beeinträchtigt wird, sind Niere und UB unter physiologischen Bedingungen wie Urinbildung und -konzentration einer Vielzahl hypertoner Belastungen ausgesetzt. Tatsächlich legt die unterschiedliche Expression von βγ-CAT in UB mit osmotischer Umgebung nahe, dass βγ-CAT an der dynamischen Änderung des UB-Wassertransports beteiligt ist (Abb. 1e, f und Abb. 4a). Daher haben wir weiter gezeigt, dass βγ-CAT eine Rolle bei der Wasserhomöostase von Kröten mit UB-Zellen von Kröten und Nierenzellen von Säugetieren spielt. Dieser PFP-Komplex besitzt die Fähigkeit, die Makropinozytose (Import) und die Exosomenfreisetzung (Export) durch Epithelzellen der osmoregulatorischen Organe der Kröte zu stimulieren und daran teilzunehmen, was den Wasser- und Na+-Transport fördert, der an der Wasserhomöostase beteiligt ist. Es sollte betont werden, dass es derzeit schwierig ist, die physiologischen Wirkungen von βγ-CAT auf Tierebene mittels Gen-Knockout weiter zu untersuchen, da es sich bei B. maxima um eine Nicht-Modellart handelt.

Frühere Studien mit Säugetierzellen und Peritonealzellen von Kröten zeigten, dass βγ-CAT seine biologischen Wirkungen durch Endozytose und die Bildung von Kanälen auf Endolysosomen ausübt17,21,22,23,24, aber der endozytische Weg des Proteins bleibt unklar. Makropinozytose, auch Zelltrinken genannt, ist eine Form der Endozytose, die die nicht-selektive Aufnahme von extrazellulärer Flüssigkeit und gelösten Stoffen vermittelt6,12. In einem murinen DC-Modell erhöht βγ-CAT die Internalisierung von Ovalbumin (Antigen), was vermutlich durch eine verstärkte Makropinozytose vermittelt wird24. Die vorliegende Studie, die an verschiedenen von Kröten abgeleiteten Zellen, einschließlich Epithelzellen aus osmoregulatorischen Organen und Peritonealzellen, durchgeführt wurde, zeigte deutlich, dass βγ-CAT in der Lage ist, Makropinozytose zu induzieren und daran teilzunehmen. Es wurde gezeigt, dass durch βγ-CAT stimulierte Makropinozytose den Eintritt von Wasser und Na+ in Zellen erleichtert, wie in Epithelzellen aus osmoregulatorischen Organen von Kröten untersucht wurde (Abb. 2f und Abb. 3f). Dies könnte die Rolle von βγ-CAT bei der Förderung der Wiederherstellung des Zellvolumens unter hypertonischem Stress erklären (Abb. 2d – f). Angesichts der Tatsache, dass IgG weit verbreitete IgG-Fc-Rezeptoren bindet, um Pinozytose zu induzieren32, wie z. B. das MHC-Klasse-I-ähnliche IgG-Rezeptorprotein FcRn, kann die gleichzeitige Anwesenheit von unspezifischem exogenem Kaninchen-IgG und aktivem βγ-CAT zu einem Anstieg der Makropinozytose führen (Abb. 3b, c und ergänzende Abb. 3a, b). Die durch Wachstumsfaktoren induzierte Makropinozytose wird durch die Aktivierung der Ras- und PI3-Kinase-Signalwege vermittelt11. In ähnlicher Weise war die Aktivierung der PI3-Kinase- und Akt-Signalübertragung an der durch βγ-CAT stimulierten Makropinozytose beteiligt, wie aus den Wirkungen pharmakologischer Inhibitoren und der Phosphorylierungsanalyse von PI3K und Akt hervorgeht (Abb. 3g – i). Im Gegensatz zu klassischen Wachstumsfaktoren, die sich an Membranproteinrezeptoren binden, um ihre Signalübertragung auszulösen, zielt βγ-CAT jedoch auf Ganglioside und Sulfatide als Rezeptoren in Lipidflößen ab, um seine zellulären Wirkungen auszulösen21. Die Signale stromabwärts dieser Lipidkomponenten und ihre Beziehung zur Induktion der Makropinozytose sind derzeit unklar. In diesem Zusammenhang sollten mögliche Unterschiede zwischen der durch Wachstumsfaktoren stimulierten und der durch βγ-CAT induzierten Makropinozytose untersucht werden.

Während die Makropinozytose große Flüssigkeitsmengen verschlingt, internalisiert sie auch Zelloberflächenproteine ​​wie Rezeptoren und Integrine42,43. Es wurde vorgeschlagen, dass die durch βγ-CAT stimulierte Endozytose eine Rolle bei der Sortierung spezifischer Plasmamembranelemente wie funktionsfähiger integrierter Proteine ​​oder Lipidkomponenten spielt, die die Zellreaktionen auf Umweltschwankungen regulieren17. Darüber hinaus spielen die Internalisierung und das Recycling von AQPs zwischen der Plasmamembran und dem endosomalen Kompartiment eine Rolle bei der Steuerung der Wasseraufnahme und -konservierung5,28. Dementsprechend wurde in endozytischen Organellen eine Kolokalisierung von βγ-CAT mit AQPs beobachtet (Abb. 4), was darauf hindeutet, dass die durch dieses PFP-Protein induzierte Makropinozytose die Endozytose und das Recycling von AQPs vorantreibt. Offensichtlich könnte das Vorhandensein von AQPs in der Plasmamembran den Wasserverlust erleichtern, wenn Zellen hypertonem osmotischem Stress ausgesetzt sind. Daher könnte die durch βγ-CAT induzierte Internalisierung von AQPs der Dehydrierung entgegenwirken, indem sie einen schnellen Wasserausfluss und eine Zellschrumpfung verhindert.

Die Sekretion extrazellulärer Vesikel, bestehend aus Exosomen und Mikrovesikeln, stellt eine neuartige Art der interzellulären Kommunikation und des Materialaustauschs dar38,44. Zuvor wurde festgestellt, dass βγ-CAT die Freisetzung von βγ-CAT-haltigen Exosomen aus murinen DCs steigert, was die T-Zell-Reaktion effektiv aktiviert24. Da βγ-CAT ein für Maus-DCs exogener Faktor ist, ist die Erklärung des Phänomens nicht offensichtlich. Das PFP ist jedoch ein endogenes Element der Krötenzellen. Die vorliegende Studie zeigte, dass die Zellexozytose in Form der Exosomenfreisetzung in Gegenwart von βγ-CAT tatsächlich verstärkt war, wie in verschiedenen von Kröten abgeleiteten Zellen festgestellt wurde (Abb. 5d, e und ergänzende Abb. 4b, c), was diese Vermittlung aufdeckt Die Zellexozytose über die Freisetzung von Exosomen ist eine intrinsische Eigenschaft dieses PFP-Proteins. Das von vielen Zellen exprimierte FcRn kann die Exozytose und das Recycling von IgG45 fördern. Der Exozytoseeffekt von βγ-CAT kann durch Exozytose und Zirkulation von IgG weiter verstärkt werden (Abb. 5d und ergänzende Abb. 4b). Frühere Studien haben gezeigt, dass βγ-CAT charakteristischerweise die Ansäuerung endozytischer Organellen, die dieses Protein enthalten, neutralisiert22,23,24. Dieser zelluläre Prozess kann zur Umwandlung von βγ-CAT-haltigen endozytischen Organellen in MVBs führen, die nicht mit Lysosomen zum Abbau der enthaltenen gelösten Stoffe fusionieren. Das Vorhandensein von extrazellulärem Dextran als βγ-CAT-induzierter Tracer der Endozytose in βγ-CAT-haltigen Exosomen stützt ebenfalls die obige Ansicht (Abb. 5f, g).

Die Beobachtung, dass βγ-CAT sowohl die Makropinozytose als auch die Freisetzung von Exosomen stimuliert und daran beteiligt ist, deutet stark darauf hin, dass dieses PFP am transzellulären Transport internalisierter extrazellulärer Substanzen durch PFP-gesteuerten zellulären Import und Export in vesikulärer Form über endolysosomale Wege beteiligt ist. Diese Eigenschaft ist in vivo besonders wichtig, wo βγ-CAT externe Substanzen wie Wasser und Na+ in die inneren Umgebungen von Krötengeweben transportieren kann, ohne die zellulären engen Verbindungen zu zerstören, die die Barrierefunktionen des Epithels aufrechterhalten. Interessanterweise wurden AQPs in Exosomen identifiziert, die in Gegenwart von βγ-CAT freigesetzt wurden (Abb. 5h, i), was darauf hindeutet, dass βγ-CAT die Wasserhomöostase moduliert, indem es das extrazelluläre Recycling und/oder die interzelluläre Kommunikation dieser Wasserkanäle fördert. Alternativ könnte die βγ-CAT-vermittelte Exozytose als Mittel zum Ausstoß schädlicher und unverdaulicher gelöster Stoffe dienen, die in Flüssigkeiten enthalten sind, die von Zellen zur Wasseraufnahme makropinozytiert werden, ähnlich dem Ausstoß von Dextran aus Kröten-UB-Epithelzellen (Abb. 5f, g). Die Rolle von βγ-CAT bei der Ausscheidung schädlicher Substanzen, die durch Makropinozytose durch Exozytose-Induktion verschlungen werden, und der beteiligte zelluläre Sortiermechanismus sind wichtige zukünftige Herausforderungen.

Unsere Studie schließt die mögliche Beteiligung anderer physiologischer Wassertransportmechanismen wie AQPs und Ionenkanäle nicht aus. Tatsächlich stützen unsere Ergebnisse die Möglichkeit, dass βγ-CAT eine wichtige Rolle bei B. maxima der Kröte spielt, indem es an der Regulierung klassischer Wassertransportmechanismen beteiligt ist, insbesondere angesichts von osmotischem Stress. Es ist allgemein bekannt, dass klassische membranintegrierte Proteine ​​wie AQPs und Ionenkanäle eine grundlegende Rolle beim Wassertransport und der Homöostase spielen28,46. Darüber hinaus vermittelt das Tight-Junction-Protein Claudin-2 die Permeabilität für transepitheliale Wasserbewegungen unter osmotischen oder Na+-Gradienten über den parazellulären Weg47,48. Die vorliegende Studie hat einen neuen Akteur, ein SELC-Protein βγ-CAT, in das Netzwerk des Wassertransports und der Homöostase eingeführt, indem der Import und Export von Zellmaterial über endolysosomale Wege moduliert wird. Ein zelluläres Arbeitsmodell des PFP βγ-CAT zur Förderung der Wasseraufnahme und -erhaltung wurde in der Kröte B. maxima vorgeschlagen (Abb. 6). In diesem Modell können Wasser und Na+ durch durch das PFP-βγ-CAT induzierte Makropinozytose importiert werden. Unterdessen kann der durch βγ-CAT gebildete Transmembrankanal den Na+-Fluss vermitteln (Abb. 2b, c). Frühere Studien haben gezeigt, dass der durch βγ-CAT gebildete Kanal einen Kationen-Ionenfluss verursachen kann39. Der PFP-Komplex zielt auf die Virushülle ab, um Poren zu bilden, die den Ausfluss von Kalium- und Kalziumionen induzieren26. Unerwarteterweise waren die durchschnittlichen Na+-Konzentrationen von βγ-CAT-haltigen Exosomen wesentlich niedriger als die der Kontrolle (Abb. 5j, k). Dieses Phänomen legt nahe, dass das Vorhandensein von durch βγ-CAT gebildeten Kanälen zu einem schnellen Ausfluss von Na+ aus Endolysosomen und/oder Exosomen führen kann. Somit kann Na+ über βγ-CAT-Kanäle in endozytischen Organellen in das Zytosol freigesetzt werden, was die Wasserfreisetzung in das Zytosol über AQPs vorantreibt (Abb. 4). Dies ähnelt der Situation von Zwei-Poren-Kanälen, die in Makrophagen von Säugetieren funktionieren42,43. Eine durch βγ-CAT vermittelte verstärkte Exosomenfreisetzung kann den Export von Ionen wie Na+ (Abb. 5l) und/oder Wasser in die Interzellularräume unterhalb der Tight Junctions fördern und so die Wasseraufnahme in tiefere Zellumgebungen begünstigen. In der Zwischenzeit könnten membranintegrierte Ionenkanäle und AQPs in der Basalplasmamembran von Epithelzellen den Ausfluss von Na+ und Wasser in das innere Gewebe unterhalb dieser Zellen vermitteln und so die Absorption/Reabsorption von Wasser in das innere Gewebe der Kröte erreichen5,49. Trinkwasser durch Makropinozytose ist energetisch teuer12. Die Funktion des sekretorischen PFP βγ-CAT bei der Wasseraufnahme und -erhaltung ist jedoch angesichts verschiedener osmotischer Bedingungen, denen die Kröte B. maxima während ihres gesamten Lebenszyklus ausgesetzt ist, notwendig.

βγ-CAT erreichte den intrazellulären Vesikeltransport und den transzellulären Transport von Wasser, Na+ und AQP2 durch Förderung der Makropinozytose (Import) und Exosomenfreisetzung (Export). Eine ausführliche Beschreibung finden Sie im Test. Die Darstellung der Epithelzellschicht und des inneren Gewebes wird vereinfacht. Alle Clipart-Komponenten stammen aus PowerPoint 2019 und Adobe Illustrator CC 2019.

Sekretorische PFPs wurden in Organismen aus allen Lebensbereichen identifiziert14,15,16 und af-PFPs sind in Pflanzen und Tieren weit verbreitet15,16,17. Basierend auf einer Fülle experimenteller Erkenntnisse zum af-PFP- und TFF-Komplex βγ-CAT aus der Kröte B. maxima18,19,20,21,22,23,24,25,26 haben wir die Hypothese des vermittelten SELC-Signalwegs vorgeschlagen durch ein PFP, das den Import und Export von Zellmaterial über endolysosomale Wege steuert17. Die vorliegende Studie liefert weitere funktionale Beweise, die unsere vorherige Hypothese stützen. Es wurde gezeigt, dass das SELC-Protein βγ-CAT, das auf der Grundlage von Umwelteinflüssen reguliert wird,17,18 die zelluläre Aufnahme und den Transport von Umweltmaterialien wie Antigenen, Wasser mit Ionen und Plasmamembrankomponenten fördert (siehe Referenz 24 und vorliegende Studie), basierend auf unterschiedlichen Zellkontexten und umgeben und stellt ein bisher unbekanntes zellvesikuläres Abgabesystem dar. Diese Fähigkeiten lassen vermuten, dass βγ-CAT und/oder seine Homologen neben der Antigenpräsentation und der Wassererhaltung auch eine aktive und grundlegende Rolle bei der Nährstoffaufnahme und der Flexibilität des Zellstoffwechsels spielen könnten, wie bereits vorgeschlagen17, was interessante Themen für weitere Untersuchungen darstellt. Diese PFPs und klassischen membranintegrierten Proteine ​​(wie Mitglieder der Familie der gelösten Träger) können zwei koordinierte Zellarme bei der Erfassung, Probenahme und Erfassung extrazellulärer Nährstoffe bilden. Offensichtlich sollten diese als SELCs fungierenden PFPs für Zellen in den Fällen essentiell sein, in denen klassische Membranträger für gelöste Stoffe blockiert sind oder sogar fehlen. Unsere Ergebnisse werden als Anhaltspunkte für die Aufdeckung neuartiger zellulärer Strategien und der physiologischen Rolle von PFPs beim Materialimport und -export über endolysosomale Systeme zwischen Zellen und Umgebungen in lebenden Organismen, insbesondere bei Säugetieren, dienen.

Zusammenfassend hat die aktuelle Arbeit eine unerwartete Rolle eines sekretorischen PFP beim Wassertransport und der Homöostase aufgeklärt. βγ-CAT, ein af-PFP- und ein TFF-Komplex, induzierte Makropinozytose und Exosomenfreisetzung in Epithelzellen aus osmoregulatorischen Organen von B. maxima und war daran beteiligt. Diese Effekte könnten die Rolle des PFP-Komplexes bei der Förderung der Internalisierung, des Transports und der Freisetzung von Wasser, Na+ und AQPs erklären und bei der Aufrechterhaltung der Regulierung des Zellvolumens der Kröten und der Wasserhomöostase zusammenarbeiten (Abb. 6). Zusammen mit membranintegrierten AQPs und Ionenkanälen kann die Wirkung von sekretorischem βγ-CAT die Gesamterreichung der Wassererhaltung und des Wassergleichgewichts fördern, insbesondere wenn die Kröte hypertonischem osmotischem Stress ausgesetzt ist.

Kröten (B. maxima) wurden in freier Wildbahn gefangen und bei Raumtemperatur durch Fütterung mit lebendem Tenebrio molitor aufgezogen. In Experimenten wurden Kröten mit einem Durchschnittsgewicht von 19 ± 5 g nach dreitägigem Fasten in isotonischer Ringerlösung verwendet. Alle Verfahren sowie die Pflege und Handhabung der Tiere wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee des Kunming Institute of Zoology der Chinesischen Akademie der Wissenschaften genehmigt (Genehmigungs-ID: IACUC-OE-2021-05-001).

Die Formulierung der isotonischen Ringer-Lösung (111,2 mM NaCl, 1,9 mM KCl, 1,1 mM CaCl2, 2,4 mM NaHCO3, 1,6 mM MgCl2) wurde auf der Grundlage eines früheren Berichts50 geändert. Nach dem Fasten wurden die Kröten der hypertonen Gruppe 3 Stunden lang in hypertone Ringer-Lösung (Ringer-Lösung mit 222,4 mM NaCl) gelegt und ihre Gewichtsveränderungen wurden aufgezeichnet. Kröten in der hypertonischen/isotonischen Gruppe wurden dann 3 Stunden lang von hypertonischer Ringer-Lösung in isotonische Ringer-Lösung überführt und ihre Gewichtsveränderungen wurden aufgezeichnet. Als Referenz wurden Gewichtsveränderungen von Kröten in isotonischer Ringer-Lösung über 6 Stunden aufgezeichnet und als isotonische Gruppe bezeichnet. Die Haut einiger Kröten wurde 3 Minuten lang elektrisch stimuliert (4,5 V Gleichstrom, Impulsdauer 10 ms), um Hautsekrete zu entfernen, und die Kröten wurden 30 Minuten lang in isotonische Ringer-Lösung gelegt. Ihre Überlebensraten wurden dann nach 48 Stunden in isotonischen und hypertonischen Lösungen aufgezeichnet.

Krötenepithelzellen wurden durch Gewebeverdau gewonnen. Konkret wurden die UB-, Haut- und Nierengewebe von B. maxima von fünf Kröten präpariert, deren Rückenmark zerstört worden war. Die Gewebe wurden weiter gespült und in Ringer-Lösung abgestreift, um restliches Blut, Schleim und andere Verunreinigungen zu entfernen. Anschließend wurden sie in Stücke geschnitten und zweimal in Ringer-Lösung gewaschen, gefolgt von einem Oszillationsverdau mit Trypsin bei Raumtemperatur für 40 Minuten. Die Zellen wurden mit einem 200-Mesh-Sieb in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen (Jet Biofil, Cat CFT011500) abgetrennt. Darüber hinaus wurden Kröten-Peritonealzellen aus der Peritonealflüssigkeit von B. maxima extrahiert. Alle Zellen wurden 5 Minuten lang bei 4 ° C mit 2.000 U / min zentrifugal angereichert. Die Verdauungszellen in Krötenhaut und UB-Geweben enthalten etwa 90 % bzw. 60 % epidermale Zellen, wie durch Durchflusszytometrie unter Verwendung eines monoklonalen Anti-Pan-Cytokeratin-AE1/AE3-Antikörpers (Invitrogen, Kat. 53-9003-80) analysiert wurde.

Die Zelllinien Madin-Darby-Hundeniere (MDCK), Caco-2, HEK293 und T24 wurden von der Kunming Cell Bank der Chinesischen Akademie der Wissenschaften erworben. Die Zellen wurden in DMEM/F-12 (Biological Industries, Kat.-Nr. 01-172-1 A) kultiviert, das 10 % fötales Rinderserum (Biological Industries, Kat. 04-001-1 A) und 1 % Levofloxacinhydrochlorid und Natriumchlorid-Injektion enthielt. Alle Zelllinien wurden kultiviert und bis zur Konfluenz in mit Rattenschwanzkollagen Typ I beschichteten Gewebekulturflaschen (Jet Biofil, Cat TCD010100) bei 37 °C und 5 % CO2 in feuchter Atmosphäre gezüchtet.

Die βγ-CAT-Reinigung und Reinheitsanalyse wurden gemäß der vorherigen Beschreibung durchgeführt19,22.

Der MTS-Assay wurde zum Nachweis der Zytotoxizität von βγ-CAT verwendet. Kurz gesagt, MDCK- und T24-Zelllinien wurden in 96-Well-Platten mit 1×104 Zellen pro Well ausgesät und über Nacht bei 37 °C in 5 % CO2 kultiviert. Die Zellen wurden mit dem MTS-Reagenz (Promega, Cat G3580) 1 Stunde lang im Dunkeln inkubiert, nachdem sie 2 Stunden lang mit βγ-CAT bei Raumtemperatur behandelt worden waren. Die Absorption des Kulturüberstands der Krötenzellen wurde mit 2×106 Zellen pro Vertiefung gemessen. Die Absorption wurde bei 490 nm mit dem Mikroplattenlesegerät Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Schweiz) nachgewiesen.

2×107 Krötenhaut-, UB-, Nieren- oder Peritonealzellen wurden zentrifugal angereichert und dann dreimal mit 5 ml Ringer-Lösung gewaschen, bis der Überstand keine hämolytische Aktivität auf menschliche Erythrozyten aufwies. Die Krötenzellsuspension wurde in vier Gruppen resuspendiert. Die nicht kultivierte Kontrollgruppe wurde zentrifugiert und der Überstand gesammelt. Die anderen drei Gruppen wurden 1,5 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und zentrifugiert, um den Überstand zu sammeln. Einer von ihnen diente als Kulturgruppe. Die verbleibenden zwei Chargen wurden mit 50 μg mL-1 Kaninchenantikörpern bzw. von Kaninchen stammenden Anti-βγ-CAT-Antikörpern gemischt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, während die unkultivierten und kultivierten Gruppen auf ähnliche Weise mit dem gleichen Volumen behandelt wurden Ringers Lösung. Dem Überstand wurden menschliche Erythrozyten in einer Konzentration von 3 % zugesetzt, 30 Minuten bei 37 °C inkubiert und anschließend 5 Minuten bei 2.000 U/min zentrifugiert. Die Absorption wurde bei 540 nm mit dem Mikroplattenlesegerät Infinite 200 Pro (Tecan, Männedorf, Schweiz) nachgewiesen.

Zuvor beschriebene Methoden wurden entsprechend geändert51. Kurz gesagt, verdaute MDCK-, Caco-2- und T24-Zellen wurden vor dem Nachweis 30 Minuten lang in serumfreiem Medium bei einer Konzentration von 2 × 106 Zellen pro ml kultiviert. Um die Zelldurchmesser zu bestimmen, behandelten wir MDCK-, Caco-2- und T24-Zellen mit hypertonischem PBS (die Zugabe von NaCl zu 0,01 M PBS erhöhte den osmotischen Druck auf 400 mOsm), das gereinigtes βγ-CAT in Dosen von 10 nM, 10 nM bzw. 5 nM enthielt . Kröten-UB-Epithelzellen wurden mit oder ohne 0,3 mM HgCl2 10 Minuten lang bei einer Konzentration von 2×106 Zellen pro ml inkubiert, nachdem sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit 50 μg mL-1 Kaninchen-Anti-βγ-CAT-Antikörpern inkubiert wurden. Durchmesserveränderungen von Kröten-UB-Epithelzellen wurden in isotonischer oder hypertonischer Ringer-Lösung festgestellt. Die Endkonzentration aller Zellen betrug 1×106 Zellen pro ml. Der durchschnittliche Zelldurchmesser wurde mit einem Countstar Automated Cell Counter (ALIT Life Science, Shanghai, China) bestimmt.

Ströme wurden an HEK293-Zellen mit der Outside-Out-Konfiguration der Patch-Clamp-Technik bei Raumtemperatur mit einem Multiclamp 700B-Verstärker und einem Digidata 1550A-Analog-Digital-Wandler aufgezeichnet, der von einer pClamp10-Software (Molecular Devices, San Jose, USA) gesteuert wurde. Die Pipettenlösung enthielt 150 mM KCl, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, pH 7,4; Die Badlösung enthielt 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4. Der Hintergrund (leer) und der durch 100 nM βγ-CAT induzierte makroskopische Strom wurden unter einem 500-Millisekunden-Rampenprotokoll zwischen –100 mV und +100 mV alle 2 Sekunden bei einem Haltepotential von 0 mV aufgezeichnet. Für Ersatzexperimente enthielt die Pipettenlösung 150 mM NaCl, 10 mM HEPES, 1 mM EGTA, pH 7,4; Die Badlösung enthielt 150 mM oder 15 mM NaCl, 10 mM HEPES, pH 7,4. Bei allen angezeigten Strömen wurde der Leckstrom abgezogen. Die Daten wurden mit pClamp10 und GraphPad Prism 8 analysiert.

Die mRNA-Spiegel von βγ-CAT-α und βγ-CAT-β in Krötenhaut, UB und Niere wurden durch qRT-PCR unter Verwendung eines Hieff qPCR SYBR Green Master Mix (No Rox) Kits (Yeasen, Cat 11201ES03) nachgewiesen. Die Zykluszahlen der Zielgene wurden auf die von β-Actin normalisiert. Die mRNA-Spiegel von FcRn in Krötenzellen aus Haut, UB, Niere und Bauchhöhle wurden ebenfalls durch RT-PCR nachgewiesen. Die Primersequenzen in dieser Studie sind in der Ergänzungstabelle 1 aufgeführt.

Die Markierungsreaktionen wurden gemäß einem zuvor beschriebenen Verfahren mit einigen Modifikationen durchgeführt52. Gereinigtes βγ-CAT wurde über Nacht in einer Vernetzungslösung (NaHCO3 7,56 g, Na2CO3 1,06 g und NaCl 7,36 g gelöst in 1 l Wasser; pH 9,0) unter Verwendung einer 3.500 Da Dialysemembran (Biosharp, Cat BS-QT-) dialysiert. 021) und 1 mg RBITC (Sigma, Kat. 283924) wurde in 1 ml DMSO (Sigma, Kat. D2650) gelöst. Die RBITC-Lösung wurde langsam zu βγ-CAT gegeben, um βγ-CAT zu ergeben: RBITC = 1 mg:150 μg, und die Probe wurde über Nacht bei 4 °C lichtgeschützt inkubiert. NH4Cl (50 mM) wurde zugegeben und die Lösung 2 Stunden lang bei 4 °C inkubiert, um die Reaktion zu beenden. Die dialysierten Proben wurden mit PBS auf 1 mg mL−1 konzentriert und bei 4 °C im Dunkeln gelagert.

Entsprechende Anpassungen wurden an einer früheren Beschreibung vorgenommen53. Kurz gesagt, MDCK-Zellen wurden auf einem Glasobjektträger mit 24 Vertiefungen zu 90 % gezüchtet. Mit Paraformaldehyd fixierte Schnitte von Krötengewebeproben und Zellkriechen wurden mit 0,5 % TritonX-100 behandelt. Nach 2-stündiger Blockierung in PBS mit 2 % BSA bei 37 °C wurden die Gewebe und Zellen mit von Mäusen stammenden Anti-AQP2- (Santa Cruz, Cat sc-515798) oder von Kaninchen stammenden Anti-βγ-CAT-Primärantikörpern inkubiert 2 Stunden bei 37 °C. Die Zellen wurden im Dunkeln mit fluoreszenzmarkiertem Sekundärantikörper 1 Stunde lang bei 37 °C inkubiert, nachdem sie dreimal mit PBS gewaschen wurden. Die Proben wurden mit einem DAPI enthaltenden Antifluoreszenzlöschmittel versiegelt. Die Lokalisierung von βγ-CAT oder BmAQP2 in Krötengeweben wurde unter Verwendung von aus Kaninchen stammenden Anti-AQP2-Antikörpern (ImmunoWay, Cat YT0290) und aus Mäusen stammenden Anti-βγ-CAT-Primärantikörpern bestimmt.

MDCK-Zellen wurden mit einer Dosis von 10 nM RBITC-βγ-CAT in 0,01 M PBS mit oder ohne 1 mg mL FITC-markiertem Dextran (Sigma, Cat 46945) 15 Minuten lang bei 37 °C behandelt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen 15 Minuten lang in 4 % Paraformaldehyd fixiert und dann 15 Minuten lang mit 0,5 % TritonX-100 behandelt. Die Proben wurden mit einem DAPI enthaltenden Antifluoreszenzlöschmittel versiegelt.

Die Bilder von Abb. 4b wurden mit einem konfokalen Lasermikroskopsystem Nikon A1 (Nikon, Tokio, Japan) aufgenommen. Die Bilder von Abb. 1g, h, Abb. 4a und der Ergänzung Abb. 3g wurden mit einem Zeiss LSM 880-Mikroskopsystem (Carl Zeiss, Oberkochen, Deutschland) aufgenommen.

Die Methode zur Isolierung von Exosomen wurde basierend auf einer früheren Beschreibung24 optimiert. Kurz gesagt, MDCK- und T24-Zellen wurden auf 100-mm-Zellkulturschalen zu 90 % gezüchtet. Die Zellen wurden in zwanzig Zellkulturschalen mit und ohne 10 nM oder 5 nM βγ-CAT 3 Stunden lang bei 37 °C kultiviert. Zellüberstand (200 ml) wurde für eine Gradientenzentrifugation (300 × g für 30 Minuten; 500 × g für 30 Minuten; 2.000 × g für 30 Minuten; 10.000 × g für 40 Minuten) bei 4 °C gesammelt, um restliche Zellen und Trümmer zu entfernen und Mikrovesikel. Exosomen wurden durch Ultrazentrifugation bei 100.000 × g mit Rotor P100AT2 für 2 Stunden bei 4 ° C erhalten und dann in PBS resuspendiert und erneut in der präparativen Ultrazentrifuge CP100WX (HATACHI, Tokio, Japan) angereichert. Die angereicherten Exosomen wurden für Folgeexperimente bei –80 °C gelagert.

Gesunde Kröten B. maxima wurden verwendet, um Gewebe zu entnehmen und es zu zermahlen, um Zellen zu gewinnen. 2×107 von drei Kröten erhaltene Zellen wurden in 10 ml Ringer-Lösung, die entweder 50 nM βγ-CAT, 50 μg mL-1 Kaninchen-IgG oder 50 μg mL-1 Kaninchen-Anti-βγ-CAT-Antikörper enthielt, 3 Stunden lang bei Raum kultiviert Temperatur. Exosomen wurden mit dem Hieff Quick Exosome Isolation Kit (Yeasen, Cat 41201-A) extrahiert. Der Zellüberstand wurde durch eine Reihe von Gradientenzentrifugationen (500 × g für 10 Minuten; 3.000 × g für 10 Minuten) erhalten. Es wurde 2 Stunden lang bei 4 °C gründlich mit einem Viertelvolumen des Reagenzes gemischt und dann 1 Stunde lang bei 10.000 × g zentrifugiert, um Exosomen zu sammeln. Nach der Resuspension in Ringer-Lösung wurde die Exosomen enthaltende Flüssigkeit 2 Stunden lang bei 4 ° C mit 100.000 × g mit dem Rotor P100AT2 zentrifugiert und einmal in einer präparativen Ultrazentrifuge CP100WX (HATACHI, Tokio, Japan) wiederholt. Die angereicherten Exosomen wurden für Folgeexperimente bei –80 °C gelagert.

2×105 MDCK- und T24-Zellen wurden mit 100 μg mL−1 70 kDa FITC-markiertem Dextran (Sigma, Kat. 46945) oder Lucifer Yellow (Sigma, Kat. L0144) im Dunkeln bei 37 °C für 30 Minuten mit und ohne 10 inkubiert nM bzw. 5 nM βγ-CAT. Den Proben folgte die Fluoreszenzdetektion von FITC oder AmCyan. In jeder Probe wurden 1×104 Einzelzellen analysiert. 2×106 Kröten-UB-Epithelzellen und Peritonealzellen wurden mit 50 nM βγ-CAT behandelt, während 100 nM βγ-CAT für 2×106 Krötenhaut- und Nierenzellen verwendet wurde. Im Test mit Immundepletion von endogenem βγ-CAT wurden Krötenzellen 30 Minuten lang mit 50 μg mL-1 von Kaninchen stammenden Anti-βγ-CAT-Antikörpern inkubiert, bevor das obige Protokoll durchgeführt wurde. Um die unspezifische Wirkung von exogenem Kaninchen-IgG zu testen, wurden MDCK-Zellen vor dem obigen Protokoll 30 Minuten lang mit 50 μg mL-1 Kaninchen-IgG oder einem aus Kaninchen stammenden Anti-βγ-CAT-Antikörper inkubiert. Während des Inhibitor-Experiments wurden die Zellen zunächst mit 100 μM EIPA (MedChemExpress, Cat HY-101840A) oder 20 μM Wortmannin (Sigma, Cat 681675) für 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Darüber hinaus wurden 2×106 verdaute Kröten-UB-Epithelzellen 3 Stunden lang in vitro kultiviert und mit 500 ng mL-1 Propidiumiodid (BD Pharmingen, Kat. 556547) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur co-inkubiert. Die Fluoreszenz wurde mit dem LSR Fortessa-Zellanalysator (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) aufgezeichnet. Die Daten wurden mit FlowJo 10 und GraphPad Prism 8 analysiert.

Exosomen der UB-Epithelzellen der Kröte wurden wie unter „Isolierung von Exosomen“ beschrieben isoliert. Exosomen oder 2×107 Kröten-UB-Epithelzellen wurden in Medium, das 1 mg mL-1 FITC-markiertes Dextran mit oder ohne 50 nM βγ-CAT enthielt, 3 Stunden lang bei Raumtemperatur kultiviert. Exosomen der UB-Epithelzellen der Kröte wurden angereichert und restliches Dextran wurde unter Verwendung der unter „Isolierung von Exosomen“ beschriebenen Methode abgewaschen. Alle Experimente wurden im Dunkeln durchgeführt. Die Fluoreszenz und Partikelgrößenverteilung wurden mit Flow NanoAnalyzer (NanoFCM, Xiamen, China) aufgezeichnet. Die Daten wurden mit FlowJo 10 und GraphPad Prism 8 analysiert.

Die Experimente basierten auf dem vorherigen Bericht54. Gewebeproben wurden über Nacht mit 0,1 M PB (pH 7,4), das 3 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd enthielt, bei 4 °C fixiert, viermal 15 Minuten lang mit 0,1 M PB gewaschen und dann 30 Minuten lang mit 0,1 M Glycin in 0,1 M PB gewaschen bei 4 °C. Nach der Dehydratisierung mit einem Ethanolgradienten wurde die Probe in weißes LR-Harz (Sigma, Kat. L9774) eingebettet und 24 Stunden lang bei 55 °C polymerisiert. 100-nm-Ultradünnschnitte wurden mit einem EM UC7-Ultramikrotom (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) hergestellt und auf 200-Mesh-Ni-Gitter (EMCN, Cat BZ10262Na) geladen. Angereicherte Exosomen wurden vor der experimentellen Behandlung 10 Minuten lang direkt an Ni-Gitter befestigt. Die Proben wurden 2 Minuten lang mit entionisiertem Wasser gewaschen und dann 5 Minuten lang mit 1 % BSA blockiert. Nach einer Inkubation über Nacht mit primären Anti-βγ-CAT- oder Kaninchen-anti-AQP2-Primärantikörpern (ImmunoWay, Cat YT0290) bei 4 °C wurden die Proben zehnmal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Anschließend wurden die Proben mit 5-nm- oder 10-nm-kolloidalem Gold-konjugiertem Sekundärantikörper (Sigma, Cat G7527 und G7402) zwei Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert und zehnmal bei Raumtemperatur gewaschen. Die Exosomen wurden 3 Minuten lang mit 2 % Uranylacetat gefärbt, und die Schnitte wurden 7 Minuten lang mit 2 % Uranylacetat und 5 Minuten lang mit Bleicitrat gefärbt, bevor sie mit einem JEM 1400 plus Transmissionselektronenmikroskop bei 100 kV beobachtet wurden.

2×107 Kröten-UB-Epithelzellen, angereichert durch Zentrifugation, wurden mit Ringer-Lösung (N-Methyl-D-Glucamin wurde anstelle von NaCl verwendet) nach dreimaligem Aufschluss und Waschen resuspendiert. MDCK-Zellen wurden zu 90 % auf 100-mm-Zellkulturschalen kultiviert, und in diesem Experiment wurden drei Zellkulturschalen in jeder Gruppe verwendet. Kröten-UB-Epithelzellen und MDCK-Zellen wurden 3 Stunden lang mit und ohne 50 nM bzw. 10 nM βγ-CAT kultiviert. Die Zellen wurden gesammelt und mit entionisiertem Wasser lysiert. Die Natriumkonzentrationen in MDCK-Exosomen wurden in isotonischen oder hypertonischen Tests unter Verwendung von jeweils vierzig bzw. zwanzig Zellkulturschalen in jeder Gruppe gemessen. MDCK-Exosomen wurden wie unter „Isolierung von Exosomen“ beschrieben isoliert. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren und dann langsam bei Raumtemperatur geschmolzen und zweimal wiederholt. Ultraschallzellzerkleinerung (Leistung 200 W, Arbeit alle 10 Sekunden für 5 Sekunden, 40 Zyklen) wurde verwendet, um die Probe freizugeben, bis die Flüssigkeit transparent war. Verunreinigungen in den Proben wurden durch Gradientenzentrifugation (2000 × g für 30 Minuten; 10.000 × g für 1 Stunde) entfernt. Nachdem die Probe mit einem 0,22-μm-Filter gefiltert wurde, wurde die Konzentration der Natriumionen in den Proben mit dem optischen Emissionsspektrometer iCAP6300 mit induktiv gekoppeltem Plasma (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Vereinigte Staaten von Amerika) bestimmt.

Alle Exosomenproben wurden mit PBS auf etwa 1×107 Partikel pro ml verdünnt. Die Partikelgröße und Konzentration der Exosomen wurden mit ZetaView PMX 110 (Particle Metrix, Meerbusch, Deutschland) gemessen und die Daten mit der Software ZetaView 8.04.02 analysiert.

Um den Proteingehalt von βγ-CAT oder AQP2 zu messen, wurden Kröten-UB-Epithelzellen, MDCK-, Caco-2- und T24-Zellen 15 Minuten lang mit oder ohne 50 nM, 10 nM, 10 nM bzw. 5 nM βγ-CAT behandelt. Gesamt-Akt und Phospho-Akt wurden durch 30- oder 60-minütige Behandlung von MDCK-Zellen mit oder ohne 10 nM βγ-CAT nachgewiesen. Exosomen aus Kröten-UB-Epithelzellen wurden mit Ringer-Lösung gewaschen und mit RIPA-Lysepuffer auf Eis geerntet. Das aus Kaninchen stammende Anti-βγ-CAT, das aus Kaninchen stammende Anti-AQP2 (ImmunoWay, Cat YT0290), das aus Mäusen stammende Anti-CD63 (Abcam, Cat ab193349), das aus Kaninchen stammende Anti-TSG101 (Proteintech, Cat 28283-1- AP), aus Kaninchen stammendes Anti-Flottillin 1 (Proteintech, Kat. 11571-1-AP), aus Kaninchen stammendes Anti-PI3-Kinase p85 (CST, Kat. 4257), aus Kaninchen stammendes Anti-Phospho-PI3-Kinase p85 (CST, Kat 4228), aus Kaninchen stammendes Anti-Rac1/2/3 (CST, Kat. 2465), aus Kaninchen stammendes Anti-Total-Akt (CST, Kat. 4691) und aus Kaninchen stammendes Anti-Phospho-Akt-S473 (CST, Kat. 4060) In diesen Experimenten wurden primäre Antikörper verwendet.

Die Evolutionsgeschichte wurde mithilfe der Maximum-Likelihood-Methode basierend auf dem Poisson-Korrekturmodell55 abgeleitet. Die anfänglichen Bäume für die heuristische Suche wurden automatisch erhalten, indem Neighbor-Join- und BioNJ-Algorithmen auf eine Matrix paarweiser Abstände angewendet wurden, die mithilfe eines JTT-Modells geschätzt wurden, und dann die Topologie mit dem überlegenen Log-Likelihood-Wert ausgewählt wurde (56). Die Evolutionsanalyse wurde in MEGA7 durchgeführt. Darüber hinaus wurde von Clustal Omega eine Sequenz-Alignment-Analyse von AQPs in der Kröte B. maxima und anderen Arten durchgeführt.

Die Überlebensdaten der Tiere wurden mit dem Gehan-Breslow-Wilcoxon-Test analysiert. Alle anderen Daten wurden mit dem standardmäßigen ungepaarten T-Test analysiert. Unterschiede mit P-Werten < 0,05 wurden als statistische Signifikanz angesehen. Alle statistischen Analysen wurden mit der GraphPad Prism 8-Software durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Quellen für alle Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, werden im Haupttext, in den ergänzenden Abbildungen und in der ergänzenden Tabelle 1 zitiert. Unbeschnittene und unbearbeitete Blot-/Gelbilder als ergänzende Abbildung. 5 bei den Zusatzinformationen. Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind im Dryad Data Repository verfügbar (https://doi.org/10.5061/dryad.0p2ngf226)57. Alle Clipart-Komponenten in Abb. 6 stammen aus PowerPoint 2019 und Adobe Illustrator CC 2019.

Bentley, PJ Anpassungen von Amphibien an trockene Umgebungen. Wissenschaft 152, 619–623 (1966).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Shoemaker, V. & Nagy, KA Osmoregulation bei Amphibien und Reptilien. Annu. Rev. Physiol. 39, 449–471 (1977).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Hillyard, SD Verhaltens-, molekulare und integrative Mechanismen der Osmoregulation von Amphibien. J. Exp. Zool. 283, 662–674 (1999).

3.0.CO;2-L" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28SICI%291097-010X%2819990601%29283%3A7%3C662%3A%3AAID-JEZ5%3E3.0.CO%3B2-L" aria-label="Article reference 3" data-doi="10.1002/(SICI)1097-010X(19990601)283:73.0.CO;2-L">Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ogushi, Y. et al. Der Wasserabsorptionsbereich der Bauchhaut mehrerer semiterrestrischer und aquatischer Anuran-Amphibien, identifiziert durch Aquaporine. Bin. J. Physiol. -Regul. Integr. Komp. Physiol. 299, R1150–R1162 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Suzuki, M., Hasegawa, T., Ogushi, Y. & Tanaka, S. Amphibien-Aquaporine und Anpassung an terrestrische Umgebungen: Eine Übersicht. Komp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 148, 72–81 (2007).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Kerr, MC & Teasdale, RD Definition der Makropinozytose. Verkehr 10, 364–371 (2009).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Swanson, JA & Watts, C. Makropinozytose. Trends Zellbiol. 5, 424–428 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Ramirez, C., Hauser, AD, Vucic, EA und Bar-Sagi, D. Die Plasmamembran-V-ATPase kontrolliert die onkogene RAS-induzierte Makropinozytose. Natur 576, 477–481 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bretou, M. et al. Die Lysosomensignalisierung steuert die Migration dendritischer Zellen. Wissenschaft. Immunol. 2, eaak9573 (2017).

Artikel PubMed Google Scholar

Palm, W. & Thompson, CB Nährstoffaufnahmestrategien von Säugetierzellen. Natur 546, 234–242 (2017).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Palm, W. Stoffwechselfunktionen der Makropinozytose. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Wissenschaft. 374, 20180285 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Swanson, JA & King, JS Die Breite der Makropinozytose-Forschung. Philos. Trans. R. Soc. B Biol. Wissenschaft. 374, 20180146 (2019).

Artikel CAS Google Scholar

Parker, MW et al. Struktur des Aeromonas-Toxins Proaerolysin in seinen wasserlöslichen und Membrankanalzuständen. Nature 367, 292–295 (1994).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Peraro, MD & van der Goot, FG Porenbildende Toxine: uralt, aber nie wirklich aus der Mode. Nat. Rev. Microbiol. 14, 77–92 (2016).

Artikel CAS Google Scholar

Szczesny, P. et al. Erweiterung der Aerolysin-Familie: von Bakterien zu Wirbeltieren. PLoS ONE 6, e20349 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Y. Warum untersuchen wir tierische Giftstoffe? Zool. Res. 36, 183–222 (2015).

CAS Google Scholar

Zhang, Y., Wang, QQ, Zhao, Z. & Deng, CJ Entdeckung sekretorischer Endolysosomenkanäle bei Tieren. Zool. Res. 42, 141–152 (2021).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, QQ et al. Ein zelluläres Endolysosomen-modulierendes porenbildendes Protein aus einer Kröte wird unter oxidierenden Bedingungen durch sein Paralog negativ reguliert. J. Biol. Chem. 295, 10293–10306 (2020).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, SB et al. Ein neuartiger Nicht-Linsen-βγ-Kristallin- und Kleeblattfaktor-Komplex aus Amphibienhaut und seine funktionellen Auswirkungen. PLoS ONE 3, e1770 (2008).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Gao, Q. et al. Charakterisierung der βγ-Kristallindomänen von βγ-CAT, einem nicht-linsenförmigen βγ-Kristallin- und Kleeblattfaktor-Komplex, aus der Haut der Kröte Bombina maxima. Biochimie 93, 1865–1872 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Guo, XL et al. Endogener porenbildender Proteinkomplex zielt auf saure Glykosphingolipide in Lipidflößen ab, um die Endolysosomenregulation einzuleiten. Komm. Biol. 2, 59 (2019).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Xiang, Y. et al. Der vom Wirt stammende, porenbildende Komplex aus toxinähnlichem Protein und Kleeblattfaktor schützt den Wirt vor mikrobiellen Infektionen. Proz. Natl Acad. Wissenschaft. 111, 6702–6707 (2014).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, SA et al. Der porenbildende Proteinkomplex des Wirts neutralisiert die Ansäuerung endozytischer Organellen, um intrazellulären Krankheitserregern entgegenzuwirken. J. Infizieren. Dis. 215, 1753–1763 (2017).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Deng, CJ et al. Ein sezerniertes porenbildendes Protein moduliert zelluläre Endolysosomen, um die Antigenpräsentation zu steigern. FASEB J. 34, 13609–13625 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Gao, ZH et al. Der vom Frosch exprimierte porenbildende toxinähnliche Proteinkomplex fördert die Gewebereparatur. FASEB J. 33, 782–795 (2019).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Liu, L. et al. Ein Aerolysin-ähnlicher porenbildender Proteinkomplex zielt auf die Virushülle ab, um das Herpes-Simplex-Virus Typ 1 zu inaktivieren. J. Immunol. 207, 888–901 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Larsen, EH Doppelte Hautfunktionen bei der Osmoregulation von Amphibien. Komp. Biochem. Physiol. A. Mol. Integr. Physiol. 253, 110869 (2021).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Takata, K. Aquaporine: Wasserkanalproteine ​​der Zellmembran. Prog. Histochem. Zytochem. 39, 1–83 (2004).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

de Baey, A. & Lanzavecchia, A. Die Rolle von Aquaporinen bei der Makropinozytose dendritischer Zellen. J. Exp. Med. 191, 743–748 (2000).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Nonnenmacher, M. & Weber, T. Eine Adeno-assoziierte Virus-2-Infektion erfordert Endozytose über den CLIC/GEEC-Weg. Cell Host Microbe 10, 563–576 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lim, JP & Gleeson, PA Makropinozytose: ein endozytischer Weg zur Internalisierung großer Schlucke. Immunol. Zellbiol. 89, 836–843 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Challa, DK et al. Die Expression des neonatalen Fc-Rezeptors in Makrophagen ist für die IgG-Homöostase unverzichtbar. mAbs 11, 848–860 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Araki, N., Johnson, MT & Swanson, JA Eine Rolle der Phosphoinositid-3-Kinase bei der Vervollständigung der Makropinozytose und Phagozytose durch Makrophagen. J. Cell Biol. 135, 1249–1260 (1996).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Lin, HP et al. Identifizierung neuartiger Makropinozytose-Inhibitoren mithilfe eines rationalen Screenings von von der Food and Drug Administration zugelassenen Arzneimitteln. Br. J. Pharmacol. 175, 3640–3655 (2018).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hays, RM & Leaf, A. Studien zur Bewegung von Wasser durch die isolierte Krötenblase und ihrer Modifikation durch Vasopressin. J. Gen. Physiol. 45, 905–919 (1962).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hasegawa, T., Suzuki, M. & Tanaka, S. Immunzytochemische Studien zur Translokation von phosphoryliertem Aquaporin-h2-Protein in Körnerzellen der Froschharnblase vor und nach Stimulation mit Vasotocin. Zellgeweberes. 322, 407–415 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Davis, CW & Finn, AL Wechselwirkungen von Natriumtransport, Zellvolumen und Kalzium in der Harnblase von Fröschen. J. Gen. Physiol. 89, 687–702 (1987).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

van Niel, G., D'Angelo, G. & Raposo, G. Wir beleuchten die Zellbiologie extrazellulärer Vesikel. Nat. Rev. Mol. Zellbiol. 19, 213–228 (2018).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Gao, Q. et al. βγ-CAT, ein nicht-linsenförmiger Beta-Gamma-Kristallin- und Kleeblattfaktor-Komplex, induziert eine kalziumabhängige Blutplättchen-Apoptose. Thromb. Haemost. 105, 846–854 (2011).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, YX, Lai, R., Lee, WH & Zhang, Y. Froschalbumin wird in der Haut exprimiert und als neuartiger wirksamer Trypsininhibitor charakterisiert. Proteinwissenschaft. 14, 2469–2477 (2005).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhao, F. et al. Umfassende Transkriptomprofilierung und Funktionsanalyse des Immunsystems des Frosches (Bombina maxima). DNA-Res. 21, 1–13 (2014).

Artikel PubMed CAS Google Scholar

Freeman, SA et al. Lipidgesteuerte monovalente Ionenflüsse regulieren den endozytischen Verkehr und unterstützen die Immunüberwachung. Wissenschaft 367, 301–305 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

King, JS & Smythe, E. Wasserverlust reguliert das Zell- und Vesikelvolumen. Wissenschaft 367, 246–247 (2020).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Russell, AE et al. Biologische Membranen in der EV-Biogenese, Stabilität, Aufnahme und Ladungsübertragung: ein ISEV-Positionspapier, das aus dem ISEV-Membran- und EV-Workshop hervorgegangen ist. J. Extracell. Vesikel 8, 1684862 (2019).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lencer, WI & Blumberg, RS Ein leidenschaftlicher Kuss, dann ein Lauf: Exozytose und Recycling von IgG durch FcRn. Trends Zellbiol. 15, 5–9 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

McManus, ML, Churchwell, KB & Strange, K. Regulierung des Zellvolumens bei Gesundheit und Krankheit. N. engl. J. Med. 333, 1260–1267 (1995).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rosenthal, R. et al. Claudin-2, ein Bestandteil der Tight Junction, bildet einen parazellulären Wasserkanal. J. Cell Sci. 123, 1913–1921 (2010).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Rosenthal, R. et al. Claudin-2-vermittelter Kationen- und Wassertransport haben eine gemeinsame Pore. Acta Physiol. 219, 521–536 (2017).

Artikel CAS Google Scholar

Marunaka, Y. Eigenschaften und pharmakologische Regulierung des epithelialen Na+-Kanals (ENaC) und des epithelialen Na+-Transports. J. Pharmacol. Wissenschaft. 126, 21–36 (2014).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Edström, A. Auswirkungen von Ca2+ und Mg2+ auf den schnellen axonalen Transport von Proteinen in vitro in Ischiasnerven von Fröschen. J. Cell Biol. 61, 812–818 (1974).

Artikel PubMed PubMed Central Google Scholar

Marchbank, T. & Playford, RJ Peptide der Trefoil-Faktorfamilie verbessern die Zellmigration, indem sie die zelluläre osmotische Permeabilität und den Aquaporin-3-Spiegel erhöhen. FASEB J. 32, 1017–1024 (2018).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Wang, Z. et al. Ein supramolekulares Protein-Chaperon für die Impfstoffabgabe. Theranostics 10, 657–670 (2020).

Artikel PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Li, L., Zhang, H., Varrin-Doyer, M., Zamvil, SS & Verkman, AS Proinflammatorische Rolle von Aquaporin-4 bei autoimmuner Neuroinflammation. FASEB J. 25, 1556–1566 (2011).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, J. et al. GPRC5A unterdrückt die Proteinsynthese am endoplasmatischen Retikulum, um die strahleninduzierte Lungentumorentstehung zu verhindern. Nat. Komm. 7, 11795 (2016).

Artikel CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zuckerkandl, E. & Pauling, L. Evolutionäre Divergenz und Konvergenz in Proteinen. in Evolving Genes and Proteins 97–166 (Elsevier, 1965). https://doi.org/10.1016/B978-1-4832-2734-4.50017-6.

Hollich, V., Milchert, L., Arvestad, L. & Sonnhammer, ELL Bewertung von Proteinabstandsmaßen und Baumaufbaumethoden für die phylogenetische Baumrekonstruktion. Mol. Biol. Entwicklung 22, 2257–2264 (2005).

Artikel CAS PubMed Google Scholar

Zhang, Y., Zhao, Z., Shi, ZH und Ye, CJ Daten von: Ein porenbildendes Protein treibt die Makropinozytose an, um die Wasserhaltung der Kröte zu erleichtern, Dryad, Datensatz, https://doi.org/10.5061/dryad. 0p2ngf226 (2021).

Referenzen herunterladen

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (Zuschussnummern 31872226, U1602225 und 31572268) und des Yunling Scholar Program für Yun Zhang unterstützt. Wir möchten dem Kunming Biological Diversity Regional Center of Instrument, dem Kunming Institute of Zoology und der Chinesischen Akademie der Wissenschaften für unsere Elektronenmikroskopie danken und wären Ying-Qi Guo für ihre Hilfe bei der Herstellung von EM-Proben dankbar.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Zhong Zhao, Zhi-Hong Shi.

Schlüssellabor für Tiermodelle und menschliche Krankheitsmechanismen der Chinesischen Akademie der Wissenschaften/Ingenieurlabor für Peptide der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Kunming-Institut für Zoologie, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Kunming, Yunnan, 650201, China

Zhong Zhao, Zhi-Hong Shi, Chen-Jun Ye und Yun Zhang

Kunming College of Life Science, Universität der Chinesischen Akademie der Wissenschaften, Kunming, Yunnan, 650204, China

Zhong Zhao & Zhi-Hong Shi

Institut für medizinische Grundlagenwissenschaften, Chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften und Peking Union Medical College, Peking, 100005, China

Zhong Zhao

Kompetenzzentrum für Tierentwicklung und Genetik, Chinesische Akademie der Wissenschaften, Kunming, Yunnan, 650201, China

Yun Zhang

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Sie können diesen Autor auch in PubMed Google Scholar suchen

Diese Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen: ZZ und ZHS Korrespondenz mit YZYZ, ZZ und ZHS hat die Studie konzipiert und konzipiert; ZZ, ZHS und CJY führten die Experimente durch, ZZ, YZ, ZHS und CJY analysierten und interpretierten die Daten; ZZ, YZ, ZHS haben das Manuskript geschrieben; YZ, ZZ, ZHS und CJY haben das Manuskript hinsichtlich wichtiger intellektueller Inhalte kritisch überarbeitet.

Korrespondenz mit Yun Zhang.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: Luke R. Grinham. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Zhao, Z., Shi, ZH., Ye, CJ. et al. Ein porenbildendes Protein treibt die Makropinozytose an, um die Wasserhaltung der Kröte zu erleichtern. Commun Biol 5, 730 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03686-1

Zitat herunterladen

Eingegangen: 17. August 2021

Angenommen: 07. Juli 2022

Veröffentlicht: 22. Juli 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03686-1

Jeder, mit dem Sie den folgenden Link teilen, kann diesen Inhalt lesen:

Leider ist für diesen Artikel derzeit kein Link zum Teilen verfügbar.

Bereitgestellt von der Content-Sharing-Initiative Springer Nature SharedIt

Durch das Absenden eines Kommentars erklären Sie sich damit einverstanden, unsere Nutzungsbedingungen und Community-Richtlinien einzuhalten. Wenn Sie etwas als missbräuchlich empfinden oder etwas nicht unseren Bedingungen oder Richtlinien entspricht, kennzeichnen Sie es bitte als unangemessen.