Hippocampuszellen trennen positive und negative Engramme

Kommunikationsbiologie Band 5, Artikelnummer: 1009 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Der Hippocampus ist an der Verarbeitung verschiedener mnemonischer Berechnungen beteiligt, insbesondere der räumlich-zeitlichen Komponenten und emotionalen Dimensionen des kontextuellen Gedächtnisses. Neuere Studien haben zelluläre Heterogenität entlang der Hippocampusachse gezeigt. Der ventrale Hippocampus hat sich als wichtig für die Verarbeitung von Emotionen und Valenz erwiesen. Hier kombinieren wir transgene und rein virusbasierte aktivitätsabhängige Markierungsstrategien, um mehrere valenzspezifische Engramme im vHPC zu visualisieren und zwei teilweise getrennte Zellpopulationen und Projektionen zu demonstrieren, die auf appetitliche und aversive Erfahrungen reagieren. Als nächstes stellen wir unter Verwendung von RNA-Sequenzierungs- und DNA-Methylierungssequenzierungsansätzen fest, dass appetitive und aversive vHPC-Engrammzellen im Vergleich zu einer neutralen Engrammpopulation andere Transkriptionsprogramme und DNA-Methylierungslandschaften aufweisen. Darüber hinaus reicht die optogenetische Manipulation markierter Zellkörper in vHPC nicht aus, um appetitanregendes oder aversives Verhalten in Echtzeit-Ortspräferenzen zu fördern, und stimuliert markierte vHPC-Terminals, die in die Amygdala und den Nucleus accumbens (NAc) projizieren, nicht jedoch in den präfrontalen Kortex (PFC). , zeigte die Bevorzugung und Vermeidung von Kapazitätslaufwerken. Diese Terminals waren auch in der Lage, ihr Fahrverhalten zu ändern. Wir kommen zu dem Schluss, dass der vHPC genetisch, zellulär und verhaltensmäßig getrennte Populationen von Zellen enthält, die appetitliche und aversive Gedächtnisengramme verarbeiten.

Im Gehirn finden wir einen reichhaltigen Speicher an Erinnerungen, der mit positiv und negativ bewerteten Informationen durchdrungen sein kann1,2,3. Diese Erfahrungen hinterlassen dauerhafte strukturelle und funktionelle4 Veränderungen, die in1,5,6,7,8,9 diskrete Gruppen von Zellen und Schaltkreisen aufgeteilt werden, die das Gedächtnis-Engramm10 bilden. Jüngste Studien haben erfolgreich definierte Gruppen von Zellen visualisiert und manipuliert, die zuvor während einer einzelnen Erfahrung aktiv waren10,11,12,13,14,15,16,17. Wie jedoch mehrere Engramme unterschiedlicher Valenz (im Folgenden als Zellen definiert, die unterschiedlich und reizunabhängig auf appetitive oder aversive Ereignisse reagieren18) innerhalb derselben Gehirnregion repräsentiert werden, ist noch wenig verstanden. Frühere Studien haben gezeigt, dass der ventrale Hippocampus (vHPC) emotionale Informationen selektiv abgrenzt und an verschiedene nachgelagerte Ziele weiterleitet. Wir wollten die molekularen und zellulären Identitäten und die verhaltensrelevanten Funktionen von vHPC-Zellen charakterisieren, die appetitive und aversive Engramme verarbeiten, mit Schwerpunkt auf ventralem CA1 (vCA1). Um die Frage zu beantworten, wie vCA1 mehrere emotionale Erfahrungen verarbeitet, haben wir zunächst eine Strategie entwickelt, die zwei cFos-basierte Markierungsmethoden mit endogener cfos-Immunhistochemie kombiniert, um Engramme über drei diskrete Zeitpunkte hinweg zu visualisieren. Zunächst haben wir die Projektionsmuster appetitiv und aversiv markierter vCA1-Zellen anatomisch aufgezeichnet, um strukturelle Überlappungen und Segregationen über verschiedene nachgelagerte Ziele hinweg zu messen. Zweitens führten wir eine genomweite RNA-Sequenzierung (RNA-seq) und DNA-Methylierungssequenzierung durch, um die genetischen Merkmale dieser Zellsätze zu untersuchen. Abschließend haben wir die kausale Rolle und funktionelle Flexibilität von vHPC-Zellen sowohl zellkörper- als auch projektionsspezifisch verhaltensgetestet.

Um zunächst über mehrere Zeitpunkte und aktivitätsabhängig innerhalb des Subjekts auf Zellen zuzugreifen, verwendeten wir das Fos-basierte transgene Tier TRAP218 unter der Kontrolle von 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) gepaart mit einem rein viralen Fos -basierte Strategie unter der Kontrolle von Doxycyclin10 (Dox) (Abb. 1a). TRAP2 + -Mäuse, die iCre-ERT2-Rekombinase exprimieren, zeigen bei Injektion von DMSO anstelle von 4-OHT keine TdTomato-Expression (ergänzende Abbildung 1) und wurden bilateral mit einem Virencocktail injiziert: AAV9-Flex-DIO-TdTomato und AAV-cFos -tTA + AAV-TRE-EYFP. Die cfos-tTA-Strategie koppelt den c-Fos-Promotor an den Tetracyclin-Transaktivator (tTA), der in seiner Proteinform Doxycyclin-(Dox)-abhängig direkt an das Tetracyclin-Response-Element (TRE) bindet und die Expression steuert eines Proteins von Interesse (z. B. EYFP). Die Kombination dieser beiden unabhängigen Systeme ergibt zwei induzierbare Fenster zum Markieren von vHPC-Zellen innerhalb desselben Subjekts (siehe Methoden).

a Fos-CreERT2-Mäusen wurde ein viraler Cocktail aus AAV9-c-Fos-tTA und AAV9-TRE-EYFP im Verhältnis 1:1 gemischt im Verhältnis 1:1 mit AAV-Flex-DIO-TdTomato in das vHPC injiziert, um das zu erzeugen Möglichkeit, zwei Tagging-Fenster mit der Maus zu öffnen. b Schematische Darstellung des Zeitverlaufs für TAG1 und TAG2, die jeweils von Doxycyclin und 4-Hydroxytamoxifen abhängig sind. Der aversive Tag besteht aus 4-Fuß-Schocks und der appetitliche Tag besteht aus der Konfrontation zwischen Mann und Frau. c Repräsentatives Bild der dualen Speichertrennung in einem sagittalen Abschnitt des vHPC, insbesondere vCA1. d Quantifizierung (%Labeling) von EYFP + (aversiv) und TdTomato + (appetitiv) Zellen über DAPI entlang der anterior-posterioren Achse von vCA1, die die Trennung der Valenz zeigt. (N = 3) e Schema zur Visualisierung von Zellen, die während drei verschiedener Verhaltenserfahrungen aktiv sind. TAG1 ist bei EYFP Doxycyclin-abhängig, TAG2 ist bei TdTomato 4-OHT-abhängig und schließlich wird TAG3 mit Immunhistochemie durch Färbung auf endogenes CFOS 90 Minuten nach einem Verhaltenserlebnis sichtbar gemacht. f Schematische Darstellung von Gruppen zur Visualisierung dreifacher Gedächtnisüberlappungen (n = 4–6 pro Gruppe). Die Gruppen wurden ausbalanciert, um potenzielle zeitliche Verzerrungen zu vermeiden. g Repräsentative Bilder von dreifachen Speicherüberlappungen in vCA1 mit einem 20-fachen Zoom, der die verschiedenen repräsentativen Überlappungen zeigt. h Die Anzahl der markierten Neuronen in vCA1 ist bei EYFP, TdTomato und cfos ähnlich; Es gibt keinen statistischen Unterschied zwischen der Einstellung. (Mehrfachvergleiche einseitig Anova; N = 10–12) i, Prozentuale Überlappung für jeweilige Verhaltens-Tags für EYFP + Tdtomato für aversiv + appetitlich (Gruppe 1), aversiv + aversiv (Gruppe 2), appetitlich + aversiv (Gruppe 3) und appetitlich + appetitlich (Gruppe 4), (F (3, 12) = 170,0, P < 0,0001). j NS-Unterschied in cfos+EYFP-überlappenden Zellen bei Zwangsstress + Schock vs. gesüßter Kondensmilch + weiblicher Exposition. k, ähnliche Valenzen aversiv und stressig und appetitiv und Milch überlappen einander stark, wenn man sie mit der Überlappung verschiedener Valenzen vergleicht, appetitiv und Stress und aversiv und Milch. Mehrfachvergleiche, einfaktorielle ANOVA; F (3, 12) = 20,77, P < 0,0001. l Dreifache Überlappungszahlen für EYFP + TdTomato + cfos (F (3, 12) = 10,55, ns, nicht signifikant p > 0,05, P = 0,0011; Fehlerbalken stellen Mittelwert ± Standardmittelwert der Fehler (SEM) dar.

Nachdem wir den oben genannten Viruscocktail in den vHPC injiziert hatten, nutzten wir dieses Dual-Tagging-System, um Zellen zu markieren, die appetitliche oder aversive Engramme verarbeiten. Zehn Tage nach der Operation und Genesung wurde den Mäusen 48 Stunden lang die DOX-Chow-Diät entzogen, um das erste Fenster der Markierung zu öffnen. Um das Appetiterlebnis zu kennzeichnen, wurden die Mäuse während der Abwesenheit von DOX eine Stunde lang weiblichen Tieren in einem sauberen Heimkäfig ausgesetzt13,19 und für den Rest der Studie sofort wieder auf die DOX-Diät gesetzt. Um das aversive Erlebnis zu kennzeichnen, wurden männliche Mäuse 24 Stunden später dem zweiten Zellsatz vier Fußschocks von 2 s und 1,5 mA ausgesetzt. 30 Minuten nach dem Ende der Angstkonditionierung wurden den Mäusen 40 mg/kg 4-OHT injiziert und sie blieben 72 Stunden lang ungestört (Abb. 1b). Wir beobachteten zunächst eine auffällige anatomische Unterscheidung zwischen appetitiven und aversiven Engrammen entlang der vorderen und hinteren Achse in sagittalen Schnitten von vCA1 (Abb. 1c). Appetitive Engrammzellen befanden sich überwiegend in weiter hinteren Abschnitten, wohingegen aversive Engrammzellen größtenteils in vorderen Abschnitten von vCA1 vorhanden waren, wobei in den medialen Abschnitten ein Salz-und-Pfeffer-Muster beobachtet wurde (Abb. 1c, d). Wir fanden heraus, dass die Reihenfolge der Markierung, der Markierung des Schocks und der anschließenden Exposition der Frau keinen Einfluss auf die anatomische Rekrutierung dieser Zellen hatte (ergänzende Abbildung 2).

Als Nächstes fragten wir unter Verwendung derselben Dual-Tagging-Strategie wie oben beschrieben, ob diese mit Appetit- und Aversiv-Tags versehenen Populationen bei späteren Erfahrungen mit ähnlichen Valenzen rekrutiert wurden oder nicht. Zu diesem Zweck fügten wir einen dritten Zeitpunkt hinzu, indem wir die endogene cFos-Expression 90 Minuten nach einem letzten Verhaltenserlebnis visualisierten, dh der Exposition gegenüber gesüßter Kondensmilch oder Zurückhaltungsstress20,21,22,23 (Abb. 1e, f). Um die Reihenfolge der Erfahrungen zu kontrollieren, haben wir die vier Gruppen ausgeglichen, von denen jede zwei markierte Zellpopulationen enthielt (d. h. aversiv für Zellen, die durch Angstkonditionierung markiert waren, und appetitlich für Zellen, die durch männlich-weibliche Interaktionen markiert waren), gefolgt von einer dritten Variationserfahrung Valenz, Zurückhaltungsstress als ein weiteres aversives und gesüßte Kondensmilch als das andere appetitliche Erlebnis, das durch die endogene cFos-Expression erfasst wurde. Unsere Gruppen waren wie folgt: Aversiv-appetitiv-zurückhaltender Stress (GRUPPE 1), Aversiv-aversiv-zurückhaltender Stress (GRUPPE 2), Appetitiv-aversiv-gesüßte Kondensmilch (GRUPPE 3) und Appetitiv-appetitiv-zurückhaltende Kondensmilch (GRUPPE 4). ), wie in Abb. 1f dargestellt. In jeder Gruppe haben wir die zelluläre Co-Lokalisierung von TdTomato, EYFP und cFos gemessen, um abzuleiten, welche Zellen bei einer oder mehreren der drei Erfahrungen aktiv waren (Abb. 1g). Alle Mäuse wiesen bei allen drei Markierungsansätzen unabhängig von der Markierungsmethode oder der Valenz einen ähnlichen Anteil markierter Zellen auf (Abb. 1h und ergänzende Abb. 3).

Histologische Analysen ergaben, dass es signifikant höhere Raten von Zellen gab, die eine Co-Lokalisierung von TdTomato und EYFP zeigten, wenn sie mit den gleichen Erfahrungen (d. h. appetitlich und appetitlich) markiert wurden, und niedrigere Co-Lokalisierungsraten, wenn unterschiedlich valente Erfahrungen (d. h. appetitlich und aversiv) markiert wurden Abb. 1i. Darüber hinaus beobachteten wir eine signifikante Kolokalisierung zwischen TdTomato, EYFP und cFos, wenn Mäuse drei aversiven oder drei appetitanregenden Erfahrungen ausgesetzt waren (Abb. 1l), dh GRUPPE 2 bzw. GRUPPE 4. Appetitiv markierte Zellen wurden bevorzugt reaktiviert, wenn Mäuse gesüßter Kondensmilch ausgesetzt wurden, und aversiv markierte Zellen wurden bevorzugt reaktiviert, wenn Mäuse Zwangsstress ausgesetzt wurden (Abb. 1j, k). Zusammengenommen ergeben diese Ergebnisse die faszinierende Möglichkeit, dass vCA1 emotional relevante Informationen an zwei teilweise nicht überlappende Zellsätze weiterleitet.

Für die Zukunft wählten wir zwei Valenz-Engramme, Schock und männlich-weibliche Exposition, als Stellvertreter, um besser zu verstehen, wie der vHPC diese aversiven und appetitanregenden Erfahrungen verarbeitet. Daher verwendeten wir dieselben Dual-Tagging-Strategien, um die grundlegenden physiologischen Eigenschaften von vHPC-Zellen zu charakterisieren (ergänzende Abbildung 4). TRAP2-Mäusen wurden die gleichen aktivitätsabhängigen Viren gleichzeitig injiziert und sie wurden auf die gleiche Weise wie zuvor erwähnt markiert (ergänzende Abbildungen 4a, b). Interessanterweise konnten wir keine Unterschiede in der Auslösefrequenz, der Charakterisierung über der Schwelle, der Anpassungsrate, der Eingaberate oder den Spitzenraten beobachten (ergänzende Abbildung 4c – l), was darauf hindeutet, dass trotz der Rekrutierung teilweise nicht überlappender Zellsätze für appetitliche und aversive Erfahrungen Diese markierten Zellen selbst weisen ähnliche physiologische Eigenschaften auf.

Trotz dieser physiologischen Ähnlichkeiten wurde gezeigt, dass vHPC-Zellen auf eine Vielzahl verschiedener Gehirnregionen projizieren, die an Stress- und Annäherungsvermeidungsverhalten beteiligt sind, und so multiregionale Netzwerke bilden, die Emotionen und Gedächtnis umfassen1. Wir vermuteten, dass es innerhalb dieser Netzwerke eine strukturelle Heterogenität gibt, die teilweise dadurch definiert wird, ob eine Erfahrung appetitiv oder avers valenziert ist, wie dies in Bereichen wie der Amygdala10,24,25, dem Nucleus accumbens26 und dem medialen präfrontalen Kortex27 beobachtet wurde. Mithilfe unserer Dual-Tagging-Strategie verfolgten wir als Nächstes vHPC-Ausgaben, die durch Appetit- und Schockerlebnisse getaggt waren, innerhalb des Subjekts und maßen die axonalen Fluoreszenzintensitäten in den folgenden Zielbereichen angesichts ihrer entscheidenden Rolle bei der emotionalen Verarbeitung: BLA, NAc, PFC, dorsal Hypothalamus, Fornix und Gyrus dentatus (Abb. 2a, b). Interessanterweise beobachteten wir sowohl rote als auch grüne Fluoreszenzsignale zwischen appetitiv und aversiv markierten vCA1-Terminals im medialen BLA (AP −1,8) und im PFC (einschließlich IL und PL) und fanden gleichzeitig Hinweise auf eine strukturelle Segregation in den folgenden Regionen: wir beobachteten überwiegend stärkere EYFP-Projektionen (Appetitivität), gemessen durch Fluoreszenzintensitäten, auf den hinteren Teil der basomedialen Amygdala (BMP), den vorderen Teil der vorderen Kommissur (ACA), den Fornix, den dorsalen medialen Hypothalamuskern (DMD und DMV) und die untere Schicht von der Gyrus dentatus (Abb. 2c–o). Darüber hinaus fanden wir überwiegend stärkere (aversive) TdTomato-Projektionen auf die vordere BLA, die hintere BLA, den NAc-Kern und die obere Schicht des DG (Abb. 2c – o). Frühere Studien haben gezeigt, dass Neuronen in Regionen wie PFC27, NAc26 und BLA10.25 Erfahrungen gemeinsam auf eine Weise verarbeiten, die anatomisch getrennt oder heterogen sein kann. Wir gehen davon aus, dass appetitiv und aversiv markierte vHPC-Terminals in ein größeres Netzwerk emotionaler Gedächtnisverarbeitung eingebettet sind, das teilweise sowohl durch einzigartige anatomische Muster als auch durch die aktivitätsabhängige Rekrutierung von Ensembles definiert werden kann, die an der Verarbeitung einer bestimmten Valenz beteiligt sind.

a Fos-CreERT2-Mäusen wurde ein viraler Cocktail aus AAV9-c-Fos-tTA und AAV9-TRE-EYFP im Verhältnis 1:1 gemischt mit AAV-Flex-DIO-TdTomato in den vHPC injiziert, um eine doppelte Speichermarkierung zu ermöglichen. b Experimenteller Zeitplan für das Tagging; EYFP steht für aversiv und TdTomato für appetitlich. c, d Repräsentative Bilder von Endprojektionen; vorderer, medialer und hinterer BLA, dorsaler Hippocampus, präfrontaler Kortex, Nucleus accumbens, dorsaler medialer Hypothalamuskern und Fornix. Beliebige Einheiten für EYFP (appetitiv) und TdTom (aversiv) (N = 3) für e, anteriores BLA (ungepaarter Schüler-T-Test t = 7,279, df = 4, p = 0,00019), f mediales BLA (t = 1,271, df = 4; p = 0,2725), g, hintere BLA (t = 14,95, df = 4; p = 0,0001), h, BMP (t = 6,168, df = 4; p = 0,0035), i, PFC (einschließlich IL und PL) (t = 1,078, df = 4; p = 0,3419), j, ACA (t = 50,68, df = 4; P < 0,0001), k, NAc Core (t = 3,018, df = 4; p = 0,0392 ), l, Fornix (t = 5,718, df = 4; p = 0,0046), m, Hypothalamus t = 13,96, df = 4; p = 0,0002, n, obere Schicht von DG (t = 54,94, df = 4; p < 0,0001), o, untere Schicht von DG (t = 11,73, df = 4; p = 0,0003). ns = p > 0,05. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar. Die Maßstabsbalken sind alle 100 μm groß.

Jüngste Studien haben einzigartige molekulare Profile von vCA1-Zellen identifiziert, die unterschiedliche Projektionsziele enthalten. Diese vCA1-Projektionen übertragen Informationen an mehrere Bereiche, die an Emotionen und Gedächtnis beteiligt sind, und bilden ein Netzwerk, das nach einzigartigen Architekturmerkmalen organisiert werden kann, einschließlich vCA1-Zelleneingängen, -ausgängen und Transkriptionssignaturen1. Wir wollten die Frage stellen, ob Zellpopulationen als Ganzes, für appetitive oder aversive Engramme, aufgrund der Erfahrung deutliche genetische Unterschiede aufweisen. Dementsprechend untersuchten wir als nächstes, ob die molekulare Zusammensetzung von vHPC-Zellen unterschiedliche genetische Profile enthielt oder nicht. Um die molekulare Landschaft von vHPC-Zellen aktivitätsabhängig zu katalogisieren, haben wir eine appetitive Erfahrung (d. h. Interaktionen zwischen Mann und Frau), eine aversive Erfahrung (d. h. mehrere Schocks) oder eine neutrale Erfahrung (d. h. Exposition gegenüber dem gleichen Konditionierungskäfig ohne) markiert ein appetitanregender oder aversiver Reiz; siehe Methoden; Abb. 3a). Anschließend führten wir eine RNA-Seq-Analyse unter Verwendung markierter Kerne (EYFP +) durch, die durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) isoliert wurden. Dabei wurden ~0,6 % markierte Kerne aus der appetitiven und aversiven Gruppe nachgewiesen, während neutral rekrutierte durchschnittlich 0,35 % EYFP + -Kerne ( Abb. 3b, c). Die appetitanregenden und aversiven Gruppen rekrutierten deutlich mehr EYFP + -Kerne als die neutrale Erfahrungsgruppe (Abb. 3c). Beim Vergleich aversiver und appetitanregender vCA1-Zellen mit der neutralen Gruppe identifizierten wir 474 differentiell exprimierte Gene (DEGs) in aversiven vCA1-Zellen (Abb. 3d, f), darunter 340 herunterregulierte Gene und 134 hochregulierte Gene (Abb. 3g). Wir identifizierten außerdem 1.104 DEGs in appetitanregenden vCA1-Zellen im Vergleich zur neutralen Gruppe (Abb. 3e, f), darunter 1.025 herunterregulierte Gene und 79 hochregulierte Gene (Abb. 3g). Es gab 842 einzigartige DEGs in appetitiven Engrammzellen und 212 einzigartige DEGs in aversiven Engrammzellen (Abb. 3f), was auf unterschiedliche Transkriptionslandschaften in diesen beiden Populationen schließen lässt.

ein experimentelles Schema zur Markierung, Isolierung und Analyse der beiden durch EYFP markierten Gruppen von vCA1-Zellen bei aversiver Stimulation (elektrischer Schock) oder appetitanregender Stimulation (männliche Mäuse in sozialer Interaktion mit weiblichen Mäusen) oder neutraler Konditionierung im selben Käfig ohne aversive oder appetitanregende Anregung. b FACS-Isolierung von EYFP-appetitiven Kernen aus den Hippocampi von Mäusen, die mit AAV9-cFos-tTA + AAV9-TRE-ChR2-EYFP-Virus markiert sind, aus ihren jeweiligen Gruppen c, Prozentsatz der EYFP-appetitiven Kerne aus jeder Gruppe (N = 3 pro Gruppe). /Zeitpunkt, gewöhnliche einfaktorielle ANOVA, Mehrfachvergleiche ***P = 0,001, ****P < 0,0001, ns = Nicht signifikant, p > 0,05). d Ein Vulkandiagramm mit der relativen Faltungsänderung der Genexpression im Log-2-Verhältnis und dem FDR-angepassten p-Wert im Log-2-Verhältnis als X- und Y-Achse, das die hoch- und herunterregulierten Gene in aversiven vCA1-Zellen im Vergleich zur neutralen Gruppe zeigt. Hoch- oder herunterregulierte Gene mit einem FDR-angepassten p-Wert von weniger als 1e-5 plus mindestens vierfachen Unterschieden wurden entweder rot bzw. blau hervorgehoben. Die Gennamen wurden für die 20 wichtigsten Gene angezeigt, sortiert nach Wald-Statistik. e Ein Vulkandiagramm, das die hoch- und herunterregulierten Gene in appetitanregenden vCA1-Zellen im Vergleich zur neutralen Gruppe zeigt. f Ein Venn-Diagramm, das die 1104 differentiell exprimierten Gene (DEGs) in appetitiven und 474 DEGs in aversiven vCA1-Zellen zeigt. In beiden Gruppen wurden 262 DEGs identifiziert. g Ein UpSet-Diagramm, das 226 herunterregulierte Gene sowohl in aversiven als auch appetitanregenden vCA1-Zellen und 35 hochregulierte Gene sowohl in aversiven als auch appetitanregenden vCA1-Zellen zeigt. Nur ein Gen (Nufip1) war im appetitiven Engramm hochreguliert, im aversiven Engramm jedoch herunterreguliert. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar.

Darüber hinaus zeigten die 20 am häufigsten herunterregulierten DEGs, die für aversive und appetitive vCA1-Zellen identifiziert wurden, keine Überlappung miteinander, und 14 der 20 am häufigsten hochregulierten DEGs für aversive und appetitliche vCA1-Zellen überlappten sich nicht (Abb. 3d, e, Ergänzungstabellen). 1 und 2), die die unterschiedlichen Transkriptome in diesen Neuronen unterstützen. Interessanterweise identifizierten wir unter den 262 gemeinsamen DEGs ein Gen Nufip1 (Nuclear Fragile X Mental Retardation Protein Interacting Protein 1), das in appetitanregenden vCA1-Zellen hochreguliert und in aversiven vCA1-Zellen herunterreguliert war (Abb. 3g). Dieses Gen kodiert für ein nukleäres RNA-Bindungsprotein, das ein C2H2-Zinkfingermotiv und ein nukleares Lokalisierungssignal enthält28. Zu den mit NUFIP1-Mutationen verbundenen Krankheiten gehört das Peho-Syndrom (progressive Enzephalopathie mit Ödemen, Hypsarrhythmie und Optikusatrophie), eine autosomal-rezessive und dominante, fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die in den ersten Wochen oder Monaten des Lebens beginnt. Sein interagierendes Protein FMRP1 ist essentiell für die Proteinsynthese in der Synapse29 und die CGG-Trinukleotid-Expansionsmutation des FMR1-Gens, das FMRP1 kodiert, verursacht das Fragile-X-Syndrom, die häufigste geistige Behinderung bei Männern30. Weitere Untersuchungen der funktionellen Bedeutung von NUFIP1 und anderen DEGs könnten mechanistische Einblicke in die transkriptomische Plastizität liefern, die durch die Valenzen des Gedächtnisses entsteht.

Um tiefere Einblicke in die molekularen Signaturen von Transkriptomen zu erhalten, die mit aversiven und appetitanregenden vCA1-Zellen assoziiert sind, führten wir eine Genontologieanalyse (GO) der hoch- und herunterregulierten Signalwege in aversiven und appetitanregenden vCA1-Zellen durch (Abb. 4a – d). Wir fanden heraus, dass der am häufigsten hochregulierte Signalweg in aversiven vCA1-Zellen Neurotransmitterkomplexe wie die ionotrope Glutamatrezeptoraktivität umfasst (Abb. 4a). Dieser Befund steht im Einklang mit früheren Studien unter Verwendung von Gehirngeweben, die 3.759 unterschiedlich methylierte DNA-Regionen im Hippocampus identifizierten, die mit 1.206 Genen assoziiert sind, die nach kontextueller Angstkonditionierung in den Kategorien der ionengesteuerten Kanalaktivität angereichert waren29,31,32. Interessanterweise fanden wir heraus, dass der am häufigsten herunterregulierte Signalweg in aversiven vCA1-Zellen die Reparatur von DNA-Fehlpaarungen beinhaltet (Abb. 4b). Obwohl die am häufigsten hochregulierten Signalwege in appetitiven vCA1-Zellen auch die Aktivität des ionotropen Glutamatrezeptors umfassen (Abb. 4c), reichern sich die am häufigsten herunterregulierten Signalwege in appetitanregenden vCA1-Zellen an der Axonem-Assemblierung und Mikrotubuli-Bündelbildung an (Abb. 4d) und unterscheiden sich von den in appetitanregendem vCA1 herunterregulierten Signalwegen Zellen (Abb. 4b). Als nächstes verglichen wir die RNA-seq-Daten zwischen aversiven und appetitanregenden vCA1-Zellen direkt. Wir identifizierten 494 DEGs, darunter 47 hochregulierte Gene und 447 herunterregulierte Gene (Ergänzungsabbildung 5a und Ergänzungstabelle 3). Darüber hinaus stellten wir fest, dass fünf Signalwege in appetitanregenden vCA1-Zellen wie dem nuklearen Exosom-RNAse-Komplex hochreguliert waren und 16 Signalwege im appetitanregenden Engramm im Vergleich zu aversiven vCA1-Zellen wie der Axonem-Assemblierung (Ergänzung zu Abb. 5b, c) herunterreguliert waren. Diese unterschiedlich veränderten Signalwege zwischen aversiven und appetitiven vCA1-Zellen, die sich aus mehreren Vergleichen ergaben, stützen unsere Schlussfolgerung, dass diese Neuronen tatsächlich transkriptionell unterschiedliche Subpopulationen darstellen. Eine zukünftige Richtung besteht darin, die Funktionen dieser DEGs und veränderten Signalwege zu untersuchen. Als Proof-of-Concept haben wir GeneMANIA33 angewendet, um die Funktionen der Top-20-DEGs in Abb. 4e – h vorherzusagen. Beispielsweise ist der gehirnspezifische Angiogeneseinhibitor 2 (BAI2) eindeutig für die DEGs identifiziert, die in aversiven vCA1-Zellen hochreguliert sind (Abb. 4e), und der ionotrope Glutamatrezeptor ist nur für die DEGs verantwortlich, die in appetitanregenden vCA1-Zellen hochreguliert sind (Abb. 4g). ). In ähnlicher Weise ist die WNT-Signalwegkomponente Disheveled eindeutig für die in aversiven vCA1-Zellen herunterregulierten DEGs identifiziert (Abb. 4f), und der TRPV1-4-Kanal ist nur für die in appetitiven vCA1-Zellen hochregulierten DEGs beteiligt (Abb. 4h). Die Untersuchung der Verlust- und Gewinnfunktion dieser vorhergesagten Gene wird mechanistische Einblicke in die molekularen Signaturen von Engrammneuronen mit unterschiedlichen Gedächtnisvalenzen liefern.

eine Gene Enrichment Set-Analyse der hochregulierten Signalwege in aversiven Engrammen mithilfe des Gene Ontology (GO)-Moduls. Die Größe des Punkts stellt die Genzahl dar und die Farbe des Punkts gibt den FDR an. Der Pfad mit einem FDR-bereinigten P-Wert von weniger als 0,25 gilt als signifikant angereichert. b GO-Analyse herunterregulierter Signalwege in aversiven vCA1-Zellen. cGO-Analyse hochregulierter Signalwege in appetitanregenden vCA1-Zellen. d GO-Analyse herunterregulierter Signalwege in appetitanregenden vCA1-Zellen. GeneMANIA-Netzwerk der 20 am häufigsten hochregulierten und herunterregulierten Gene in aversiven bzw. appetitanregenden vCA1-Zellen. Gene mit roten Knoten sind in den aversiven vCA1-Zellen im Vergleich zur neutralen Probe hochreguliert e oder herunterreguliert f, und Gene mit grünen Knoten sind in den appetitanregenden vCA1-Zellen im Vergleich zur neutralen Probe hochreguliert (g) oder herunterreguliert (h). Die grauen Knoten stellen die Gene dar, die mit diesen 20 unterschiedlich exprimierten Genen interagieren. Die von InterPro-Domänendatenbanken in jedem Netzwerk unterstützten gemeinsamen Proteindomänen wurden für aversive vCA1-Zellen rot und für appetitive vCA1-Zellen grün markiert. Die detaillierte Beschreibung für jede gemeinsame Proteindomäne ist in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt. Die Kategorien des Interaktionsnetzwerks zwischen diesen Genen sind in der Legende neben Feld g angegeben.

Neben den oben beschriebenen unterschiedlichen transkriptomischen Profilen in Engrammneuronen zeigen neuere Studien die transkriptionelle Rolle der epigenetischen Regulation im Engramm34. Um zu untersuchen, ob die dynamische epigenomische Landschaft auch zur Spezifität von Engrammneuronen mit unterschiedlichen Valenzen beiträgt, führten wir eine Bisulfitsequenzierung mit reduzierter Darstellung (RRBS) durch, um die DNA-Methylierungslandschaften in aversiven und appetitanregenden vCA1-Zellen zu charakterisieren. Wie in Abb. 5a, b gezeigt, identifizierten wir 1939 differentiell methylierte Cytosine (DMCs) mit einer Änderung der DNA-Methylierung von mehr als 20 % und einem p-Wert kleiner als 0,05 in aversiven vCA1-Zellen im Vergleich zur neutralen Gruppe und 3117 DMCs in appetitanregenden vCA1 Zellen. Diese DMCs befinden sich an verschiedenen Positionen des Genoms, einschließlich 5'UTR, Promotor, Exon, Intron, 3'UTR, Transkriptionsterminationsstellen (TTS), intergenen, nichtkodierenden Regionen, was auf unterschiedliche funktionelle Ergebnisse auf Transkriptionsebene schließen lässt. Interessanterweise unterscheiden sich die genomischen Verteilungen dieser DMCs in aversiven vCA1-Zellen geringfügig von denen in appetitiven vCA1 (Ergänzungstabelle 5). Basierend auf diesen DMCs haben wir differentiell methylierte Regionen (DMRs) identifiziert, die mindestens zwei DMCs für jeden DMR enthalten (Abb. 5c, d). Mithilfe dieser DMRs können wir die differentiell methylierten Gene (DMGs) identifizieren, die diese DMRs entweder enthalten oder ihnen nahe kommen. Die Top-20-DMGs mit einer Änderung des Methylierungsgrads von mehr als 20 % und einem p-Wert von weniger als 0,05 zeigen keine Überlappung zwischen aversiven und appetitanregenden vCA1-Zellen, was darauf hindeutet, dass unterschiedliche Gedächtnisvalenzen unterschiedliche Änderungen der DNA-Methylierungen auslösen. Unter den 266 DMGs in appetitanregenden vCA1-Zellen und den 98 DMGs in aversiven vCA1-Zellen werden nur 32 DMGs gemeinsam genutzt (Abb. 5e, Ergänzende Daten 1), was die unterschiedliche DNA-Methylierungslandschaft zwischen diesen beiden Populationen von Engrammzellen bestätigt. Zuletzt führten wir eine Gen-Ontologie-Analyse (GO) von DMGs in aversiven und appetitanregenden vCA1-Zellen durch (Abb. 5f, g). Wir fanden heraus, dass die Signalwege in aversiven vCA1-Zellen hauptsächlich an der Struktur und Funktion synaptischer Verbindungen angereichert sind (Abb. 5f). Allerdings sind die angereicherten Signalwege in appetitanregenden vCA1-Zellen viel vielfältiger, einschließlich Axonwachstum, synaptische Verbindung, Ionenkanäle und RNA-Polymerase-II-Transkriptionsregulatorkomplex (Abb. 5g). Diese unterschiedlich angereicherten Signalwege zwischen aversiven und appetitanregenden vCA1-Zellen deuten auf möglicherweise unterschiedliche funktionelle Ergebnisse hin, die durch DNA-Methylierung auf Transkriptionsebene verursacht werden, um die Spezifität von Gedächtnisvalenzen zu verleihen. Eine interessante zukünftige Richtung besteht darin, die Aufrechterhaltung und Funktion dieser DNA-Methylierungsänderungen während der Konsolidierung und des Abrufs des Gedächtnisses zu untersuchen. Insgesamt sind unsere Ergebnisse in Abb. 3, 4 und 5 zeigten, dass sich die unterschiedlichen molekularen Signaturen aversiver und appetitanregender vCA1-Zellen auf transkriptomischer und epigenomischer Ebene widerspiegeln und wahrscheinlich zu den unterschiedlichen Wertigkeiten des Gedächtnisses beitragen.

Vulkandiagramme, die die differentiell methylierten Cytosine (DMC) mit einer Änderung der DNA-Methylierung von mehr als 20 % und einem p-Wert von weniger als 0,05 in aversiven a- oder appetitiven b-vCA1-Zellen im Vergleich zur neutralen Gruppe zeigen. DMCs in verschiedenen Genompositionen (3'UTR, 5'UTR, Exon, intergenisch, Intron, nicht-kodierender Promotor, TSS) sind farblich gekennzeichnet. Vulkandiagramm, das unterschiedlich methylierte Regionen (DMRs) zeigt, die mindestens zwei DMCs für jeden DMR in aversiven c- und appetitiven d-vCA1-Zellen enthalten. Die zehn am häufigsten hypermethylierten und hypomethylierten Regionen wurden separat entweder rosa oder blau hervorgehoben und mit den nächstgelegenen Genen versehen. e Ein Venn-Diagramm, das unterschiedlich methylierte Gene (DMGs) zeigt, die mit DMRs in c und d assoziiert sind, die in aversiven und appetitanregenden vCA1-Zellen identifiziert wurden. f, GO-Analyse von DMGs in aversiven vCA1-Zellen. g GO-Analyse von DMGs in appetitanregenden vCA1-Zellen.

Es ist bekannt, dass vCA1 monosynaptische Projektionen auf BLA, NAc und mPFC35 aufweist. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Gehirnregionen für die Modulation sowohl appetitlicher als auch aversiver Erfahrungen wichtig sind, insbesondere im NAc26,36 und im BLA24,37, in denen für jedes Verhalten molekular und topographisch unterschiedliche Zellpopulationen identifiziert wurden. Daher haben wir die kausale Rolle markierter vHPC-Zellkörper und ihrer ausgewählten Terminals beim Fahrverhalten getestet, indem wir zunächst einen Viruscocktail aus AAV9-cFos-tTA und AAV9-TRE-ChR2-EYFP oder AAV9-TRE-EYFP in vCA1 infundiert haben. Anschließend implantierten wir bilateral eine optische Faser entweder über dem vCA1 oder seinen Anschlüssen vCA1–BLA, vCA1–NAc, vCA1–PFC (Abb. 6a). Wir fanden zunächst heraus, dass alle Terminals in der Lage waren, ihre entsprechenden Downstream-Ziele zu aktivieren, indem wir den Anstieg der cFos-Spiegel nach der Stimulation beurteilten (ergänzende Abbildung 6). Nach 10 Tagen Erholung wurde eine separate Gruppe von Mäusen von DOX befreit und mit aversiven (z. B. Schock) oder appetitlichen (z. B. Interaktionen zwischen Männern und Frauen) Erfahrungen markiert. Wie in Abb. 6b dargestellt, wurden die aversiv markierten Mäuse für die erste Versuchsreihe am ersten Tag in eine Echtzeit-Ortspräferenz-/Vermeidungskammer (RTPP/A) gelegt, um die Ausgangswerte zu bestimmen. Am dritten Tag wurden die Tiere wieder in die PTPP/A-Kammer gebracht; Diesmal erhielten sie beidseitig eine optische Stimulation bei 20 Hz auf der einen Seite und keine Stimulation auf der anderen Seite. Wir fanden heraus, dass die optische Stimulation der vCA1-BLA- oder vCA1-NAc-Terminals zu einer Abneigung führte (Abb. 6e, f), wohingegen die EYFP-Kontrollen, die Stimulation des vCA1-Zellkörpers und die vCA1-PFC-Terminals statistisch nicht von den Ausgangswerten abwichen (Abb. 6c). , d, g). Am fünften Tag des Experiments wurden die Mäuse, wie bereits berichtet13, einem Induktionsprotokoll unterzogen, um die Fähigkeit des Engramms zu testen, das von ihm gesteuerte Verhalten zu ändern. Die aversiv markierten männlichen Mäuse wurden für 10 Minuten mit einer weiblichen Maus in eine neue Kammer gebracht und erhielten während der gesamten Expositionsdauer eine optische Stimulation. Anschließend wurden die Tiere wieder in ihre Kammern gebracht und am 7. Tag auf Verhaltensänderungen untersucht. In diesem Test nach der Induktion beobachteten wir, dass die optische Stimulation der vCA1-BLA-Terminals nun ausreichte, um die Präferenz trotz der Antriebsaversion in der Vorinduktion zu steigern Testen Sie früher (Abb. 6e). Das Induktionsprotokoll ergab auch, dass vCA1-NAc-Terminals, die zuvor ausreichten, um die Abneigung auszulösen, nun ihre Fähigkeit zur Verhaltensmodulation umgekehrt oder zurückgesetzt hatten und auf das Ausgangsniveau zurückgekehrt waren (Abb. 6g). Schließlich sahen wir keine Veränderungen bei den EYFP-Kontrollen, dem vCA1-Zellkörper oder der vCA1-PFC-Stimulation (Abb. 6c, d, g).

Mäusen wurde ein Viruscocktail aus AAV9-c-Fos-tTA AAV9-TRE-ChR2-EYFP oder AAV9-TRE-EYFP in vCA1 injiziert und optische Fasern wurden bilateral über die Zellkörper von vCA1 oder die Enden von vCA1 bis zum BLA gelegt , Nacc oder PFC, in separaten Gruppen. Den Mäusen wurde dann entweder ein aversives oder appetitanregendes Erlebnis zugeordnet und sie wurden in Echtzeit einer Opto-Ort-Vermeidung und -Präferenz unterzogen. a Repräsentative Bilder von ChR2-EYFP, das Zellkörper in vCA1 und seinen jeweiligen Terminals in BLA, NAcc und PFC markiert. b Angst-zu-Belohnungs-Protokoll, bei dem die Probanden eine Stimulation des vCA1-Zellkörpers oder vCA1-Projektionen auf die BLA-, NAcc- oder PFC-Terminals erhielten. c–g Prozentuale Präferenz für die Stimulationsseite zu Studienbeginn, vor und nach der Induktion (n = 7 Probanden für EYFP-Kontrollen, n = 8 Probanden für vCA1, n = 8 Probanden für BLA, n = 7 für NAcc und n = 7 für PFC, **P = 0,0018, ***P = 0,0006, einfaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. h Belohnung-zu-Angst-Protokoll, bei dem die Probanden eine Stimulation von BLA-, NAcc- oder PFC-Terminals erhielten, die von vCA1 stammten. i–m, Prozentuale Präferenz für die Stimulationsseite zu Studienbeginn, vor und nach der Induktion (n = 7 für EYFP, n = 9 für vCA1, n = 8 für BLA, n = 7 für NAcc und n = 7 für PFC, ns = p > 0,05, **P = 0,0032, ****P < 0,0001, einfaktorielle ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Tukeys Mehrfachvergleichstest. Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± SEM dar.

Als nächstes fragten wir, ob appetitiv markierte vCA1-Terminals für BLA, NAc oder PFC ausreichen, um das Verhalten zu modulieren (Abb. 6h). Ähnlich wie bei den obigen Ergebnissen reichte die optische Stimulation der Terminals vCA1-BLA (Abb. 6k) und vCA1-NAc (Abb. 6l), jedoch nicht in einer der anderen Gruppen (Abb. 6i, j, m), zum Fahren aus Ortspräferenz. Während der Induktionsphase des Experiments setzten wir die Mäuse in eine Angstkonditionierungskammer, wo sie mehrere Fußschocks und gleichzeitige optische Stimulation der mit Appetit markierten Terminals erhielten. In diesem Experiment wurde untersucht, ob diese vCA1-Terminals in der Lage sind, ihre Kapazität zu ändern oder zurückzusetzen, um die Präferenz auf eine Weise zu steuern, die den obigen Experimenten entspricht. Tatsächlich stellten wir fest, dass die vCA1-BLA-Gruppe in den Post-Induktionstests von der Fahrpräferenz zur Abneigung wechselt (Abb. 6k), während die vCA1-NAc-Gruppe von der Fahrpräferenz wieder auf das Ausgangsniveau zurückkehrt (Abb. 6l). Darüber hinaus haben wir diesen Effekt bei neutral markierten Tieren nicht beobachtet (ergänzende Abbildung 7) und auch keine statistisch signifikanten Verhaltensänderungen für die RTPP/A-Aufgabe bei den EYFP-Kontrollen, der vCA1-Zellkörperstimulationsgruppe oder der vCA1-PFC festgestellt Stimulationsgruppe (Abb. 6i, j, m). Wichtig ist, dass wir getestet haben, ob optische Stimulation zu einer Verbesserung des motorischen Verhaltens führen kann. Wir fanden keinen signifikanten Unterschied in der zurückgelegten Distanz zwischen allen Gruppen während Licht-Ein- oder Aus-Epochen auf offenem Feld (ergänzende Abbildung 8). Darüber hinaus ließ der Mangel an Präferenz oder Vermeidung, der bei der Stimulation des vCA1-Zellkörpers beobachtet wurde, die Möglichkeit aufkommen, dass die Rolle von vCA1 beim Fahrverhalten auf terminalspezifische Weise bestimmt wird35; Eine Vorstellung, die mit neueren Studien übereinstimmt, die darauf hindeuten, dass Berechnungen entlang der Axone eines bestimmten Zellkörpers das Verhalten entsprechend dem nachgeschalteten Ziel unterschiedlich steuern können8. Zusammengenommen legen diese Ergebnisse nahe, dass vHPC-Zellkörper ihre verhaltensrelevanten und valenzspezifischen Inhalte an ihre nachgeschalteten Ziele weiterleiten, obwohl sie teilweise nicht überlappende molekulare und neuronale Signaturen und unterschiedliche Projektionsmuster teilen. Dies wird durch Beweise bestätigt, die zeigen, dass axonale vHPC-Ausgänge bevorzugt unabhängige Merkmale eines bestimmten Verhaltens weiterleiten7.

Hier haben wir gezeigt, dass der vHPC appetitliche und aversive Erfahrungen in definierten Zellpopulationen verarbeitet, die sich auf molekularer, zellulärer und projektionsspezifischer Ebene teilweise unterscheiden. Wir haben auch ihre Fähigkeit demonstriert, Verhaltensweisen durch funktionell plastische, projektionsspezifische Terminals zu steuern. Unsere immunhistochemischen Daten legen nahe, dass vCA1 mindestens drei Populationen von Neuronen enthält: zwei Untergruppen, die anhand ihrer anterior-posterioren Lage und ihrer bevorzugten Reaktion auf appetitive oder aversive Valenzen abgegrenzt werden können, und eine dritte Population, die auf beide reagiert, was möglicherweise eine biologische Vorliebe widerspiegelt für Salienz5. Während ihre genauen strukturellen und funktionellen Ergebnisse im gesamten Gehirn noch unbestimmt sind, spekulieren wir, dass unsere beobachtete Population von vCA1-Zellen, die auf Abneigung reagieren, eine Obermenge kürzlich beobachteter Angstzellen ist, die Informationen an den Hypothalamus25 und PFC38 weiterleiten. Darüber hinaus leiten vCA1-Zellen, die aversive oder appetitliche Prozesse verarbeiten, möglicherweise Informationen an BLA und NAc weiter und innervieren diese an unterschiedlichen anatomischen, Rezeptor- und Zelltypen, wodurch insbesondere ihre Fähigkeit optimiert wird, mnemonische Informationen zu integrieren25.

Darüber hinaus ermöglicht unser Design durch die Kombination transgener aktivitätsabhängiger Markierungsstrategien mit der Expression von Fluorophoren auf Virusbasis die Visualisierung mehrerer Ensembles innerhalb des Subjekts, was mit früheren Studien zur Überwachung und Manipulation eines einzelnen Ensembles, das an zwei diskreten Stellen aktiv ist, übereinstimmt auch Zeitpunkte26. Durch die Verknüpfung dieser Ansätze mit genetischen Sequenzierungsstrategien ermöglichen diese Werkzeuge die Markierung, Manipulation und molekulare Dokumentation von Zellen, die aversives und appetitliches Verhalten verarbeiten, und eröffnen die Möglichkeit, topografische Ähnlichkeiten und Unterschiede zwischen beiden gehirnweit zu katalogisieren. Zukünftige Studien könnten beispielsweise die molekulare Zusammensetzung appetitiv und aversiv markierter vCA1-Zellen entlang ihrer anterior-posterioren Achse untersuchen und testen, ob sich die transkriptomischen Profile dieser Zellen sowohl hinsichtlich der Valenz als auch ihrer physischen Position unterscheiden. Darüber hinaus ist es faszinierend, dass mit Appetit- und Aversiv-Tags versehene vCA1-Terminals Hinweise auf eine Segregation innerhalb der Amygdala und des Hippocampus zeigten. Folglich könnte die nachfolgende Forschung darauf abzielen, ihre Beiträge zum Verhalten funktionell herauszuarbeiten und die Arten von Informationen zu messen, die sie durch eine Kombination aus bildgebenden und endgerätespezifischen Störungsansätzen übertragen.

Angesichts der Vielzahl genetischer Werkzeuge, die für den aktivitätsabhängigen Zugriff auf Zellen eingesetzt werden, ist es wichtig, die Interpretation von Engrammen einzuschränken. Beispielsweise variieren vCA1-Ensembles drastisch in der Größe und in den Aktivitätsmustern im Lern- und Gedächtnisbereich. Diese Zahlen reichen von einzelnen Prozentsätzen bis hin zu ~35 % der Zellen, abhängig vom verwendeten unmittelbaren frühen Genmarker, der Markierungsstrategie, der Nagetierlinie und den eingesetzten viralen Werkzeugen36,39,40,41. Passenderweise glauben wir, dass unsere Dual-Tagging-Strategie angesichts des Zeitrahmens, der für das Tagging erforderlich ist (z. B. 48 Stunden ohne Dox; 72 Stunden nach der 4OHT-Injektion42,43,44,45), die Anzahl der markierten Zellen teilweise überbewertet. und zukünftige Experimente könnten darauf abzielen, die zeitliche Auflösung moderner Tagging-Ansätze zu verbessern, um das Signal-Rausch-Verhältnis von erfahrungsbezogenem Tagging zu Hintergrund-Tagging oder Leakiness zu verbessern. Darüber hinaus spiegeln cFos+-Zellen nur eine Teilmenge eines Engramms wider, das ansonsten im gesamten Gehirn verteilt ist und zahlreiche unmittelbar frühe Gene, Zelltypen und komplementäre physiologische Aktivitäten rekrutiert, die aktivitätsabhängige Marker aufgrund der relativ langsamen Zeitskalen der Genexpression möglicherweise nicht erfassen können . Wir stellen in der Tat fest, dass cFos+-Zellen zwar eine kürzlich erfolgte neuronale Aktivität anzeigen, eine Zelle, die kürzlich aktiv war, jedoch nicht unbedingt cFos exprimieren muss, insbesondere in Gehirnregionen und Zelltypen, die vermutlich ihre eigenen Schwellenwerte für die cFos-Expression haben. Diese Punkte verdeutlichen die komplexe Natur eines Gedächtnis-Engramms und unterstreichen die Vorsicht, die angesichts der inhärenten technischen Einschränkungen bei der Interpretation von Daten geboten ist. Wir glauben, dass ein vielschichtiger Ansatz, der genetische Markierungsstrategien mit Echtzeitbildgebung bei komplexen Verhaltensweisen kombiniert, dazu beitragen wird, die Beziehung zwischen neuronaler Aktivität, genetischen Veränderungen und Veränderungen auf Systemebene als Reaktion auf Lernen und Gedächtnis zu entwirren.

Unsere Terminalmanipulationen stehen im Einklang mit jüngsten Studien, die eine terminalspezifische Weiterleitung von Informationen aus vCA1-Zellkörpern durch eine Vielzahl von Einzel-, Bi- und Trifurkationsprozessen belegen8,46,47. Unsere Daten liefern eine Funktionsgewinndemonstration dafür, dass aktivierte vCA1-Terminals Präferenzen oder Abneigungen hervorrufen können, was unserer Meinung nach durch die Stimulation des Zellkörpers verschleiert wurde, da letztere vermutlich den Zellkörper und die meisten, wenn nicht alle entsprechenden axonalen Ausgänge aktiviert. Ersteres würde selektiv eine Reihe von Terminals modulieren, die aus vCA1 hervorgehen und auf einen bestimmten Zielbereich projizieren, während vCA1-Terminals, die auf andere Zielbereiche projizieren, nur minimal beeinträchtigt werden. Obwohl die molekulare Grundlage, die unseren Valenzschalterexperimenten zugrunde liegt, noch unbekannt ist, gehen wir außerdem davon aus, dass die Plastizität des Transkriptoms dem Schalter die Fähigkeit verleihen könnte, welchen Aspekt des Verhaltens ein Terminal steuert, angesichts der schnellen und dauerhaften Reaktionen auf Lernen und Gedächtnis, die im Gen vorhanden sind Ebene in markierten Zellen34.

Tatsächlich ist die umfassende Transkriptionslandschaft im Maus-Hippocampus über die gesamte Lebensspanne der Gedächtnisbildung und -erinnerung dynamisch, und ihre erfahrungsabhängigen Veränderungen sind größtenteils spezifisch in markierten Zellen innerhalb von Minuten nach dem Lernen vorhanden und halten mehrere Wochen an47. Zukünftige Experimente könnten vor und nach dem Induktionsprotokoll eine RNA-Sequenzierung an Zellen durchführen, um die daraus resultierenden Transkriptionsänderungen zu messen und mutmaßliche Loci zu identifizieren, die eine solche funktionelle Plastizität vermitteln. Darüber hinaus verbessern unsere Sequenzierungsdaten unser Verständnis darüber, wie der ventrale Hippocampus sowohl appetitliche als auch aversive Engramme genetisch analysiert, wie diese Erfahrungen eine Veränderung der Hoch- und Herunterregulierung einzelner Gene bewirken können und wie diese Erfahrungen dauerhafte Auswirkungen auf das Gehirn haben können epigenetisches Genom durch die Methylierungsstudie (Abb. 4). Zukünftige Studien können beispielsweise auf neueren Arbeiten zur Bewertung der molekularen und projektionsdefinierten Konnektivität zwischen vCA1 und seinen nachgeschalteten Zielen mit MAPSeq1 aufbauen und gleichzeitig eine aktivitätsabhängige Komponente wie unseren Dual-Memory-Tagging-Ansatz hinzufügen, um die Organisationsprinzipien von vCA1 zu messen ventralen Hippocampus und seine Projektionen auf eine Weise, die die Geschichte einer Zelle berücksichtigt. Diese Studie bietet insbesondere eine einflussreiche Plattform zur Charakterisierung der Organisation des ventralen Hippocampus und seiner nichtzufälligen Input-Output-Muster. Wir gehen davon aus, dass diese Logik eine aktivitätsabhängig definierte Dimension umfasst, sodass appetitliche und aversive Erfahrungen einzigartige Input-Output-Hippocampus aktivieren auch die Schaltung.

Während die physiologische Grundlage, auf der Terminals ihre Fähigkeit zur Steuerung valenzspezifischer Verhaltensweisen umschalten oder zurücksetzen können, unklar bleibt, könnten zukünftige Studien mögliche Mechanismen in Betracht ziehen, darunter homöostatische Plastizität, dendritisches Wachstum und Zurückziehen sowie durch Gegenkonditionierung erleichterte Veränderungen entlang des Axons. Dendritenschnittstelle zwischen vCA1 und dem BLA oder NAc24,37. In Übereinstimmung mit dieser Spekulation haben frühere Studien gezeigt, dass der dorsale Hippocampus definierte Sätze funktionell plastischer Zellkörper enthält, die ausreichen, um aversives oder appetitliches Verhalten hervorzurufen, während der BLA feste Populationen enthält, die ausreichen, um jedes Verhalten abhängig von der stimulierten anatomischen Stelle voranzutreiben der anterior-posterioren Achse sowie an ihren projektionsspezifischen Stellen7,8,24,25,37. Nachfolgende Forschungen können darauf abzielen, mithilfe unseres Dual-Memory-Tagging-Ansatzes genetisch und physiologisch herauszufinden, welche Zelltypen und Schaltkreise ebenfalls solche fest verdrahteten oder erfahrungsabhängigen Reaktionen auf emotionale Erinnerungen zeigen. In unserer Studie spekulieren wir, dass vCA1-Zellen auf eine erfahrungsabhängige Weise appetitanregend oder aversiv werden, im Gegensatz dazu, dass sie für eine der beiden Valenzen per se fest verdrahtet sind, wie dies in vielen anderen Gehirnregionen (z. B. BLA24) beobachtet wurde. Es bleibt jedoch möglich, dass eine Untergruppe dieser vCA1-Zellen vorzugsweise darauf abgestimmt ist, eine bestimmte Valenz auf erfahrungsunabhängige Weise zu verarbeiten. Tatsächlich schließt die Vorstellung, dass die Erfahrung selbst diese Neuronen so verändert, dass sie appetitlich oder aversiv werden, nicht aus, dass nachfolgende Erfahrungen ihre Fähigkeit auf flexible Weise verändern, ein bestimmtes Verhalten, das mit einer bestimmten Valenz verbunden ist, anzutreiben.

Darüber hinaus wurden in unserer Studie zwar die Kriterien für die Valenz in Abb. 1 erfüllt (z. B. Hippocampuszellen reagierten unabhängig von den Reizmerkmalen unterschiedlich auf Reize mit positiver und negativer Valenz), unsere nachfolgenden Datensätze konzentrierten sich jedoch auf einen einzigen Appetit ( (z. B. soziale Interaktionen zwischen Männern und Frauen) und eine einzelne aversive Erfahrung (z. B. Fußschocks) für eine gründliche molekulare, anatomische und Verhaltensprofilierung. Wichtig ist, dass wir hier hervorheben, dass die Aufgabenstruktur konstant gehalten werden muss, um eine direkte Aussage über die Valenz zu machen. Eine alternative Interpretation unserer aktuellen Daten besteht beispielsweise darin, dass unsere beobachteten Unterschiede in den Genanreicherungsprofilen und der anatomischen Segregation auf die inhärenten Unterschiede in den verwendeten Aufgaben zurückzuführen sind (z. B. soziale Interaktionen zwischen Männern und Frauen vs. kontextuelle Angstkonditionierung) und nicht auf die Valenz an sich . Es bleibt daher möglich, dass soziale Interaktionen zwischen Männern und Frauen, die eine multimodale Integration sozialer und kontextueller Hinweise erfordern, im Vergleich zur kontextuellen Angstkonditionierung, in der ein konditionierter Hinweis (z. B. Kontext) enthalten ist, einen einzigartigen Satz von Genen und einer ventralen Hippocampus-Anatomie rekrutieren Es ist mit einem unkonditionierten Signal (z. B. Schock) verbunden und rekrutiert daher aufgabenspezifische molekulare und anatomische Aktivität. Daher schlagen wir vor, dass zukünftige Studien sich auf die Kennzeichnung von Erfahrungen konzentrieren könnten, bei denen die meisten, wenn nicht alle Umweltmerkmale konstant gehalten werden, mit Ausnahme der mit einem unimodalen Reiz selbst verbundenen Wertigkeit, die unserer Meinung nach eine experimentelle Plattform für die Untersuchung eröffnet, wie vielfältige Erfahrungen gemacht werden Ähnliche oder unterschiedliche Wertigkeiten greifen unterschiedlich in Zellpopulationen ein. Während wir glauben, dass dies teilweise auf die Verwendung mehrerer Erfahrungen mit ähnlicher Wertigkeit in Abb. 1 zurückzuführen ist, könnten weitere zukünftige Experimente einen In-vivo-Aufzeichnungsansatz implementieren, bei dem mutmaßlich negativ und positiv markierte Zellen abgebildet werden, während Aufgabenstruktur und Wertigkeit parametrisch variiert werden . Aufbauend auf dieser Vorstellung stellen unsere RNA-Seq- und DNA-Methylierungsdaten ein zusätzliches Mittel dar, mit dem Erinnerungen die Funktionen des Genoms in valenzabhängiger Weise verändern, sowohl im gesunden als auch im pathologischen Zustand. Unsere Methylierungsdaten identifizierten beispielsweise Pin148,49 unter 266 DMGs in den appetitanregenden vCA1-Zellen, das für seine neuroprotektiven Eigenschaften insbesondere bei Neurodegeneration durch die Regulierung der Ausbreitung von cis-p-Tau bekannt ist. Folgestudien könnten diese Appetit-Engramme nutzen, indem sie diese DMGs verändern, um psychiatrische und neurodegenerative Erkrankungen zu lindern.

Gemeinsam schlagen wir vor, dass der Hippocampus zusätzlich zur Verarbeitung räumlich-zeitlicher Informationseinheiten diskrete Sätze von Zellen enthält, die aversive und appetitliche Informationen verarbeiten und inhaltsspezifische und verhaltensrelevante Informationen auf molekular definierte und projektionsspezifische Weise an nachgelagerte Bereiche weiterleiten Dadurch wird insgesamt ein multisynaptisches biologisches Substrat für mehrere Gedächtnis-Engramme bereitgestellt.

FosCreER (Jax-Bestand: #021882) und männliche Wildtyp-C57BL/6-Mäuse (2–3 Monate alt; Charles River Labs) wurden in Gruppen von 5 Mäusen pro Käfig gehalten. Das Tier-Vivarium wurde in einem 12:12-Stunden-Lichtzyklus betrieben (Licht an um 07:00 Uhr). Mäuse erhielten vor der Operation mindestens 48 Stunden lang eine Diät mit 40 mg/kg Doxycyclin (Dox) und hatten Zugang zu Nahrung (Doxycyclin-Diät) und Wasser nach Belieben. Den Mäusen wurde nach der Operation mindestens zehn Tage Zeit gegeben, sich zu erholen. Die Dox-haltige Ernährung wurde 48 Stunden vor der Verhaltensmarkierung durch normales Mäusefutter (ad libitum) ersetzt, um ein Zeitfenster für die aktivitätsabhängige Markierung zu öffnen1,2. Alle Probanden wurden gemäß Protokoll 17-008 behandelt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee der Boston University genehmigt wurde. Alle Experimente entsprachen allen relevanten ethischen Vorschriften für Tierversuche und Forschung gemäß den AALAC- und IACUC-Standards.

Stereotaktische Injektionen und Glasfaserimplantate folgen zuvor beschriebenen Methoden1,2. Alle Operationen wurden unter stereotaktischer Anleitung durchgeführt und die nachfolgenden Koordinaten werden relativ zum Bregma (in mm) angegeben. Die dorsal-ventralen Injektionen wurden berechnet und relativ zum Schädel auf Null gesetzt. Die Mäuse wurden in einen stereotaktischen Rahmen (Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA) gesetzt und während der Induktion mit 3 % Isofluran anästhesiert und auf 1–2 % gesenkt, um die Anästhesie (Sauerstoff l/min) während der gesamten Operation aufrechtzuerhalten. Auf beide Augen wurde Augensalbe aufgetragen, um eine Austrocknung der Hornhaut zu verhindern. Die Haare wurden mit einer Haarentfernungscreme entfernt und die Operationsstelle dreimal mit Ethanol und Betadin gereinigt. Anschließend wurde ein Schnitt vorgenommen, um den Schädel freizulegen. Bei bilateralen Kraniotomien wurden mit einem Bohrer mit 0,5 mm Durchmesser Fenster durch den Schädel oberhalb der Injektionsstellen gebohrt. Die Koordinaten waren –3,16 anteroposterior (AP), ± 3,1 mediolateral (ML) und –4,6 dorsoventral (DV) für vCA1; −1,8 AP, ± 3,1 ML und −4,7 DV für die BLA; −1,25 AP, ± 1,0 ML und −4,7 DV für NAc; 1,70 AP, ± 0,35 ML und −2,8 DV für den PFC. Allen Mäusen wurde ein Volumen von 300 nl Cocktail pro Stelle mit einer Kontrollrate von 100 μl min-1 unter Verwendung einer mit Mineralöl gefüllten, abgeschrägten 33-Gauge-Nadel, die an einer 10 μl Hamilton-Mikrospritze (701LT; Hamilton) in einer Mikrospritze befestigt war, injiziert Pumpe (UMP3; WPI). Die Nadel blieb nach der Injektion fünf Minuten lang an der Zielstelle, bevor sie entfernt wurde. Bei allen Zielen wurden bilaterale optische Fasern 0,5 DV über der Injektionsstelle platziert. Als Anker dienten am Schädel befestigte Schmuckschrauben. Schichten von Haftzement (C&B Metabond), gefolgt von Zahnzement (AM Systems), wurden über die Operationsstelle verteilt. Mäuse erhielten nach der Operation 0,1 ml 0,3 mg/ml Buprenorphin (intraperitoneal) und wurden während der Operation und Genesung auf ein Heizkissen gelegt. Die histologische Untersuchung verifizierte die virale Ausrichtung und Faserplatzierung. Daten von Off-Target-Injektionen wurden nicht in die Analysen einbezogen.

pAAV9-cFos-tTA, pAAV9-TRE-eYFP und pAAV9-TRE-mCherry wurden wie zuvor beschrieben konstruiert (Ramirez et al., 2015). AAV9-c-Fos-tTA wurde vor der Injektion im Verhältnis 1:1 mit AAV9-TRE-eYFP oder AAV9-TRE-ChR2-EYFP (UMass Vector Core) kombiniert. Dieser Cocktail wurde weiter im Verhältnis 1:1 AAV9-CAG-Flex-DIO-TdTomato (UNC Vector Core) kombiniert.

Glasfaserimplantate wurden an ein Patchkabel angeschlossen, das mit einer 450-nm-Laserdiode verbunden war, die von automatisierter Software (Doric Lenses) gesteuert wurde. Die Laserleistung wurde zu Beginn jedes Experiments getestet, um sicherzustellen, dass am Ende des Patchkabels (Doric-Linsen) eine Leistung von mindestens 15 mW abgegeben wurde.

Wenn die Tiere, wie bereits berichtet9,10,11,12, kein Dox-Gehalt hatten, wurde die Dox-Diät 48 Stunden vor der Verhaltensmarkierung durch Standard-Laborfutter (ad libitum) ersetzt. Weibliche Exposition: Eine weibliche Maus (PD 30–40) wurde in einen sauberen Heimkäfig mit einer durchsichtigen Käfigoberseite gesetzt. Die männliche Versuchsmaus wurde dann in die Kammer gegeben und konnte 2 Stunden lang frei interagieren. Angstexposition: Mäuse wurden in eine Konditionierungskammer gebracht und erhielten während einer 8-minütigen Trainingseinheit vier Fußschocks mit 1,50 mA (2 s). Nach der Markierung wurde Dox wieder in die Nahrung aufgenommen und die männlichen Mäuse wurden in ihren Heimkäfig mit Zugang zur Dox-Diät zurückgebracht. Für die 4-OHT-Markierung wurde 4-Hydroxytamoxifen (Sigma: H7904) in 100 % Ethanol verdünnt und 5 Minuten lang verwirbelt. Sobald die Lösung gelöst war, wurde Maisöl hinzugefügt und die Lösung mit Ultraschall behandelt, um eine Verdünnung von 10 mg/kg Stamm zu erreichen. Als die Lösung fertig war, wurde 4-OHT zur Injektion in Spritzen geladen und die übrig gebliebene Lösung zur künftigen Verwendung bei –20 °C aufbewahrt. Am Tag der Markierung wurden FoscreER-Mäusen 30 Minuten nach dem Verhalten 200 mg einer 10 mg/ml-Stammlösung (2 mg 4OHT) IP verabreicht und sie wurden 72 Stunden lang ungestört gelassen. Den Mäusen wurde vor dem Markierungsprotokoll mindestens zweimal Kochsalzlösung oder DMSO injiziert, um die Tiere an die Injektion zu gewöhnen und eine Markierung außerhalb des Ziels zu verhindern.

Alle Verhaltenstests wurden während des Lichtzyklus des Tages (07:00–19:00 Uhr) durchgeführt. Vor allen Verhaltensexperimenten wurden die Mäuse 3–5 Tage lang 5–10 Minuten pro Tag behandelt. Die Prüfkammer bestand aus einem speziell angefertigten rechteckigen Kasten mit einer Glasfaserhalterung (38 × 23,5 × 42 cm). Die Bürokratie teilte die Kammer in der Mitte, so dass zwei Hälften entstanden. Die rechte und linke Stimulationsseite wurden randomisiert. Tag 1 diente zur Beurteilung der Ausgangswerte, wobei der Maus 10 Minuten Zeit gegeben wurde, die Arena frei zu erkunden. Tiere wurden an den Basistagen erneut getestet, wenn sie eine Präferenz von mehr als 45–55 % für eine Seite zeigten. Die Tiere wurden an die Kammer gewöhnt, bis sie eine Präferenz von mindestens 45/55 erreichten. Sobald der Ausgangswert erreicht war, erhielten die Mäuse am Tag nach dem ersten Engramm-Tag beim Eintritt in die vorgesehene Seite der Kammer (ausgewogen zwischen den Gruppen) über einen Testzeitraum von 10 Minuten eine Lichtstimulation (15-ms-Impulse bei 20 Hz). Sobald die Maus die stimulierte Seite betrat, löste ein TTL-Signal der EthoVision-Software über eine Noldus USB-IO-Box einen Stimulusgenerator (STG-4008, Multi-Channel Systems) aus. 6 Eine Videokamera (Activeon CX LCD Action Camera) zeichnete jede Sitzung auf und ein Experimentator, der die Behandlungsbedingungen nicht kannte, bewertete die Zeit auf jeder Seite. Zu den statistischen Analysen gehörten einfaktorielle ANOVAs zum Vergleich der Gruppendifferenzwerte [Zeit (in Sekunden) auf der stimulierten Seite minus Zeit auf der nicht stimulierten Seite] sowie Änderungen über Tage hinweg unter Verwendung einer einfaktoriellen ANOVA mit übereinstimmenden oder wiederholten Messungen. Verhaltensdiagramme wurden mit BioRender erstellt.

Zur optogenetischen Angstinduktion wurden die Probanden 500 Sekunden lang in eine Schockkammer mit Lichtstimulation (20 Hz, 15 ms) gesetzt. Fußschocks (1,5 mA, 2 s Dauer) wurden zu den Zeitpunkten 198 s, 278 s, 358 s und 438 s verabreicht. Während der optogenetischen Belohnungsinduktion wurde die Versuchsperson in einem anderen Raum als dem ursprünglichen Angsttag in einen sauberen Heimkäfig mit einer weiblichen Maus gesetzt. Die männliche Maus wurde 10 Minuten lang einer Lichtstimulation (20 Hz, 15 ms) ausgesetzt.

Die Immunhistochemie folgt zuvor veröffentlichten Protokollen15,16,18. Mäuse wurden mit 3 % Isofluran überdosiert und transkardial mit kalter (4 °C) phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) perfundiert, gefolgt von 4 % Paraformaldehyd (PFA) in PBS. Die Gehirne wurden entnommen und über Nacht in PFA bei 4 °C gelagert. Mit einem Vibratom wurden nacheinander 50 μm koronale Schnitte gesammelt und in kaltem PBS gesammelt. Die Schnitte wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur in PBST und 5 % normalem Ziegenserum (NGS) oder Rinderalbuminserum (BSA) auf einem Schüttler blockiert. Die Schnitte wurden in Vertiefungen mit Primärantikörpern (1:1000 Guinea-Anti-c-Fos [SySy]; 1:1000 Kaninchen-Anti-RFP [Rockland]; 1:5000 Hühner-Anti-GFP [Invitrogen]) überführt und auf einer Platte inkubiert Über Nacht bei Raumtemperatur oder 3 Tage bei 4 °C schütteln. Die Schnitte wurden dann 10 Minuten lang (x3) in PBST gewaschen, gefolgt von einer 2-stündigen Inkubation mit sekundärem Antikörper (1:200 Alexa 555 Anti-Kaninchen [Invitrogen]; 1 :200 Alexa Anti-Guinea 647 [Invitrogen]; 1:200 Alexa 488 Anti-Huhn [Invitrogen]). Nach drei weiteren 10-minütigen Waschgängen in PBST wurden die Schnitte auf Mikroobjektträger (VWR International, LLC) montiert. Vectashield Hart Set Eindeckmedium mit DAPI (Vector Laboratories, Inc) wurde aufgetragen, die Objektträger wurden abgedeckt und über Nacht trocknen gelassen.

Für die Quantifizierung wurden nur Tiere ausgewählt, die genaue bilaterale Injektionen hatten. Fluoreszenzbilder wurden mit einem konfokalen Mikroskop (Zeiss LSM800, Deutschland) am 20X-Objektiv aufgenommen. Zur cfos-Quantifizierung wurden alle Tiere 90 Minuten nach dem Verhalten für immunhistochemische Analysen getötet. Die Anzahl der EYFP-, TdTomato- und c-Fos-immunreaktiven Neuronen im vCA1 wurde gezählt, um die Anzahl der aktiven Zellen im jeweiligen Bereich zu messen. 3–5 koronale Schnitte (im Abstand von 50 µm voneinander) pro Maus, von denen die Mittelwerte entnommen wurden; Jeder N-Wert enthält 3–5 Bildquantifizierungen für 3–5 Mäuse. Die Anzahl der eYFP-positiven, TdTomato-positiven und c-Fos-positiven sowie DAPI-positiven Zellen in einer bestimmten Region von Interesse (ROI) wurde manuell über zwei verschiedene Experimentatoren mit ImageJ (https://imagej.nih) quantifiziert. gov/ij/). Die Größe des ROI wurde für Gehirne, Tiere, Experimente und Gruppen standardisiert. Die beiden Zähler waren für Versuchs- und Kontrollgruppen blind. Um den Prozentsatz der markierten Zellen zu berechnen, haben wir die Anzahl der fluoreszierend positiven Zellen gezählt und sie durch die Gesamtzahl der DAPI-Zellen dividiert. Überlappungen wurden auch als Prozentsatz gegenüber DAPI gezählt, zum Beispiel wurden Zellen, die sowohl für EYFP als auch TdTomato positiv waren, gegenüber DAPI gezählt. Venn-Diagrammdiagramme sind repräsentative Diagramme des Anteils von EYFP+-, TdTomato+- und cfos+-Zellen, normalisiert auf 100 % und nicht auf DAPI.

Koronale 50-Mikron-Schnitte wurden wie oben beschrieben mit Hühner-Anti-GFP (1:1000) und Kaninchen-Anti-RFP (1:1000) gefärbt. Fluoreszenzbilder wurden mit 20-facher Vergrößerung unter Verwendung eines konfokalen Mikroskops (Zeiss LSM800, Deutschland) aufgenommen. Alle Laser- und Bildgebungseinstellungen wurden bei allen Tieren und allen abgebildeten Gehirnregionen konsistent beibehalten. Die Regionen von Interesse (ROIs) wurden über alle Bilder, Schnitte und Tiere hinweg konsistent beibehalten. ROIs wurden anhand von Orientierungspunkten und unter Bezugnahme auf den Paxinos & Franklin Mouse Brain Atlas identifiziert. Die Fluoreszenzquantifizierung wurde in ImageJ durchgeführt. Nach der manuellen Auswahl des ROI mit dem Auswahltool beginnen wir damit, Informationen zur flächenintegrierten Dichte und zum mittleren Grauwert zu sammeln. Die Bilder wurden getrennt für EYFP und TdTomato analysiert. In jedem Bild haben wir Informationen über die durchschnittliche Fluoreszenz der Terminals sowie Hintergrund-/Grundlinienwerte eines negativen Bereichs gesammelt, um eine Möglichkeit zur Normalisierung zu haben. Von hier aus haben wir die folgende Formel für „Korrigiert“ verwendet

Gesamtfluoreszenz (CTF)50,51,52

Dies gab uns die willkürlichen Einheiten für die durchschnittliche Fluoreszenzintensität unserer interessierenden EYFP-Terminals im Vergleich zu TdTomato-Terminals.

Erworbene Bilddateien (.czi) wurden in ImageJ geöffnet. Die Verarbeitung der Bilder in Abb. 1 umfasste die Maximierung der Intensität, die Entfernung von Ausreißerrauschen und die Anpassung des Bildkontrasts.

Fünf Wochen alte männliche Mäuse, die nach der Konditionierung mit ChR2-YFP-Transgen1 markiert waren, wurden durch Isofluran eingeschläfert. Mausgehirne wurden schnell entnommen und die Hippocampusregionen durch Mikrodissektion isoliert. Für jede Versuchsbedingung wurden acht Mäuse gepoolt. Die Einzelzellsuspension wurde gemäß den Richtlinien des Adult Brain Dissociation Kit (Miltenyi Botec, Kat.-Nr.: 13-107-677) hergestellt. Kurz gesagt, die Hippocampusproben wurden mit Verdauungsenzymen im C-Röhrchen inkubiert, das auf dem gentleMACS Octo Dissociator mit Heizungen mit gentleMACS-Programm: 37C_ABDK_01 platziert war. Nach Beendigung des Programms wurden die Proben durch einen MACS SmartStrainer (70 μm) aufgetragen. Dann wurden ein Schritt zur Entfernung von Zelltrümmern und ein Schritt zur Entfernung roter Blutkörperchen durchgeführt, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten.

Die Einzelzellsuspension wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers einem BD FACSAria-Zellsortierer unterzogen, um die EYFP-Einzelzellpopulation zu isolieren.

Die RNA von FACS-isolierten YFP-positiven Zellen wurde unter Verwendung von Trizol (Life Technologies) und anschließendem Direct-zol-Kit (Zymo Research) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Anschließend wurde die RNA-seq-Bibliothek mit dem SMART-Seq® v4 Ultra® Low Input RNA Kit (TaKaRa) vorbereitet.

Die resultierenden Lesevorgänge von Illumina hatten laut Überprüfung mit FastQC53 eine gute Qualität. Die ersten 40 bp der Lesevorgänge wurden mithilfe von STAR26, das mit der Genannotation Ensembl GRCm38.91 indiziert wurde, auf das Mausgenom (mm10) abgebildet. Die Lesezahlen wurden mit der Funktion featureCounts54 aus dem Subread-Paket mit der nicht gestrandeten Option55 ermittelt. Die Lesevorgänge wurden anhand der Bibliotheksgröße normalisiert und die differenzielle Expressionsanalyse basierend auf der negativen Binomialverteilung wurde mit DESeq256 durchgeführt. Gene mit einem FDR-bereinigten p-Wert von weniger als 0,00001 plus einem mehr als vierfachen Unterschied wurden als differenziell exprimiert angesehen. Rohdaten zusammen mit den Genexpressionsniveaus werden bei NCBI Gene Expression Omnibusas GSE198731 hinterlegt. Für die Gen-Ontologie-Analyse haben wir proteinkodierende Gene nach ihren Faltungsänderungen eingestuft und als Eingabe für das GseaPreranked-Tool57 verwendet. Basierend auf den GSEA-Ausgaben wurden die Punktdiagramme mit einem benutzerdefinierten R-Skript erstellt. Die Pfade mit einem FDR-bereinigten p-Wert von weniger als 0,25 wurden als angereichert angesehen. Das GeneMANIA-Netzwerk wurde von GeneMANIA33 analysiert. Die maximal resultierenden Gene betrugen 20 und die maximal resultierenden Attribute 10. Allen Netzwerken wurde das gleiche Gewicht zugewiesen. Die Netzwerkdiagramme wurden von Cytoscape58 erstellt.

Die genomische DNA von FACS-isolierten YFP-positiven Zellen wurde mit dem DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Anschließend wurde die genomische DNA mit dem MspI-Enzym (NEB) verdaut und die Größe mithilfe des EpiNext™DNA Size Selection Kit (EpigenTek) ausgewählt, um das DNA-Fragment zwischen 100 und 600 bp anzureichern. Die ausgewählten DNA-Fragmente wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers mit dem EpiNext™High-Sensitivity Bisulfite-Seq Kit (EpigenTek) in eine Sequenzierungsbibliothek vorbereitet.

Rohdaten wurden mit Cutadapt59 gekürzt und dann mit Bismark60 auf das Mausgenom (mm10) abgebildet. Das Mcomp-Modul von MOABS61 wurde verwendet, um die unterschiedlich methylierten Cytosine (DMCs) und Regionen (DMRs) aufzurufen. Für die weitere Analyse wurden nur Cytosine verwendet, die mit mindestens fünf Messwerten abgedeckt wurden. Unterschiede im DNA-Methylierungsgrad von mehr als 0,2 und ein P-Wert aus dem Fisher Exact Test von weniger als 0,05 wurden als DMCs betrachtet. Rohdaten werden bei NCBI Gene Expression Omnibus als GSE208137 hinterlegt. Die unterschiedlich methylierten Regionen umfassten mindestens zwei DMCs und der maximale Abstand zwischen zwei DMCs betrug 300 bp. Für die Annotation von DMCs und DMRs wurde die Homer62-Software verwendet. Die GO-Analyse wurde mit dem R-Paket ClusterProfiler63 durchgeführt.

Den männlichen FosCRE-ERT2-Mäusen wurde ein Verhältnis von AAV-CAG-FLEX-TdTomato + AAV-cfos-tTA+AAv-TRE-EYFP im Verhältnis 1:1 in den ventralen Hippocampus injiziert. Die Tiere wurden für das Experiment ausgeglichen, wobei die Hälfte eine appetitive Markierung mit 4OHT und eine aversive Markierung mit Dox erhielt und die andere Hälfte eine aversive Markierung mit 4OHT und eine appetitive Markierung mit Dox erhielt. Koronale Schnitte des ventralen Hippocampus wurden 3–5 Tage nach der Markierungserfahrung von zuvor injizierten Tieren hergestellt. Die Tiere wurden mit Isofluran-Anästhesie tief betäubt, enthauptet und die Gehirne entfernt. Hirnschnitte wurden in mit Sauerstoff durchströmter künstlicher Saccharose-Ersatzflüssigkeit (ACSF) präpariert. Die Lösung enthielt: 185 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, mM MgCl2, 25 mM NaHCO3, 12,5 mM Glucose und 0,5 mM CaCl2. 400-µm-Scheiben wurden mit Leica VT 1200 (Leica Microsystems) geschnitten und in 30 °C ACSF bestehend aus 125 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 25 mM D-Glucose, 2 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,25 mM NaH2PO4 und 1 inkubiert mM MgCl2, für 20 Minuten und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Zur Unterscheidung appetitanregender und aversiver Zellen wurde ein Zwei-Photonen-Bildgebungssystem (Thorlabs Inc.) verwendet. Das Bildgebungssystem ist mit einem modengekoppelten Ti:Saphir-Laser (Chameleon Ultra II; Coherent) ausgestattet, der auf Wellenlängen zwischen 920 nm und 950 nm eingestellt wurde, um die Fluorophore Alexa Fluor 488 und 568, tdTomato und EYFP mit einer 20-fachen NA anzuregen 1,0-Objektiv (Olympus). Um sicherzustellen, dass Unterschiede zwischen den beiden Populationen nicht auf die Art des Virus zurückzuführen sind, der zum Markieren der Neuronen verwendet wird, wurden zwei Tiergruppen vorbereitet. In einer Gruppe wurden appetitliche Erinnerungen mit tdTomato und aversive mit EYFP getaggt und in der anderen Gruppe umgekehrt. Patch-Clamp-Elektroden mit 0,6–1 μm-Spitzen wurden mit einem horizontalen Abzieher (Sutter Instruments) gezogen, und der Pipettenwiderstand wurde zwischen 4 und 6 MΩ aufgezeichnet. Pipetten wurden mit intrazellulärer Flüssigkeit gefüllt, die Folgendes enthielt: 120 mM K-Gluconat, 20 mM KCl, 10 mM HEPES, 7 mM DiTrisPhCr, 4 mM Na2ATP, 2 mM MgCl2, 0,3 mM Tris-GTP und 0,2 mM EGTA; mit KOH auf pH 7,3 gepuffert. 0,15 % Gewicht/Volumen Alexa Fluor (Thermo Fisher Scientific) 488 Hydrazid (zur Aufzeichnung aus tdTomato-Zellen) oder 567 (zur Aufzeichnung aus EYFP-Zellen) wurden hinzugefügt, um die Aufzeichnungspipette unter dem Bildgebungssystem sichtbar zu machen. Vor dem Einbruch in die Zellen wurden eine Neutralisierung der Pipettenkapazität und ein Ausgleich des Brückengleichgewichts durchgeführt. Die Daten wurden mit Multiclamp 700B (Molecular Devices) und einem Digidata 1550 (Molecular Devices) mit einer Abtastrate von 10 kHz erfasst.

Die Analyse der elektrophysiologischen Daten von Gehirnschnitten wurde in Python mit benutzerdefinierten Skripten unter Verwendung des pyABF-Pakets (http://swharden.com/pyabf/) durchgeführt. Für die Spike-Formanalyse wurden die Spike-Einsätze anhand ihrer ersten Ableitung identifiziert, die entsprechende Spannung wurde als Spike-Einsatz bezeichnet. Die Spitzenhalbwertsbreite gibt die Zeit zwischen den beiden Hälften der Spitzenspannung an. Zur dynamischen Analyse der Spike-Eigenschaften wurden schrittweise Strominjektionen durchgeführt. Der Auslöseschwellenwert ist die Spannung, bei der ein Neuron mindestens eine einzelne Spitze auslöst, und der Auslösebeginn ist der entsprechende Strom. Die FI-Verstärkung wurde als Änderung der Zündfrequenz von der niedrigsten zur höchsten Zündfrequenz dividiert durch den eingespeisten Strom berechnet. Das Anpassungsverhältnis wurde ermittelt, indem die mittleren Inter-Spike-Intervalle (ISIs) während der letzten 200 ms der Spitze durch die mittleren ISIs während der ersten 200 ms der Spitze dividiert wurden. Der Vergleich zwischen appetitanregenden und aversiven Gedächtniszellen wurde sowohl innerhalb einer einzelnen Schicht, innerhalb eines Tieres als auch zwischen Tieren durchgeführt, um mögliche Unterschiede zwischen Tieren oder Schichten zu kontrollieren. Da die Ergebnisse in allen drei Situationen ähnlich waren, wurden die gepoolten Daten zum Vergleich verschiedener Gruppen des d'Agostino-Pearson-K2-Tests verwendet, um die Normalität der Daten zu bestimmen. Basierend auf den Normalitätsergebnissen wurden entweder ein unabhängiger t-Test (Normalverteilung) oder ein zweiseitiger Mann-Whitney-Wilcoxon-Test mit Bonferroni-Korrektur verwendet.

Die Probanden wurden zufällig in Gruppen eingeteilt. Zur Bestimmung der Stichprobengröße wurden keine statistischen Methoden verwendet; Die Anzahl der Probanden pro Gruppe basierte auf denen in zuvor veröffentlichten Studien und ist in den Bildunterschriften angegeben.

Verhaltensexperimente wurden mindestens dreimal mit drei verschiedenen Experimentatoren wiederholt. Die ersten Experimente wurden an einer anderen Institution durchgeführt und die letzten beiden Wiederholungen wurden an der Boston University durchgeführt. Die Verhaltensergebnisse waren nicht nur bei allen Experimentatoren (1 Mann, 2 Frauen) gleich, sondern auch bei allen Institutionen. Die Sequenzierungsdaten wurden ebenfalls zweimal repliziert, um die ursprünglichen Ergebnisse zu bestätigen. Alle Verhaltens- und Zellzähler und -scorer waren gegenüber den Versuchs- und Kontrollgruppen verblindet.

Es wurden Verhaltensexperimente mit einer Stichprobengröße von 7 bis 10 durchgeführt; Tiere, bei denen ein Fehlziel festgestellt wurde oder die das Virus einseitig exprimierten, wurden aus dem Experiment entfernt. Die Probengröße für die histologische Analyse lag zwischen 3 und 4 Tieren vor der Gruppe. RNA-Sequenzierungs- oder RRBS-Daten wurden mit einer gepoolten Probengruppe von 8 Tieren pro Versuchsgruppe durchgeführt. Schein- oder unmarkierte Kontrollprobengröße betrug 2 Mäuse. Für elektrophysiologische Experimente lag die Probengröße zwischen 4 und 8 Tieren. Die Daten wurden mit Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA) analysiert. Die Daten wurden gegebenenfalls mithilfe von gepaarten T-Tests (zwei Faktoren), ungepaarten T-Tests, einfaktoriellen oder zweifaktoriellen ANOVAs mit ANOVAs mit wiederholten Messungen (mehr als zwei Faktoren) analysiert. Post-hoc-Analysen (Tukeys Mehrfachvergleichstest) wurden zur Charakterisierung von Behandlungs- und Interaktionseffekten verwendet, wenn das statistisch signifikante Alpha bei p < 0,05 lag (zweiseitig). Statistische Analysen werden in den Bildunterschriften dargestellt. Alle Diagramme mit angezeigten Balkendiagrammen stellen den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) dar.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

RNA-Sequenzierungs- und Methylierungsdaten sind über die NIH-Plattform öffentlich verfügbar. Gene Expression Omnibus (GEO) verfügbare RNA-seq-Daten: GSE198731 bzw. RRBS-seq-Daten: GSE208137. Verhaltensdaten sind auf Anfrage der leitenden Autoren verfügbar. Quelldaten, die den Abbildungen zugrunde liegen. 1, 2, 3 und 6 finden Sie in den Zusatzdaten 2. Zusätzliche Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Dr. Joshua Sanes und seinem Labor am Center for Brain Science der Harvard University für die Bereitstellung von Laborräumen, in denen die ersten Experimente durchgeführt wurden, insbesondere den frühen Mitgliedern des Labors, Emily Merfeld, Emily Doucette, Stephanie Grella und Joseph Zaki. Darüber hinaus danken wir dem Center for Brain Science Neuroengineering Core für die technische Unterstützung und der Society of Fellows der Harvard University für ihre Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch einen NIH Early Independence Award (DP5 OD023106-01), einen NIH Transformative R01 Award, ein Young Investigator Grant der Brain and Behavior Research Foundation, ein Ludwig Family Foundation Grant, den McKnight Foundation Memory and Cognitive Disorders Award, unterstützt. das Center for Systems Neuroscience and Neurophotonics Center der Boston University und ein Startup-Paket der Columbia University (UR011118).

Graduiertenprogramm für Neurowissenschaften, Boston University, Boston, 02215, MA, USA

Monika Shpokayte

Abteilung für Psychologie und Gehirnwissenschaften, Center for Systems Neuroscience, Boston University, Boston, 02215, MA, USA

Monika Shpokayte, Evan Ruesch und Steve Ramirez

Graduiertenprogramm für Neurowissenschaften, Brown University, Providence, 02912, RI, USA

Olivia McKissick

Abteilung für Physiologie und Zellbiophysik, Columbia University Medical Center, New York, 10032, NY, USA

Xiaonan Guan & X. Shawn Liu

Whitehead Institute for Biomedical Research, MIT, Cambridge, 02142, MA, USA

Bingbing Yuan

Abteilung für Biomedizintechnik, Boston University, Boston, 02215, MA, USA

Bahar Rahsepar, Fernando R. Fernandez, John A. White und Steve Ramirez

Neurophotonics Center und Photonics Center, Boston University, Boston, 02215, MA, USA

Bahar Rahsepar, Fernando R. Fernandez und John A. White

Loyola University, Chicago Department of Psychology, Chicago, IL, 60660, USA

Stephanie L. Grella

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MS und OM führten und analysierten die Histologie. MS, OM und ER führten optogenetische Experimente durch und analysierten sie. BY, XG und XSL führten eine RNA-Seq- und Reduced Representation Bisulfit-Sequenzierung sowie entsprechende Analysen durch. BR, FRF und JAW führten in vitro physiologische Experimente und Analysen durch. MS, OM, XSL und SR haben das Projekt entworfen. MSXSL und SR haben das Manuskript geschrieben. SLG führte statistische Analysen durch. Alle Autoren haben das Manuskript bearbeitet und kommentiert.

Korrespondenz mit X. Shawn Liu oder Steve Ramirez.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Hauptredakteur: George Inglis. Dieses Manuskript wurde zuvor in einer anderen Nature Portfolio-Zeitschrift rezensiert. Das Manuskript wurde ohne weitere Begutachtung bei Communications Biology als zur Veröffentlichung geeignet erachtet.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Shpokayte, M., McKissick, O., Guan, X. et al. Hippocampuszellen trennen positive und negative Engramme. Commun Biol 5, 1009 (2022). https://doi.org/10.1038/s42003-022-03906-8

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Eingegangen: 21. Juni 2022

Angenommen: 26. August 2022

Veröffentlicht: 26. September 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-03906-8

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Naturneurowissenschaften (2023)

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