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Molecular Psychiatry Band 27, Seiten 4905–4917 (2022)Diesen Artikel zitieren

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Einfrieren ist ein konserviertes Abwehrverhalten, das einen wichtigen Mechanismus zur Stressbewältigung darstellt. Jahrzehntelange Forschung hat gezeigt, dass die Amygdala, das periaquäduktale Grau und der Hypothalamus eine zentrale Rolle bei der Kontrolle von Angstreaktionen, einschließlich des Einfrierens, spielen. Die Rolle, die andere Modulationsstellen für dieses festverdrahtete Gerüst spielen, ist jedoch nicht bekannt. Hier zeigen wir, dass durch Einwirkung elektrischer Fußschocks hervorgerufenes Einfrieren die GABAergen Neuronen des laterodorsalen Tegmentums (LDTg) aktiviert, die zum VTA projizieren, ohne die Erregbarkeit der cholinergen und glutamatergen LDTg-Neuronen zu verändern. Die selektive chemogenetische Stummschaltung dieser inhibitorischen Projektion, jedoch nicht anderer neuronaler LDTg-Subtypen, dämpft Einfrierreaktionen, verhindert jedoch nicht die Bildung konditionierter Angsterinnerungen. Umgekehrt löst die optogenetische Aktivierung der LDTg-GABA-Terminals im VTA Einfrierreaktionen aus und löst Bradykardie aus, ein häufiges Kennzeichen des Einfrierens. Bemerkenswert ist, dass diese aversiven Informationen anschließend über einen diskreten GABAergen Weg vom VTA zur Amygdala weitergeleitet werden. Daher haben wir einen Schaltkreismechanismus enthüllt, der LDTg-VTA-Amygdala-Regionen verbindet und potenzielle translationale Relevanz für pathologische Erstarrungszustände wie posttraumatische Belastungsstörungen, Panikattacken und soziale Phobien hat.

Stress ist ein wichtiger Anpassungsmotor. Die Stressreaktion ist meist vorteilhaft, da sie das Überleben fördert. Immer wenn ein lebender Organismus mit einem umweltbedingten Stressreiz wie etwa einer Bedrohung konfrontiert wird, aktiviert er spezielle Schaltkreise im Gehirn, um aus einem vielfältigen Repertoire an Abwehrverhalten die anpassungsfähigste Reaktion auszuwählen [1]. Diese angeborenen und erlernten Reaktionen wurden durch natürliche Selektion geformt und sowohl bei Wirbellosen als auch bei Wirbeltieren konserviert. Abwehrverhalten variiert je nach Art des Reizes sowie internen Faktoren wie Verhaltenshemmung und Angstmerkmalen [2, 3]. In Bezug auf die Verhaltensergebnisse reichen defensive Verhaltensweisen von passiven Strategien wie Einfrieren bis hin zu aktiven Kampf-oder-Flucht-Reaktionen, und der Wechsel zwischen diesen passiven/aktiven Modi ist für die Verhaltensflexibilität von entscheidender Bedeutung [1, 4, 5].

Erstarren ist eine universelle Angstreaktion, die durch einen völligen Bewegungsmangel, abgesehen vom Atmen, aufgrund einer angespannten Körperhaltung beim Antreffen einer Bedrohung gekennzeichnet ist. Das Einfrieren ist bei Stressbewältigungsprozessen von entscheidender Bedeutung, da es einem Zustand der Hypervigilanz entspricht, der die Entscheidungsfindung und folglich die Entwicklung der geeignetsten Verhaltensstrategie ermöglicht. Obwohl das Einfrieren für die Ätiologie bedrohungsbedingter Störungen wie posttraumatischer Belastungsstörungen (PTBS), Panikattacken und sozialer Phobien von Bedeutung ist [6,7,8,9], sind die zugrunde liegenden neuronalen Schaltkreise und zellulären Substrate noch lange nicht verstanden . Zahlreiche Belege deuten darauf hin, dass Gehirnstrukturen wie das periaquäduktale Grau (PAG), der Hypothalamus oder der Amygdaloidkomplex eine wichtige Rolle bei der Erkennung, Integration und Reaktion auf unbedingte und konditionierte Bedrohungen sowohl bei Nagetieren als auch beim Menschen spielen [2, 10]. , 11]. Tatsächlich hat die jahrzehntelange Arbeit mit unterschiedlichen Ansätzen, die von Läsionen, pharmakologischen Interventionen und elektrischen Stimulationen bis hin zu neueren opto- und pharmakogenetischen Instrumenten reichen, die Amygdala als Kerneinheit in diesem hierarchischen Netzwerk des Angstabwehrsystems positioniert [11]. Die laterale Amygdala berechnet Informationen aus sensorischen und assoziativen Eingaben von Kortizes und Thalamuskernen, die an den zentralen Ausgabekern der Amygdala weitergeleitet werden [2, 11]. Letzteres beeinflusst die Aktivität von PAG und hypothalamischen Bahnen, um anschließend die Aktivität von Medulla und Pons zu beeinflussen, was zu Veränderungen der Eingeweidefunktion, der Muskelkontraktion und der Schmerzempfindlichkeit führt [12]. Angesichts der Auswirkungen von Stress auf das Gehirn ist es jedoch wahrscheinlich, dass die Stressbewältigung wichtige modulatorische Gehirnnetzwerke rekrutiert, die die Erstarrungsreaktionen beeinflussen könnten. Die Aufdeckung dieser Signalwege ist ein wichtiger Schritt, um die Ätiologie von Angstreaktionen wie Erstarren vollständig zu verstehen und eine umfassende Funktionskarte dieser zugrunde liegenden, miteinander verbundenen subkortikalen und kortikalen Regionen zu erstellen. Beim Menschen kann es zu einer übermäßigen Aktivierung und anhaltenden Deregulierung dieses verteilten Abwehrnetzwerks kommen, die durch epigenetische und synaptische Veränderungen verursacht wird und sich klinisch in Zuständen intensiven Stresses, peritraumatischer Reaktionen und PTSD manifestiert [13].

Der laterodorsale Tegmentalkern (LDTg) ist mit limbischen Regionen verbunden und reagiert auf somatosensorische, visuelle und auditive Reize [14]. Obwohl hauptsächlich auf seine Rolle bei belohnungsorientiertem Verhalten [15, 16, 17] und paradoxem Schlaf [18, 19] untersucht, deuten neuere Arbeiten darauf hin, dass das LDTg stressbezogene Informationen übermitteln kann [20, 21]. Das LDTg stellt einen starken Modulator des Motivationsgleichgewichts dar und reguliert appetitliches und negativ bewertetes Verhalten. Als Teil der Formatio reticularis trägt das LDTg auch zur Verhaltenserregung bei und erleichtert so die sensorische Integration [22, 23], die eine Schlüsselkomponente für die Angstreaktionen darstellt. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass das LDTg zu Abwehrverhalten wie Einfrierreaktionen beitragen könnte. Um dies zu testen, kombinierten wir elektrophysiologische In-vivo- und Ex-vivo-Aufzeichnungen und Verhaltensanalysen, um das durch Elektroschocks verursachte Einfrieren zu beurteilen. Um den LDTg kausal mit Einfrierreaktionen zu verknüpfen, verwendeten wir pharmakogenetische und optogenetische Ansätze in viral markierten Gehirnschaltkreisen. Wir decken einen nicht-kanonischen Signalweg auf, der die GABAerge LDTg-Projektion in den ventralen Tegmentalbereich (VTA) impliziert, die sich anschließend auf Amygdalarneuronen auswirkt, um bedingungslose Gefrierreaktionen zu regulieren.

Alle Verfahren entsprachen den Empfehlungen der Europäischen Kommission (2010/63/EU) für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der französischen Nationalen Ethikkommission genehmigt (Nr. 9185-2017020911476246 und Nr. 16459-2018061116303066). Wir verwendeten männliche C57BL/6J-Mäuse (Janvier Labs, Frankreich), vGAT-CRE-Mäuse (The Jackson Laboratory, Lagernummer: 028862), vGluT2-CRE-Mäuse [24] und ChAT-CRE-Mäuse (The Jackson Laboratory, Lagernummer: 006410). Transgene Mäuse waren heterozygot und wurden auf einem C57BL/6J-Hintergrund rückgekreuzt. Die Mäuse wurden in 4–5 Mäusen pro Käfig in einem 12-Stunden-/12-Stunden-Hell/Dunkel-Zyklus gehalten, wobei das Licht von 8:00 bis 20:00 Uhr an war. Die Mäuse hatten nach Belieben freien Zugang zu Futter und Wasser. Die bereicherte Behausung bestand aus einem Kaublock aus Holz, einem Plastikiglu und Baumwolle, um das Nisten zu erleichtern. Alle in Verhaltensexperimenten verwendeten Mäuse wurden vor jedem Test eine Woche lang täglich behandelt, um jeglichen Stress zu begrenzen, der durch intraperitoneale Injektionen und Verbindungen zu Laserkabeln für optogenetische In-vivo-Experimente verursacht wurde. Alle Tests wurden an erwachsenen Mäusen durchgeführt, die mindestens 2 Monate alt waren, und Wurfgeschwister dienten als Kontrollen. Alle Experimente wurden gemäß den ARRIVE-Richtlinien durchgeführt.

Clozapin-N-Oxid (CNO) wurde von Enzo Life (Frankreich), Ketamin und Xylazin von Centravet (Frankreich) und Picrotoxin von Sigma-Aldrich (Frankreich) bezogen. Alle Arzneimittel zur In-vivo-Verabreichung wurden in Kochsalzlösung mit 0,9 % NaCl verdünnt. Mäuse erhielten entweder Kochsalzlösung (10 ml/kg) oder CNO (1 mg/kg), wie zuvor in Lit. beschrieben. [20].

Viren wurden von den folgenden Einrichtungen gekauft: Addgene (Plasmid Nr. 50475 AAV8-hSyn-hM4D(Gi)-mCherry, Plasmid Nr. 44362 AAV8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry, Plasmid Nr. 44361 AAV8-hSyn-DIO-hM3D (Gq)-mCherry, Plasmid #20298 AAV5-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-EYFP-WPRE-HGHpA, Plasmid #20297 AAV5-EF1a-double floxed-hChR2(H134R)-mCherry-WPRE-HGHpA) und Plateforme de vectorologie de Montpellier (Canines Adenovirus Typ 2, CAV-2-Cre). Für die projektions- und zelltypspezifische Modulation verwendeten wir Viren der Zurich Vector Core Facility (Kennung: v190-8 AAV-8/2-hSyn1-dFRT-hM4D(Gi)-mCherry(rev)-dFRT-WPRE- hGHp(A), Kennung:v171-retrograde ssAAV-retro/2-hSyn1-chI-dlox-EGFP_2A_FLPo(rev)-dlox-WPRE-SV40p(A)), Titer für AAVs und CAV-2-Cre waren ≥1012 Personen /ml bzw. ≥1013 ppl/ml.

Stereotaktische Injektionen wurden mit einem stereotaktischen Rahmen (Kopf Instruments) durchgeführt. Eine Vollnarkose wurde mit einer Mischung aus Ketamin (150 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) erreicht. Alle Viren wurden bilateral mit einer Geschwindigkeit von 100 nL/min für ein Endvolumen von 200 nL pro Stelle injiziert (mit Ausnahme von VTA, für das wir 300 nL injizierten). Die Mäuse waren zum Zeitpunkt der Operation 5–6 Wochen alt und erhielten eine Erholungsphase von mindestens 3 Wochen für pharmakogenetische Experimente und 6 Wochen für optogenetische Tests, um eine ausreichende Virusexpression zu ermöglichen. Stereotaktische Koordinaten (antero-posterior: AP; Mediolateral: ML; dorsoventral: DV) basierten auf dem Paxinos-Atlas des Gehirns erwachsener Mäuse [25] und wurden angepasst, als wir Operationen an jungen Mäusen durchführten. Sie werden hier in Millimetern (mm) vom Bregma für AP- und ML-Koordinaten angegeben, DV wird vom Schädel an der Injektionsstelle entnommen. Die Koordinaten waren wie folgt: LDTg: AP –4,70, ML ± 0,50, DV –3,60; VTA: AP −2,80, ML ± 0,60, DV −4,70; CeA: AP −0,75, ML ± 3,00, DV −5,05; vlPAG: AP −4,00, ML ± 0,60, DV −2,50; BLA: AP −1,30, ML ± 3,20, DV −4,60; LS: AP + 1,0, ML ± 0,2, DV −3,35.

Um LDTg-Neuronen zum Schweigen zu bringen, wurde ein AAV8-hSyn-hM4D(Gi)mCherry bilateral in das LDTg von C57Bl6J-Mäusen injiziert.

Um cholinerge, glutamaterge und GABAerge LDTg-Neuronen gezielt zum Schweigen zu bringen, wurde ein AAV8-hSyn-DIO-hM4D(Gi)mCherry bilateral in das LDTg von ChATCre-, vGluT2Cre- und vGATCre-Mäusen injiziert.

Zur projektionsspezifischen Stummschaltung wurde Wildtyp-Mäusen beidseitig CAV-2-Cre in das periaquäduktale Grau (PAG), die zentrale Amygdala (CeA) oder VTA und ein hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry in das LDTg injiziert (im Folgenden als LDTghM4→PAG-, LDTghM4→CeA-, LDTghM4→VTA-Mäuse bezeichnet). Zur selektiven Manipulation von VTAg→BLA-Projektionen haben wir bilateral ein CAV-2-Cre in das BLA und ein hSyn-DIO-hM4D(Gi)-mCherry in das VTA injiziert.

Um LDTg selektiv für VTA-Projektionen zu aktivieren, injizierten wir ein CAV-2-Cre in das VTA und ein hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry in das LDTg von Wildtyp-Mäusen (im Folgenden LDTghM3→VTA genannt).

Zur projektions- und neurotransmitterspezifischen Manipulation wurde vGATCre-Mäusen bilateral ein retrogrades AAV-retro/2-hSyn1-chI-dlox-EGFP_2A_FLPo(rev)-dlox-WPRE-SV40p(A) im VTA und ein AAV-8 injiziert /2-hSyn1-dFRT-hM4D(Gi)-mCherry(rev)-dFRT-WPRE-hGHp(A) im LDTg (im Folgenden GAThM4 genannt; LDTg→VTA).

Optische Fasern (200 μm Kern, 0,39 NA, hergestellt nach dem Protokoll von [26]) wurden bilateral in den VTA mit einem Winkel von 15° implantiert (AP: –2,8 mm; ML: –1,5 mm; DV: –4,2 mm), 4 –5 Wochen nach der Virusinjektion. Die Glasfasern wurden über eine passende Hülse (ThorLabs, ADAL1-5) mit Patchkabeln (Doric Lenses, MFP_200/240/900-0.22_1m_FC-ZF1.25(F)) zu einer Glasfaser verbunden Drehgelenk (Doric Lenses FRJ_1x2i_FC-2FC_0.22), das selbst mit einer Laserquelle (ThorLabs S1FC473MM) verbunden ist. Mäuse wurden in der Woche vor dem Verhaltenstest 30 Minuten pro Tag an eine Glasfaserverbindung gewöhnt. Am Tag des Experiments führten die Mäuse Verhaltenstests durch Tests nach 10 Minuten [21] Gewöhnung nach der Verbindung. Die Leistung des blauen (470 nm) Lasers betrug 10 mW mm−2, gemessen an der Spitze der optischen Faser. Die Lichtstimulation wurde bei 50 Hz in Impulsen von 20 ms abgegeben Perioden von 1 Minute. Mäuse der Kontrollgruppe wurden dem gleichen Verfahren unterzogen und erhielten die gleiche Intensität der Laserstimulation. Mäuse mit falsch platzierten Virusinjektionen oder Glasfaserimplantationen wurden ausgeschlossen. Die Stimulationsparameter basierten sowohl auf den in unserem Labor durchgeführten elektrophysiologischen Ex-vivo-Aufzeichnungen als auch auf veröffentlichter Literatur [21].

Für den konditionierten Ortaversionstest verwendeten wir zwei verschiedene Kammern (mit unterschiedlichen visuellen und taktilen Hinweisen), die durch ein neutrales Fach verbunden waren. Am ersten Tag erkundeten Kontroll- und vGAT-Cre-ChR2-Mäuse den Apparat 20 Minuten lang frei. Vom 2. bis zum 4. Tag wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip einer Paarkammer zugewiesen (die Paarung war ausgeglichen) und erhielten eine Lichtstimulation (50-Hz-Frequenz, 20 ms Dauer, abgegeben mit einer Dauer von 5 Minuten in 5-Minuten-Intervallen). Jeden Tag wurden zwei Konditionierungssitzungen von 20 Minuten durchgeführt, sodass die Mäuse in der gepaarten Kammer eine Lichtstimulation und in der ungepaarten Kammer keine Lichtstimulation erhielten (Vormittags- und Nachmittagssitzungen ausgeglichen). Am fünften Tag erkundeten die Mäuse den Apparat ohne Stimulation frei. Die Ergebnisse werden als Unterschied zwischen der in der Paarkammer verbrachten Zeit zwischen Tag 5 (Test) und Tag 1 (Vortest) ausgedrückt.

Sofern nicht anders angegeben, wurden die Mäuse bei allen Verhaltenstests mindestens 1 Stunde vor Beginn des Tests in einem Gewöhnungsraum neben dem Versuchsraum untergebracht. Sofern nicht anders angegeben, wurden 30 Minuten vor dem Verhaltenstest Kochsalzlösung oder CNO injiziert. Nach jedem Test wurden die Mäuse vorübergehend in einem neuen Käfig untergebracht, um soziale Interaktion mit ungetesteten Mäusen zu vermeiden, bis alle getestet wurden und schließlich in ihre Heimkäfige zurückgebracht wurden.

Um das durch Elektroschocks verursachte Gefrieren zu messen, wurde jede Maus einzeln in eine schallisolierte Testkammer gelegt, die einen Boden aus einem Gitter mit 27 Edelstahlstäben (Durchmesser 4 mm) im Abstand von 1 cm enthielt und an einen Generator angeschlossen war, um die Schockabgabe zu ermöglichen ( Shocker LE 100-26 Panlab Harvard Apparatus Bioseb). Die Mäuse konnten das Gerät drei Minuten lang frei erkunden und erhielten dann drei aufeinanderfolgende elektrische Fußschocks (Intensität: 0,7 mA, Dauer: 2 s) mit einem Abstand von 58 Sekunden zwischen den einzelnen Schocks. Die Mäuse blieben 1 Minute nach dem letzten Fußschock in der Testkammer. Die Aktivitätsniveaus der Mäuse wurden über eine hochpräzise Sensorplatte aufgezeichnet, die unter dem Bodengitter angebracht war (Lastzellenkoppler LE 111 Panlab Harvard Apparatus Bioseb), um die durch die Bewegungen der Mäuse verursachten Gewichtsschwankungen zu bewerten. Jeder Test wurde auch mit einer über dem Gerät angebrachten Videokamera (Samsung SDP-860) aufgezeichnet. Einfrieren wurde als völliger Bewegungsmangel außer der Atmung über eine Gesamtdauer von mindestens 2 Sekunden definiert. Ein Experimentator, der für die experimentellen Bedingungen blind war, bewertete manuell das Gefrierverhalten jeder Maus anhand der Videoaufzeichnungen.

Die Unterschwellenversion des Gefrierparadigmas, die mit dem aktivierenden hM3-DREADD-System verwendet wurde, wurde über 2 Tage ausgeführt. Am ersten Tag wurden die Mäuse wie oben beschrieben in die Testkammer gestellt und 5 Minuten lang frei erkunden gelassen. Am zweiten Tag erhielten die Mäuse eine Kochsalzlösung oder CNO-Injektion und wurden sofort in die Testkammer gebracht. Den Mäusen wurde 1 Minute Zeit gelassen, um sich frei zu bewegen, und dann erhielten sie zwei elektrische Fußschocks (Intensität: 0,7 mA, Dauer: 2 s; 58 s-Intervall). Anschließend wurden die Mäuse 15 Minuten lang ungestört gelassen und das Gefrierverhalten wurde während der letzten 5 Minuten des Tests mit der gleichen Methode wie oben beschrieben bewertet.

Alle Mäuse, die beim Einfrieren und in der Unterschwellenversion eingesetzt wurden, wurden nicht in anderen Verhaltenstests wiederverwendet.

Für optogenetische In-vivo-Manipulationen wurden Mäuse in die gleiche Testbox gesetzt und 5 Minuten lang frei gelassen, um den Apparat zu erkunden (Gewöhnung, AUS). Anschließend erhielten sie 1 Minute lang eine intrazerebrale Beleuchtung (EIN) und dann 1 Minute lang keine Beleuchtung (AUS). Es wurden keine Elektroschocks abgegeben. Um die aversive Gedächtnisbildung zu testen, wurden Mäuse 24 Stunden später erneut demselben Kontext ausgesetzt. Für weitere Verhaltensanalysen wurde die Videokamera an der Seite der Testkammer angebracht.

Der O-Labyrinth-Test wurde verwendet, um das Angstniveau zu messen. Jede Maus wurde in ein kreisförmiges Labyrinth gesetzt, das aus zwei offenen Armen und zwei geschlossenen Armen bestand, die sich in Quadranten abwechselten (Breite der Laufbahn: 5 cm, Gesamtdurchmesser: 55 cm, Höhe der Wände: 12 cm, Höhe über dem Boden: 60 cm). ) mit einem Umgebungslicht von 200 Lux in den offenen Armen. Die Bewegungen der Mäuse wurden 5 Minuten lang mit einer über dem Labyrinth angebrachten Videokamera aufgezeichnet. Ein gegenüber den Versuchsgruppen blinder Experimentator bewertete die Zeit, die er in den offenen Armen verbrachte.

Der Open-Field-Test wurde zur Messung der Bewegungsaktivität verwendet. Jede Maus wurde 5 Minuten lang in ein 40 × 40 cm großes offenes Feld mit einem Umgebungslicht von 200 Lux gesetzt und konnte sich dort frei erkunden. Die Bewegungen der Mäuse wurden mit einer über dem Gerät angebrachten Videokamera aufgezeichnet. Die zurückgelegte Strecke wurde automatisch mit der Software AnyMaze (Stoelting, Frankreich) analysiert.

Zur Messung der Schmerzempfindlichkeit wurde der Hargreaves-Test verwendet. Jede Maus wurde für 30 Minuten zur Gewöhnung in ein kleines transparentes Plastikfach in einem mit rotem Licht beleuchteten Raum gelegt. Dann wurde eine strahlende Infrarotquelle (Intensität: 190 ± 1 mW cm²) unter die Hinterpfote der Mäuse gelegt und die Latenzzeit bis zum Zurückziehen der Pfote gemessen. Jeden Tag wurden zwei Messungen für jede Hinterpfote mit mindestens 1 Minute Abstand zwischen den einzelnen Messungen durchgeführt und die mittlere Latenz berechnet. Der Test wurde drei Tage lang wiederholt, wobei zwischen jedem Versuch ein Tag Pause lag. Nur die Ergebnisse der letzten beiden Versuche wurden von einem blinden Experimentator analysiert. Bemerkenswert ist, dass die Mäuse, die dem Hargreaves-Test unterzogen wurden, zuerst im O-Labyrinth und dann im Freiland getestet wurden, mit einem Abstand von 4 Tagen zwischen den einzelnen Tests, um mögliche Auswirkungen einer Exposition vor der CNO zu vermeiden.

Die Mäuse wurden anästhesiert (Ketamin 150 mg/kg, Xylazin 10 mg/kg) und zur Schnittpräparation transkardial mit aCSF perfundiert. Für LDTg-Aufzeichnungen wurden koronale Schnitte von 250 µm in eiskaltem (95 % O2/5 % CO2) geblasenem aCSF erhalten, das (in mM) enthielt: KCl 2,5, NaH2PO4 1,25, MgSO4 10, CaCl2 2,5, Glucose 11, Saccharose 234 und NaHCO3 26. Die Schnitte wurden dann in aCSF, enthaltend (in mM): NaCl 119, KCl 2,5, NaHPO4 1,25, MgSO4 1,3, CaCl2 2,5, NaHCO3 26 und Glucose 11, 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert und dann bei Raumtemperatur aufbewahrt . Die Schnitte wurden übertragen und bei 32–34 °C in einer Aufzeichnungskammer aufbewahrt, die mit 2,5 ml/min aCSF überfüllt war. Visualisierte Ganzzell-Voltage-Clamp- oder Current-Clamp-Aufzeichnungstechniken wurden verwendet, um synaptische Reaktionen bzw. Erregbarkeit unter Verwendung eines aufrechten Mikroskops (Olympus France) zu messen. Stromklemmenexperimente wurden mit einem Multiclamp 700B (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) durchgeführt. Die Signale wurden mit einem Digidata 1440 A-Konverter und der Software pCLAMP 10.2 (Molecular Devices, CA) gesammelt und gespeichert. In allen Fällen wurde der Zugangswiderstand in Schritten von –10 mV (0,1 Hz) überwacht und die Experimente wurden verworfen, wenn der Widerstand um mehr als 20 % anstieg. Die interne Lösung enthielt (in mM): KD-Gluconat 135, NaCl 5, MgCl2, HEPES 10, EGTA 0,5, MgATP 2 und NaGTP 0,4. Zur Beurteilung der Erregbarkeit und Membraneigenschaften von LDTg- und VTA-Neuronen wurden depolarisierende (0–300 pA) oder hyperpolarisierende (0–450 pA) Stromschritte von 800 ms verwendet. Für VTA-Aufzeichnungen wurden wie zuvor horizontale Schnitte von 250 µm erhalten und vor Beginn der Aufzeichnung 1 Stunde lang bei 37 °C in aCSF inkubiert.

Um nach funktionellen synaptischen Verbindungen innerhalb des VTA zu suchen, injizierten wir vGATCre-Mäusen ein AAV-DIO-ChR2-YFP im LDTg und ein AAV-hSyn-DIO-mCherry im VTA. Dies ermöglicht es uns, GABAerge VTA-Neuronen zu identifizieren, die mCherry exprimieren und gleichzeitig GABAerge LDTg-Terminals opto-genetisch aktivieren. Bei einer anderen Mäusegruppe führten wir die gleichen Injektionen im LDTg durch und mutmaßliche VTA-DA-Neuronen wurden auf der Grundlage klassischer Kriterien und wie zuvor durchgeführt identifiziert (20, 27). Um glutamaterge VTA-Neuronen eindeutig zu identifizieren, injizierten wir vGluT2Cre-Mäusen AAV-hSyn-DIO-mCherry in das VTA und ein nicht Cre-abhängiges AAV-hSyn-ChR2-YFP in das LDTg. Wir haben die GABAerge Komponente der optogenetischen Stimulation pharmakologisch unter Verwendung glutamaterger Rezeptorantagonisten (AP5 50 μM und DNQX 10 μM) und cholinerger Rezeptorantagonisten (Mecamylamin 10 μM und Atropin 1 μM) isoliert. Um schließlich VTA→BLA-Neuronen aufzuzeichnen, injizierten wir vGATCre-Mäusen ein AAV-DIO-ChR2-YFP im LDTg und ein Retro-AAV-hSyn-tdTomato im BLA. VTA-Horizontalschnitte wurden wie zuvor durchgeführt [20]. Ganzzellige Spannungsklemmenaufzeichnungen von fluoreszenzmarkierten Neuronen in VTA wurden unter Verwendung derselben internen Lösung wie zuvor mit Vm = –40 mV in Gegenwart von DNQX zur Blockierung von AMPA-Strömen durchgeführt. Photoströme wurden durch optische Beleuchtung (0,1 Hz) mit 5 ms langen blauen Lichtimpulsen induziert, die von einer LED durch den Lichtweg des Objektivs geliefert wurden. Zwanzig Sweeps wurden offline gemittelt und die Spitzenamplitude wurde gemessen, um die durch Licht hervorgerufene Stromgröße zu beurteilen. Durch GABA-A-Rezeptoren vermittelte Ströme wurden unter Verwendung eines Picrotoxin-Bades (Sigma, Frankreich) blockiert, das auf eine Endkonzentration von 50 µM aufgetragen wurde.

In allen Fällen wurde die Offline-Analyse mit Clampfit 10.2 (Axon Instruments, USA) und Prism (Graphpad, USA) durchgeführt.

Um eine Fixierung des Gehirns zu erreichen, wurden die Mäuse mit einer Mischung aus Ketamin (150 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) anästhesiert und anschließend einer transkardialen Perfusion mit kaltem Phosphatpuffer (PB 0,1 M Na2HPO4/NaH2PO4, pH 7,4) unterzogen Paraformaldehyd (PFA 4 %, verdünnt in PB 0,1 M). Die Gehirne wurden über Nacht bei 4 °C in PFA 4 % belassen und dann in 40 µm große, frei schwebende Scheiben geschnitten. Schnitte wurden verwendet, um den korrekten Ort der stereotaktischen Virusinjektion für jedes Tier und die Kanülenimplantation für optogenetische In-vivo-Experimente zu bestimmen.

Zur cFos-Markierung wurden Gehirnschnitte, die den Nucleus accumbens, die Amygdala oder das laterale Septum enthielten, in PBS-BT (PBS 0,5 % BSA, 0,1 % Triton X-100) mit 10 % normalem Ziegenserum (NGS) inkubiert (30 Minuten). Die Schnitte wurden dann 36 Stunden lang in PBS-BT, 1 % NGS, mit primärem Anti-cFos (1:1000, Abcam Anti-Kaninchen 1:1000, Cat Ab190289) inkubiert (4 °C). Die Schnitte wurden in PBS gespült und (2 Stunden) in Ziege-Anti-Kaninchen-Alexa488-Sekundärantikörper (1:1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA; Katzen-Ziege-Anti-Kaninchen-Alexa488-Sekundärantikörper (1:1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA) inkubiert ; Kat. DI-1488-1.5) in PBS-BT, 1 % NGS. Die Schnitte wurden mit PBS gespült und 5 Minuten mit DAPI inkubiert, bevor sie mit Mowiol fixiert wurden. Bilder zur Quantifizierung von cFos-positiven Zellen wurden mit einem konfokalen TCS SP5-Mikroskop aufgenommen (Leica Microsystems). Ein für die Behandlung blinder Experimentator zählte manuell mit ImageJ. Die Zählung erfolgte an zwei benachbarten Gehirnschnitten und den beiden Hemisphären für jede analysierte Region. Für jede Maus wurde ein Mittelwert gebildet und für jede Versuchsbedingung (d. h. Kontrolle oder) aufgezeichnet ChR2) als cFos+ Zellen/mm2.

Wir haben die zuvor veröffentlichte Leistung erbracht [28, 29]. Kurz gesagt, stereotaktische Operationen für elektrophysiologische Experimente wurden unter Anästhesie mit 1,0–1,5 % Isofluran (in 50 % Luft/50 % O2; 1 l/min) durchgeführt. Eine Glasmikropipette, gefüllt mit 2 %iger Pontamin-Himmelblaulösung in 0,5 % Natriumacetat, wurde in den VTA abgesenkt (–3,16 mm/Bregma, 0,5 mm/Mittellinie, 3,5–4,5 mm/Gehirnoberfläche) [25]. Extrazelluläre Potentiale wurden mit einem Axoclamp-2B-Verstärker und -Filter (300 Hz/0,5 Hz) aufgezeichnet [30]. Spikes wurden online gesammelt (CED 1401, SPIKE 2; Cambridge Electronic Design; UK). VTA-Dopamin-Neuronen wurden anhand gut etablierter elektrophysiologischer Merkmale identifiziert (31, 32), zu denen Folgendes gehörte: (i) ein Aktionspotential mit ≥ 1,1 ms (gemessen vom Beginn des Aktionspotentials bis zum negativen Tiefpunkt), (ii) spontan Feuerrate (≤ 10 Hz) (iii) Einzel- und Burst-Spontanfeuermuster, bestehend aus 2 bis 10 Spitzen in vivo. Der Beginn eines Bursts wurde mit einem Interspike-Intervall von weniger als 80 ms und das Ende des Bursts mit einem Interspike-Intervall von mehr als 160 ms definiert [33]. Mutmaßliche VTA-GABA-Neuronen wurden nach etablierten elektrophysiologischen Kriterien identifiziert (i) ein Aktionspotential <1 ms; (ii) Die VTA-Grenze wurde 100 µm dorsal zum ersten VTA-DA-Neuron definiert [33,34,35,36]. Mehrere Parameter für das Feuern und Platzen von VTA-Dopamin-Neuronen wurden über einen Zeitraum von 100 s analysiert: die kumulative Wahrscheinlichkeitsverteilung der Feuerrate und die Balkendiagramme mit dem Mittelwert ± SEM, die Burst-Rate, der Prozentsatz der Spitzen im Burst (% SIB). Die Feuerfrequenz von GABA-Neuronen wurde über einen Zeitraum von 100 Sekunden analysiert. Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.

Die Herzfrequenz wurde mit dem nicht-invasiven Oximeter MouseOx Pulse (Starr Life Sciences) aufgezeichnet. Kurz gesagt, Mäuse wurden 24 Stunden vor der Aufzeichnung im Nackenbereich rasiert. Am Tag der Aufzeichnung wurden einzelne Mäuse anästhesiert und unter 1,0–1,5 % Isofluran (in 50 % Luft/50 % O2; 1 l/min) gehalten. Der Halskragen und das System wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers eingerichtet und optische Fasern wurden mit dem Kopf verbunden, um die LDTg-GABA-Terminals im VTA zu stimulieren. Nachdem eine Grundlinie von 10 Minuten erreicht worden war, wurden 3 Photostimulationsprotokolle bei 50 Hz für 1 Minute im Abstand von 2 Minuten durchgeführt. Die Herzfrequenz wurde mit einer Abtastrate von 5 Hz erfasst und mit Excel analysiert. Herzfrequenzabweichungen vom Ausgangswert wurden berechnet, indem unter Verwendung des Mittelwerts und der Standardabweichung ein Z-Score der gesamten Kurve erstellt wurde. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.

Die Daten wurden mit Prism (GraphPad, USA) analysiert. Die Normalität der Verteilung wurde zunächst mit einem Kolmogorov-Smirnov-Test getestet. Abhängig von der Anzahl der Gruppen und den Ergebnissen des Normalitätstests wurden die Gruppen dann mithilfe eines Student-t-Tests, des U of Mann-Whitney oder einer Zwei-Wege-Varianzanalyse gefolgt von einem Post-hoc-Sidak-Test verglichen. Die Daten in den Abbildungen werden als Mittelwert ± SEM dargestellt. Die statistische Signifikanz wurde herkömmlicherweise bei *p < 0,05 festgelegt; **p < 0,01; ***p < 0,001.

Um die Beteiligung des LDTg an der Verarbeitung des Gefrierens zu beurteilen, verwendeten wir einen chemogenetischen Ansatz, um LDTg-Neuronen vor der Verabreichung elektrischer Fußschocks aus der Ferne zum Schweigen zu bringen. Wildtyp-C57BL/6J-Mäusen wurde inhibitorisches DREADD (AAV-hSyn-hM4D-mCherry) in das LDTg injiziert, im Folgenden als LDTghM4-Mäuse bezeichnet (Abb. 1a, linkes Feld). Wie im Aktivitätsdiagramm dargestellt, führte die Abgabe von Fußschocks zu einer Verringerung der Bewegungsaktivität und einer längeren Zeit, die in Erstarrungshaltungen verbracht wurde (Abb. 1a, mittleres Feld). Die Quantifizierung des Gefrierens bei mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen zeigte eine allmähliche Zunahme dieses Verhaltens nach jedem Fußschock. Im Gegensatz dazu führte die Stummschaltung von LDTg-Neuronen zu einer ausgeprägten und signifikanten Abwärtsverschiebung der Einfrierreaktionskurve (Abb. 1a, rechtes Feld). Diese Verringerung des Gefrierens wurde nicht durch Veränderungen der Bewegungsaktivität, des Angstniveaus oder der Schmerzempfindlichkeit verursacht, da mit Kochsalzlösung und CNO behandelte LDTghM4-Mäuse ähnliche Reaktionen im Freiland-, erhöhten O-Labyrinth- und Hargreaves-Test zeigten (Abb. 1b, c, d bzw.). Wichtig ist, dass reduziertes Einfrieren die aversive Gedächtnisbildung nicht beeinträchtigte, da die erneute Exposition gegenüber demselben Kontext 24 Stunden nach (Tag 2) in beiden Gruppen vergleichbare Reaktionen auf konditioniertes Einfrieren hervorrief (Abb. S1). Diese Ergebnisse zeigen, dass Aktivität in LDTg-Neuronen für die Manifestation des Einfrierens von Angst notwendig ist, nicht jedoch für die Gedächtnisbildung eines aversiven Ereignisses.

a Linkes Feld: Wildtyp-Mäusen wurde AAV-hsyn-hM4-mCherry im LDTg injiziert. Das Mikroskopbild zeigt im Gegensatz zur koronalen LDTg-Anatomie aus Referenz [25] rote Fluoreszenz an der richtigen Injektionsstelle. Drei Wochen später erhielten LDTghM4-Mäuse 30 Minuten vor der Exposition gegenüber drei elektrischen Fußschocks eine Kochsalzlösung oder eine CNO-Injektion. Mittleres Feld: repräsentative Spuren, die die Aktivität von Mäusen während des Tests zeigen. Rechtes Feld: Die Erstarrungsreaktionen auf elektrische Fußschocks sind bei Mäusen, die mit CNO behandelt wurden, im Vergleich zu Mäusen mit Kochsalzlösung geringer. Die Punkte stellen den Mittelwert ± SEM-Prozentsatz der Zeit dar, die während der folgenden Zeitintervalle mit dem Einfrieren verbracht wurde: 0–3 Min., 3–4 Min., 4–5 Min. und 5–6 Min. Interaktionsbehandlung × Schocks F (3, 111) = 10,12; Zweiwege-ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, ***P < 0,001). b Die Bewegungsaktivität im Freiland wurde durch die LDTg-Hemmung nicht beeinflusst (P = 0,1072, t-Test). c Das Angstniveau wurde im O-Labyrinth-Test nicht beeinflusst (P = 0,3741, t-Test). d Die Schmerzempfindlichkeit wurde im Hargreaves-Test nicht beeinträchtigt (P = 0,7339, t-Test). e Wildtyp-Mäusen wurde AAV-hsyn-DIO-hM4-mCherry in LDTg und CAV-2-CRE in VTA injiziert. Die chemogenetische Stummschaltung von LDTg-Projektionen auf VTA reduziert das Einfrieren. Interaktionsbehandlung × Schocks F (3, 63) = 11,56; Zweiwege-ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, ***P < 0,001). f Eine Hyperaktivierung von LDTg-Projektionen zu VTA erhöht das Einfrieren. Dieselben Injektionen wie „e“, außer dass hM4 (Gi-gekoppelt, hemmend) durch hM3 (Gq-gekoppelt, erregend) ersetzt wurde. Mäuse erhielten nur zwei Schocks und ihre Gefrierreaktion wurde 10 Minuten nach der letzten Schockabgabe für 5 Minuten gemessen. Prozentsatz der Zeit, die Mäuse mit dem Einfrieren verbrachten (***P < 0,001, Mann-Whitney-Test).

Um den Schaltkreis zu entschlüsseln, der LDTg und Einfrieren verbindet, führten wir projektionsspezifische chemogenetische Manipulationen von LDTg-Projektionen auf das ventrolaterale periaquäduktale Grau (vlPAG) und die zentrale Amygdala (CeA) durch, zwei Regionen, die klassischerweise mit der Kontrolle von Einfrierreaktionen verbunden sind [11, 37]. ]. Wir injizierten daher ein retrogrades CAV-2-Cre entweder in vlPAG oder CeA und ein Cre-abhängiges inhibitorisches DREADD (AAV-hSyn-DIO-hM4D-mCherry) in LDTg, um LDTg→vlPAG- oder LDTg→CeA-Projektionen unabhängig zu manipulieren. Wir haben diesen Ansatz durch Immunhistofluoreszenz validiert, da wir mCherry-positive Neuronen im LDTg und rote Fasern im CeA und vlPAG beobachteten (Abb. S2a, b). Die Unterdrückung der LDTg→vlPAG- oder LDTg→CeA-Projektionen veränderte die Gefrierreaktion nicht, die bei Mäusen, die entweder Kochsalzlösung oder CNO erhielten, ähnlich war (Abb. S2a bzw. S2b). Angesichts des wachsenden Interesses des VTA an der Aversionsverarbeitung [38, 39] und der dichten Projektionen, die sich aus dem LDTg ergeben [40, 41, 42, 43], stellten wir als Nächstes die Hypothese auf, dass dieser Weg am Einfrierverhalten beteiligt sein könnte. Tatsächlich löste die Stummschaltung von LDTg→VTA-Projektionen eine signifikante Abwärtsverschiebung der Einfrierreaktion aus (Abb. 1e), was den Ergebnissen ähnelte, die mit vollständiger LDTg-Stummschaltung erzielt wurden (Abb. 1a). Angesichts dieses Ergebnisses stellten wir die Hypothese auf, dass die Aktivierung dieses Signalwegs die Angstreaktionen auf eine leichte aversive Herausforderung verstärken könnte. Daher verwendeten wir exzitatorisches DREADD (AAV-hSyn-DIO-hM3D-mCherry), um LDTg→VTA-Projektionen zu stimulieren, während wir Mäuse nur zwei Fuß großen Stößen aussetzten. Mit CNO injizierte Mäuse zeigten eine starke Gefrierreaktion, was darauf hindeutet, dass eine leichte Stressbelastung die LDTg→VTA-Projektionen auslöste (Abb. 1f). Diese Ergebnisse weisen auf die Besonderheit diskreter LDTg-Schaltkreise bei der aversiven Verarbeitung von Elektroschocks hin.

Um zu beurteilen, welche LDTg-Zelltypen an der Regulierung der Gefrierreaktion beteiligt sind, haben wir jede neuronale Population einzeln zum Schweigen gebracht. Wir haben daher ein Cre-abhängiges AAV-hSyn-DIO-hM4-mCherry in transgene vGlut2-Cre-, ChAT-Cre- oder vGAT-Cre-Mauslinien injiziert, was die selektive Manipulation von Glutamat-, cholinergen bzw. GABAergen Neuronen ermöglicht. Die durch Elektroschocks bei CNO-behandelten LDTgGluT-hM4- und LDTgChAT-hM4-Mäusen hervorgerufene Angstreaktion war vergleichbar mit der von mit Kochsalzlösung behandelten Kontrollen (Abb. 2a bzw. b). Im auffälligen Gegensatz dazu war das Gefrieren bei CNO-injizierten LDTgGABA-hM4-Mäusen deutlich reduziert (Abb. 2c, rechts), was auf eine Schlüsselrolle der LDTg-GABAergen Übertragung bei durch Elektroschocks ausgelösten Gefrierreaktionen schließen lässt.

a Die Stummschaltung glutamaterger LDTg-Neuronen verändert das Einfrieren nicht. vGluT2-cre-Mäuse erhielten eine Injektion von AAV-hsyn-DIO-hM4-mCherry in LDTg und unterzogen sich dann einem Gefrierparadigma; Das Mikroskopbild zeigt die mCherry-Expression an der Injektionsstelle. Prozentsatz der Zeit, die Mäuse in jedem Intervall mit dem Einfrieren verbracht haben, wie in Abb. 1 (Wechselwirkungsbehandlung × Schocks F (3, 78) = 0,4895; wiederholte Messungen, Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, P = 0,6906). b Das Stummschalten cholinerger LDTg-Neuronen verändert das Einfrieren nicht. Dasselbe wie oben, außer dass die Mäuse ChAT-cre waren (Wechselwirkungsbehandlung × Schocks F (3, 87) = 0,4895; wiederholte Messungen, Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, P = 0,6117). c Die Stummschaltung GABAerger LDTg-Neuronen reduziert das Einfrieren. Dasselbe wie oben, außer dass die Mäuse vGAT-cre waren (Wechselwirkungsbehandlung × Schocks F (3, 114) = 5,646; wiederholte Messungen, Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, **P < 0,01; ***P < 0,001).

Die vorherigen Ergebnisse zeigten, dass die unabhängige Stummschaltung von entweder GABAergen LDTg-Neuronen oder LDTg→VTA-Projektionen ausreicht, um die ausgelöste Einfrierreaktion zu dämpfen. Um zu testen, ob LDTg-GABA-Neuronen, die auf die VTA projizieren, in diesem Prozess von entscheidender Bedeutung sein könnten, manipulierten wir als Nächstes das LDTg auf neurotransmitter- und projektionsspezifische Weise unter Verwendung einer doppelten intersektionalen Strategie. Wir injizierten zunächst in die VTA von vGAT-Cre-Mäusen ein retrogrades AAV-DIO-flp, das die Expression der Flippase (flp) in Cre-abhängiger Weise ermöglicht (dh in GABAergen LDTg→VTA-Neuronen). Als nächstes wurde ein Flippase-abhängiges inhibitorisches DREADD (AAV-hSyn-FRT-hM4-mCherry) in das LDTg injiziert. Während mit Kochsalzlösung behandelte LDTgGABA→VTA-hM4-Mäuse eine normale Gefrierreaktion zeigten, zeigten mit CNO behandelte Mäuse eine signifikante Abwärtsverschiebung der Gefrierkurve (Abb. 3a). Dies ist ein starker Beweis für die zentrale regulatorische Rolle dieser GABAergen Projektion gegenüber der Angstreaktion.

a Die Unterdrückung von GABAergen LDTg-Projektionen zu VTA reduziert das Einfrieren. Linkes Feld: vGAT-cre-Mäuse erhielten Injektionen von AAV-hsyn-FRT-hM4-mCherry in LDTg und retrogrades DIO-flp in VTA und folgten dann dem gleichen Protokoll wie Abb. 1: Mikroskopbilder zeigen mCherry-exprimierende Zellkörper (Injektionsstelle) und Fasern in VTA. Mittleres Feld: Repräsentative Spuren, die die Aktivität von Mäusen während des Tests zeigen. Rechtes Feld: Prozentsatz der Zeit, die Mäuse in jedem Intervall mit dem Einfrieren verbracht haben. Interaktionsbehandlung × Schocks F (3, 90) = 3,088; Zweiwege-ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, **P < 0,01). b GABAerge LDTg-Projektionen zu VTA werden durch akuten Stress sensibilisiert. Linkes Feld: vGAT-cre-Mäusen wurde retrogrades AAV-FLEX-tdTomato in VTA injiziert und sie erhielten dann entweder 3 Schocks (gestresst) oder keinen Schock (naiv). Mittleres linkes Feld: Mikroskopiebilder von GABAergen Zellen, die mit Transmissionslicht (oben) oder roter Fluoreszenz (unten) auf VTA in LDTg projizieren. Mittleres rechtes Feld: Repräsentative Spannungsspuren als Reaktion auf eine Stromeinspeisung von 40 pA für jede Bedingung. Rechtes Feld: Erregbarkeitsprofil von GABAergen LDTg-Neuronen, die in Kontrollmäusen oder gestressten Mäusen auf VTA projizieren. Die Diagramme zeigen die Häufigkeit des Aktionspotentials nach zunehmenden Strominjektionsschritten. Interaktionsbehandlung × aktuelles F (4, 144) = 1,866); Behandlungsfaktor F (1, 36) = 5,082; Zweiweg-ANOVA mit wiederholten Messungen, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, *P < 0,05).

Kann die Exposition gegenüber aversiven Fußstößen die zellulären Eigenschaften von GABAergen LDTg→VTA-Neuronen verändern, um Angstreaktionen zu fördern? Wir führten Ex-vivo-Patch-Clamp-Aufzeichnungen ganzer Zellen in viral markierten GABAergen LDTg→VTA-Neuronen durch. Hierzu wurde vGAT-Cre-Mäusen eine retrograde AAV-FLEX-tdTomato in den VTA injiziert (Abb. 3b). Mäuse wurden, wie für die Verhaltenstests beschrieben, drei aufeinanderfolgenden elektrischen Fußschocks ausgesetzt und unmittelbar danach aufgezeichnet. Kontrollmäuse wurden der Kammer ausgesetzt, ohne Fußschocks zu erhalten. Die Exposition gegenüber Fußschocks löste eine erhöhte Erregbarkeit von GABAergen LDTg→VTA-Neuronen aus, was durch eine höhere Entladungsfrequenz bei depolarisierenden Strominjektionen im Vergleich zu nicht geschockten Mäusen belegt wurde (Abb. 3b, rechtes Feld). Wichtig ist, dass diese Anpassung keinen signifikanten Einfluss auf die passiven Membraneigenschaften der Zelle wie Membranwiderstand, Membrankapazität oder Ruhemembranpotential hatte (Abb. S3a, b, c). Um zu testen, ob Elektroschocks die Aktivität anderer LDTg-Zelltypen verändern könnten, wandten wir das gleiche Verfahren auf ChAT-Cre- und vGluT2-Cre-Mäuse an und zeichneten cholinerge und glutamaterge LDTg→VTA-Neuronen auf. Im Gegensatz zu dem, was wir bei der Projektion von LDTg-GABA-Neuronen beobachtet haben, konnten Elektroschocks das Erregbarkeitsprofil von cholinergen und glutamatergen Neuronen, die auf die VTA projizierten, nicht verändern (ergänzende Abbildung 5a). Allerdings zielen projizierende GABAerge LDTg-Neuronen nicht nur auf die VTA. Daher haben wir zuletzt getestet, ob Elektroschocks die Funktion GABAerger Neuronen unabhängig von den Zielhirnregionen verändern können. Hierzu wurde vGATCre-Mäusen eine retrograde AAV-FLEX-tdTomato in den vlPAG injiziert. Während wir eine erhöhte Empfindlichkeit von GABAergen LDTg→VTA-Neuronen fanden, blieb das Erregbarkeitsprofil von GABAergen LDTg→vlPAG-Neuronen unverändert (ergänzende Abbildung 5b). Somit beeinflussen Fußstöße die Aktivität eines diskreten GABAergen LDTg-Signalwegs.

Unsere bisher gesammelten Daten deuten darauf hin, dass Elektroschocks durch die Aktivierung von GABAergen LDTg→VTA-Neuronen ein Einfrieren auslösen. Um zu testen, ob das Einfrieren ohne aversive Erfahrung induziert werden kann, verwendeten wir eine selektive optogenetische Stimulation bei sich frei verhaltenden Mäusen. Wir injizierten ein Cre-abhängiges AAV-hsyn-DIO-hChR2-YFP in das LDTg von vGAT-Cre-Mäusen und implantierten beidseitig optische Fasern über dem VTA. Die leichte Stimulation von ChR2, das an den GABAergen LDTg-Terminals im VTA exprimiert wird, reichte aus, um ein signifikantes Einfrieren in Abwesenheit eines aversiven Reizes auszulösen (Abb. 4a). Mäuse hörten auf zu frieren, sobald die Stimulation ausgeschaltet wurde, was auf einen dynamischen zellulären Prozess hinweist. Wichtig ist, dass kein konditioniertes Einfrieren beobachtet wurde, wenn Mäuse 24 Stunden später ohne Lichtstimulation erneut demselben Kontext ausgesetzt wurden (ergänzende Abbildung S6a). Darüber hinaus haben wir untersucht, ob die Kombination von Lichtstimulation in einem definierten Kontext eine konditionierte Ortsaversion auslösen kann. Es wurden drei tägliche Paarungen durchgeführt und die Mäuse ohne Lichtstimulation getestet. Bemerkenswert ist, dass die von ChR2-Mäusen in der ungepaarten Kammer zurückgelegte Distanz erwartungsgemäß höher war als in der gepaarten Kammer, wo die Lichtstimulation zu Immobilität führte (ergänzende Abbildung 6b). Dennoch verbrachten sowohl Kontroll- als auch ChR2-Mäuse während der Vortest- und Testsitzungen ähnlich viel Zeit in der Paarkammer (Abb. 4b). Dies weist darauf hin, dass die Aktivierung der GABAergen LDTg-Terminals im VTA keine aversiven Erinnerungen hervorruft.

Eine optogenetische In-vivo-Aktivierung GABAerger LDTg-Terminals innerhalb des VTA induziert spontanes Einfrieren. Linkes Feld: vGAT-cre-Mäusen wurde entweder AAV-hsyn-DIO-hChR2-YFP (ChR2) oder AAV-hsyn-DIO-YFP (Kontrolle) in LDTg injiziert und ihnen wurden optische Fasern über dem VTA implantiert; Mikroskopbilder zeigen grüne Fluoreszenz an der Injektionsstelle und YFP-Expression an der Injektionsstelle sowie YFP-exprimierende Fasern mit optischen Faserspuren an der Implantationsstelle im VTA. Mittleres Panel: Experimentelle Zeitleiste. Rechtes Feld: Prozentsatz der Zeit, die Mäuse mit dem Einfrieren verbracht haben, dargestellt als Mittelwert ± SEM in den folgenden Intervallen (Interaktionsgruppe × Licht F (2, 30) = 4,166; wiederholte Messungen, Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, ***P < 0,001 ). b Kontroll- und ChR2-Mäuse erhielten im gepaarten Kompartiment eine Lichtstimulation und auf der ungepaarten Seite keine Lichtstimulation. Nach drei Paarungen auf jeder Seite durften die Mäuse den Konditionierungsapparat frei erkunden. Die optogenetische In-vivo-Aktivierung GABAerger LDTg-Terminals konnte keine Platzaversion auslösen (t31 = 0,1606, P = 0,8735). c Mithilfe der telemetrischen Überwachung der Herzfrequenz bei anästhesierten Mäusen löste die Lichtstimulation bei ChR2-Mäusen eine Bradykardie aus, die bei Kontrolltieren nicht beobachtet wurde, wenn der Laser eingeschaltet war (t7 = 1,128, P = 0,2966 Kontrolle; t12 = 5,191, P < 0,001 ChR2).

Um zu unterscheiden, ob die optogenetische Stimulation ein unbedingtes Einfrieren oder einen reinen motorischen Stillstand hervorrief, führten wir telemetrische Messungen der Herzfrequenz durch. Dies wurde an anästhesierten Mäusen durchgeführt, um störende Veränderungen der Herzfunktion und der körperlichen Aktivität zu vermeiden. Die Lichtstimulation bei ChR2-Mäusen führte zu einer signifikanten Verlangsamung der Herzfrequenz (dh Bradykardie), die bei Kontrollmäusen nicht beobachtet wurde (Abb. 4c). Insgesamt ahmt dieses optogenetische Experiment zwei Merkmale des unbedingten Einfrierens nach, nämlich Immobilität und Bradykardie. Da dieser Eingriff jedoch keine Angsterinnerungen auslöst und das Einfrieren die Summe verschiedener physiologischer Reaktionen, einschließlich gestoppter motorischer Aktivität, ist, spekulieren wir, dass diese Rekrutierung künstlicher Schaltkreise emotionale Reaktionen auf bedrohliche Reize möglicherweise nicht vollständig rekapituliert.

Obwohl einige Studien den VTA in die Bildung von Reaktionen auf konditioniertes Einfrieren verwickelt haben [44, 45], sind seine Rolle beim unbedingten sofortigen Einfrieren bei Bedrohung sowie seine Ausgabeziele unbekannt. Um die Schaltkreise zu verstehen, die die LDTg-GABA-Einfrierreaktion vermitteln, verwendeten wir wie zuvor eine optogenetische Stimulation der LDTg-GABA-Fasern über dem VTA, und Mäuse wurden 90 Minuten nach der Lichtstimulation getötet, um eine Gehirnkartierung der cFos-Expression durchzuführen (Abb. 5a). Wir haben unsere Analysen auf zwei Gehirnstrukturen eingegrenzt, von denen bekannt ist, dass sie beim Einfrieren eine wichtige Rolle spielen: die Amygdala [11] und das laterale Septum [46]. Als Hauptziel des VTA und angesichts seiner Rolle bei motorischen Reaktionen haben wir auch die Reaktivität des Nucleus accumbens (NAc) analysiert. Die Aktivierung der LDTg-GABA-Terminals innerhalb des VTA löste eine auffällige Aktivierung sowohl in der Amygdala als auch im lateralen Septum aus, jedoch nicht im NAc (Abb. 5b, c bzw. ergänzende Abb. 7a, b).

a Kontroll- und vGAT-Cre-ChR2-Mäuse wurden 90 Minuten nach der Lichtstimulation getötet, wie in der experimentellen Zeitleiste dargestellt (linkes Feld). cFos-positive Neuronen wurden in (b) der basolateralen und zentralen Amygdala (BLA bzw. CeA), (c) dem dorsalen und ventralen Teil des lateralen Septums (LSD bzw. LSV) gezählt. d Bei WT-Mäusen reduziert die chemogenetische Unterdrückung von VTA-Projektionen auf die BLA (Wechselwirkungsbehandlung × Schocks F (3, 51) = 3,604; wiederholte Messungen, Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, **P < 0,01) das Einfrieren. e Die chemogenetische Unterdrückung von VTA-Projektionen zum LS verändert das Gefrierverhalten nicht (Wechselwirkungsbehandlung × Schocks F (3, 66) = 0,3606; wiederholte Messungen, Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, P = 0,7817). *P < 0,05; **P < 0,01.

Vor dem Hintergrund dieser Ergebnisse haben wir als Nächstes getestet, ob die Modulation von VTA→BLA- oder VTA→LS-Projektionen die Einfrierreaktionen beeinflussen würde. Unter Verwendung einer intersektionalen Virusstrategie exprimierten wir ein inhibitorisches DREADD in VTA→BLA- (Abb. 5d) oder in VTA→LS-Neuronen (Abb. 5e) und setzten Mäuse elektrischen Fußschocks aus. Ein signifikanter Rückgang des Einfrierens wurde nur beobachtet, wenn die VTA→BLA-Projektionen, nicht jedoch der VTA→LS-Signalweg, stummgeschaltet wurden (Abb. 5d bzw. e). Diese Ergebnisse weisen auf die Spezifität für einzelne VTA-Ziele in der Einfrierreaktion hin.

Modulieren GABAerge LDTg-Neuronen direkt VTA→BLA-projizierende Neuronen oder greifen sie in VTA-Mikroschaltkreise ein? Um diese Hypothese zu testen, untersuchten wir die funktionelle Konnektivität zwischen diesem LDTg-Hemmeingang und den drei VTA-Zelltypen (dh GABA-, DA- und Glu-Neuronen) sowie den VTA-projizierenden Neuronen, wie in Methoden beschrieben. Nach der Photostimulation der LDTg-Terminals fanden wir, dass 24 % der Zellen (7/29) mit VTA→BLA-projizierenden Neuronen verbunden waren (ergänzende Abbildung 8a). Im auffälligen Gegensatz dazu erhielten 91 % der VTA-GABA-Zellen (20/22) GABA-Eingaben vom LDTg (ergänzende Abbildung 8b). Diese nach außen gerichteten Ströme wurden durch Picrotoxin blockiert, was darauf hinweist, dass diese Reaktion über GABA-A-Rezeptoren erfolgte (ergänzende Abbildung 8f). Außerdem stellten GABAerge LDTg-Neuronen funktionelle Kontakte mit mutmaßlich 95 % der VTA-DA-Neuronen her (19/20). Stattdessen erhielten nur 33 % der VTA-Glu-Neuronen (7/21) GABA-Eingaben vom LDTg (ergänzende Abbildung 6d). Unter den verbundenen Zellen war die Amplitude optischer inhibitorischer postsynaptischer Ströme (oIPSCs) in VTA-GABA- und DA-Neuronen größer als in VTA-Glu-Zellen oder VTA→BLA-projizierenden Neuronen (ergänzende Abbildung 6e). Dieser erste Datensatz weist auf eine ausgeprägtere funktionelle Konnektivität mit den VTA-Mikroschaltkreisen gegenüber projizierenden Schaltkreisen hin, wobei DA- und GABA-VTA-Neuronen bevorzugt werden.

Die Ergebnisse der Konnektivitätsanalyse legen nahe, dass die Stummschaltung GABAerger LDTg→VTA-Neuronen vorzugsweise die Aktivität GABAerger VTA- oder DA-Neuronen modulieren sollte. Um diese Möglichkeit zu testen und einen umfassenderen Überblick über die LDTg-Kontrolle über die VTA-Funktion zu erhalten, haben wir In-vivo-Aufzeichnungen an anästhesierten Tieren durchgeführt und gleichzeitig GABAerge LDTg→VTA-Projektionen zum Schweigen gebracht (Abb. 6a). In mit Kochsalzlösung behandelten Mäusen zeigten mutmaßliche GABAerge VTA-Neuronen ein klassisches Aktivitätsfeuermuster (Abb. 6b), ähnlich wie in früheren Berichten [34, 35, 36]. Im Gegensatz dazu zeigten mit CNO behandelte Mäuse eine starke Linksverschiebung der Feuerungsratenverteilung mutmaßlicher VTA-GABA-Neuronen, was eine deutliche Abnahme der Aktivität widerspiegelt (Abb. 6b). Um festzustellen, ob die Stummschaltung des GABAergen LDTg→VTA-Signalwegs einen größeren Einfluss auf die VTA-Homöostase hatte, haben wir zusätzlich die Aktivität von VTA-DA-Neuronen in vivo aufgezeichnet. Die Feuerratenverteilung (Abb. 6c), die Burst-Aktivität und die vier Hauptmodi der Feuermuster von VTA-DA-Neuronen (47) unterschieden sich nicht zwischen mit Kochsalzlösung und CNO behandelten Gruppen (ergänzende Abb. 9).

a In-vivo-Aufzeichnungen wurden im VTA von anästhesierten LDTgGABA→VTA-hM4-Mäusen durchgeführt und die Aktivität mutmaßlicher VTA-GABA- oder DA-Neuronen nach systemischer Verabreichung von Kochsalzlösung oder CNO analysiert. Die kumulative Wahrscheinlichkeitsverteilung der Feuerrate sowie der Feuerfrequenz (Einschub) werden für mutmaßliche VTA GABA- (b) und VTA DA-Neuronen (c) dargestellt. Für jede Versuchsbedingung werden repräsentative Spuren dargestellt. Die Unterdrückung der GABAergen LDTg-Eingänge in VTA verringert selektiv die Aktivität von VTA-GABA-Neuronen, ohne die VTA-DA-Feuerung zu verändern. **P < 0,01 Mann-Whitney-Test. d vGATCre-Mäuse erhielten eine Injektion von AAV-hSyn-FRT-hM4-mCherry in der VTA und Retro-AAV-DIO-Flp in der BLA und unterzogen sich dann einem Einfrierparadigma. Das Mikroskopbild zeigt die mCherry-Expression an der VTA-Injektionsstelle. Die selektive Stummschaltung von GABAergen VTA→BLA-Neuronen verringerte die Einfrierreaktionen (Interaktionsbehandlung × Schocks F (3, 45) = 4,947; wiederholte Messungen, Zwei-Wege-ANOVA, gefolgt von Sidaks Vergleichstest, **P < 0,01.

VTA-GABA-Neuronen können Neuronen mit großer Reichweite sein oder die VTA-Funktion über lokale Konnektivität modulieren [34, 35, 48, 49, 50]. Um dieses Problem zu lösen, versuchten wir, die Natur des Neurotransmitters zu identifizieren, der gefrierbezogene Informationen an die Amygdala übermittelt. Wir haben daher DA-, Glu- und GABA-VTA→BLA-Neuronen auf projektions- und neurotransmitterspezifische Weise zum Schweigen gebracht, während wir Mäuse elektrischen Fußschocks ausgesetzt haben, um ein Einfrieren hervorzurufen. Nur die Stummschaltung von GABAergen VTA → BLA-Neuronen, nicht jedoch von DA- oder Glu-Neuronen, verringerte das Einfrieren (Abb. 6d bzw. ergänzende Abb. 10a, b).

Insgesamt verknüpft dieser Datensatz einen hemmenden Input vom LDTg mit der VTA-GABA-Funktion und liefert Hinweise auf eine koordinierte Reaktion des LDTg-VTA-Amygdala-Makroschaltkreises während der aversiven Verarbeitung (ergänzende Abbildung 11).

Obwohl festgestellt wurde, dass viele Gehirnregionen Freezing-Reaktionen unterstützen, ist die Rolle, die Modulationsstellen für dieses fest verdrahtete Gerüst spielen, nicht bekannt. Unsere Ergebnisse liefern einen neuartigen Rahmen, um zu verstehen, wie aversive Erfahrungen schnelle zelluläre Veränderungen auslösen, die letztendlich zu Abwehrverhalten führen. Wir zeigen hier, dass die Aktivität der GABAergen LDTg-Einträge in das VTA für die Manifestation von Erstarrungsverhalten als Reaktion auf eine drohende Gefahr notwendig ist. Die optogenetische Stimulation dieser Projektion reicht aus, um das Einfrieren ohne Bedrohung und die Rekrutierung von Amygdala-Substraten zu fördern. Unsere Studie zeigt eine unentdeckte Rolle dieses Signalwegs im adaptiven Abwehrverhalten bei Bedrohungen, was neue Erkenntnisse über Stressbewältigungsschaltkreise liefert.

Das Abwehrnetzwerk des Gehirns umfasst mehrere miteinander verbundene kortikale und subkortikale Bereiche, die für die Erkennung und Verarbeitung von Bedrohungen unerlässlich sind, um rechtzeitig Abwehrreaktionen voranzutreiben [37, 51, 52]. Funktionelle Bildgebungsstudien beim Menschen und erweiterte molekulare, zelluläre und Schaltkreisanalysen bei Nagetieren positionierten die Amygdala, das periaquäduktale Grau und den präfrontalen Kortex als zentrale Aktoren der Kontrolle von Angstreaktionen, zu denen auch das Einfrieren gehört. Während zahlreiche Belege eine solide Grundlage für Makro- und lokale Schaltkreise liefern, die Reaktionen auf konditioniertes Einfrieren steuern [11], fehlt es immer noch an einem detaillierten Verständnis der zellulären Mechanismen und der Abfolge von Ereignissen, die das Verhalten bei bedingungslosem Einfrieren auslösen. Dies ist äußerst relevant, da die Symptome und die Pathogenese bedrohungsbedingter Störungen sowohl auf erlernten als auch angeborenen Angstreaktionen beruhen [10, 53]. In unserer Studie zeigen wir, dass elektrische Fußschocks eine sofortige Erhöhung der Erregbarkeit hemmender LDTg-projizierender Neuronen zum VTA auslösen. Die Unterdrückung dieser spezifischen Projektion hat selektive Auswirkungen auf die Funktion der GABAergen VTA-Neuronen, ohne das Feuern der VTA-DA-Zellen zu verändern. Darüber hinaus haben wir die VTA-Ausgaben analysiert und beobachtet, dass die Stummschaltung der GABAergen VTA-Projektionen auf die Amygdala die bedingungslose Erstarrungsreaktion auf Fußstöße dämpft. In einer kürzlich durchgeführten Studie beeinträchtigte die selektive optogenetische Hemmung der VTA-DA-Terminals in der Amygdala den Erwerb aversiver Erinnerungen, hatte jedoch keinen Einfluss auf das unbedingte Einfrieren bis hin zu Fußschocks [54]. Dies legt nahe, dass unterschiedliche VTA-zu-Amygdala-Neurotransmitterpopulationen zum unbedingten und konditionierten Einfrieren beitragen.

Zwei aktuelle Berichte belegen die Rolle des VTA bei Abwehrreaktionen und bringen VTA-GABA und glutamaterge Neuronen mit angeborenem Abwehrverhalten in Verbindung [48, 55]. Tatsächlich löste die Einwirkung von Raubtiergerüchen oder drohenden Reizen eine vorübergehende Aktivierung von VTA-Glutamat-Neuronen aus, die mit Fluchtverhalten verbunden sind [55]. Außerdem korrelierte das Einsetzen von Fluchtverhalten, das durch das Auftauchen hervorgerufen wird, mit Ca2+-Transienten in VTA-GABA-Neuronen [48]. In Übereinstimmung mit unserer Studie berichteten die Autoren, dass eine direkte optogenetische Stimulation dieser globalen Neuronenpopulation zu einem Erstarren und anschließendem Flug-zum-Nest-Verhalten führte. Dies macht deutlich, dass die VTA eine Rolle bei der Abwehr von Fluchtversuchen spielt. Doch obwohl gezeigt wurde, dass VTA-Neuronen auf Fußstöße reagieren [34], blieb ihre Beteiligung an der Auslösung schneller Angstreaktionen ungeklärt. Hier erweiterten wir die Rolle von VTA bei Abwehrreaktionen, indem wir die Auslösung des Einfrierens durch alleinige Modulation eines GABA-Inputs aus der Brückenregion zeigten. Studien, die sich mit der Rolle des VTA bei positiver und negativer Valenz befassen, haben sich bisher auf die Rolle der VTA-DA-Neuronen konzentriert. Hier konnten wir in den von uns durchgeführten Experimenten diese neuronale Population nicht implizieren, konnten jedoch eine Rolle für GABAerge VTA-Neuronen mit großer Reichweite identifizieren. Dies deutet darauf hin, dass GABAerge Langstreckenneuronen ähnlich wie VTA-DA-Neuronen wahrscheinlich zumindest teilweise als getrennte neuronale Population auftreten, die unterschiedliche Umweltreize und interne Anforderungen verarbeiten, um verschiedene Facetten von Verhaltensreaktionen anzutreiben, die von der Modulation von Morphin reichen belohnende Eigenschaften, zu assoziativem Lernen und bedingungslosem Einfrieren (vorliegende Studie) [49, 56, 57].

Insgesamt wäre ein mutmaßliches Modell in diesen von uns aufgedeckten Makro- und Mikroschaltkreisen des Abwehrverhaltens des Gehirns, dass Elektroschocks GABAerge LDTg-Neuronen aktivieren, um über die Modulation lokaler VTA-Neuronen, mutmaßlich GABA, eine Enthemmung von VTA→BLA-Neuronen zu bewirken [50]. .

Um sich in komplexen und sich schnell verändernden Umgebungen zurechtzufinden, müssen Säugetiere ihr Verhalten anpassen, um Zugang zu lebenswichtigen Ressourcen zu erhalten und gleichzeitig schädliche Situationen zu vermeiden. Diese Verhaltensreaktionen werden durch schnelle und dauerhafte zelluläre Anpassungen bei lohnenden und/oder aversiven Herausforderungen fein abgestimmt [58]. Eine Fehlregulation dieses homöostatischen Gleichgewichts führt zu unangemessenen Entscheidungen und erhöht das Risiko, psychiatrische Erkrankungen zu entwickeln [59]. In der Vergangenheit war die LDTg-VTA-Achse stark mit der Belohnungsverarbeitung und -verstärkung verknüpft [60, 61]. Das LDTg ist ein wichtiger Modulator der VTA-Dopamin-Feueraktivität und folglich der Dopaminfreisetzung im Vorderhirn [20, 62, 63]. Pharmakologische Studien und Läsionsstudien haben seine Schlüsselrolle bei der Zuordnung des Belohnungswerts zu Reizen und der Vermittlung verschiedener Zell- und Verhaltensanpassungen an Suchtstoffe wie Kokain und Nikotin hervorgehoben [64]. Projektionsspezifische Manipulationen zeigten ihren Beitrag zu appetitlich motivierten und lohnenden Verhaltensweisen [16, 43], wobei cholinerge und glutamaterge LDTg-Projektionen einen deutlichen Beitrag zu diesen Prozessen leisten [42]. Tatsächlich ist die selektive optogenetische Stimulation im VTA der glutamatergen oder cholinergen LDTg-Terminals lohnend, was sich in der Anzahl der verbrachten Zeit und den Eintritten in eine reizgepaarte Kammer widerspiegelt [42]. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass GABAerge Eingaben in die VTA teilweise an der Wiedereinführung kokainsüchtiger Verhaltensweisen beteiligt sind [65]. Trotz dieser soliden Beweise für die Beteiligung der LDTg-VTA-Achse an der Verarbeitung positiver Reize stellt unsere vorliegende Arbeit diese akzeptierte Ansicht in Frage und zeigt eine kausale Auswirkung der LDTg-hemmenden Eingaben auf die VTA bei der Verarbeitung unmittelbarer aversiver Herausforderungen. Unsere Ergebnisse werden durch Beweise gestützt, die zeigen, dass die optogenetische Manipulation lokaler LDTg-Interneuronen die angeborene Angst beeinflusst, die durch olfaktorische Hinweise hervorgerufen wird [21]. Dies wirkt sich wahrscheinlich auf die LDTg-Ausgaben aus und moduliert die nachgelagerte Zielaktivität, einschließlich der hier identifizierten LDTg-VTA-Achse. Unsere früheren Arbeiten haben außerdem gezeigt, dass eine Überaktivierung der cholinergen LDTg-Eingänge in VTA-Dopamin-Neuronen nach sozialer Aggression das Auftreten depressiver Symptome auslöste [20]. In jüngerer Zeit wurde gezeigt, dass ein von Neuronen abgeleitetes trophisches Molekül, Neuregulin-1, nach chronischem sozialem Niederlagenstress im LDTg erhöht ist und depressives Verhalten fördert, indem es die Aktivität von VTA-DA-Neuronen beeinflusst [66]. Schließlich führt die Exposition gegenüber den Stresshormonen Glukokortikoiden in der Gebärmutter zu Motivationsdefiziten, denen durch Modulation der LDTg-VTA-Projektionen entgegengewirkt werden kann [67]. Insgesamt deutet dies darauf hin, dass hervorstechende Umweltreize, ob belohnend oder aversiv, unabhängige Populationen von LDTg-Neuronen rekrutieren würden und dass die frühe Polarisierung positiver und negativer Netzwerke eine zu starke Vereinfachung darstellte [68]. Somit könnten cholinerge/glutamaterge und GABAerge LDTg-Neuronen komplementäre Motivationszustände kodieren und über Projektionen auf den VTA die Annäherung bzw. Verteidigung fördern. Annäherungs- und Abwehrreaktionen erfordern die koordinierte Einbindung motorischer Zentren. Insbesondere der pedunculopontine Kern (PPN), ein eng verwandtes Zentrum im Hirnstamm, sendet aufsteigende Projektionen an die meisten Basalganglienkerne, insbesondere die Substantia nigra (SN), und steuert so motorische Reaktionen [23]. Beispielsweise erhöht die optogenetische Aktivierung der cholinergen PPN-Terminals innerhalb des SN die Fortbewegung [17]. Ein aktueller bioRxiv-Bericht zeigt, dass GABAerge PPN-Neuronen Synapsen auf SN-DA-Neuronen herstellen und dass ihre Aktivierung die explorative Fortbewegung beeinträchtigt und die Bewegungsinitiierung stoppt, jedoch keine Einfrierreaktionen hervorruft [69]. Insgesamt dürften unterschiedliche GABAerge Projektionen vom LDTg und PPN zum VTA bzw. SN komplementäre Signale vermitteln, die Angst und motorische Reaktionen auslösen. Zukünftige Arbeiten sind erforderlich, um die mögliche Rolle des GABAergen PPN→SN-Signalwegs als Reaktion auf aversive Reize wie Fußstöße und einen mutmaßlichen Crosstalk zwischen diesen parallelen Hirnstammprojektionen zu verstehen.

Die Aufdeckung modulatorischer Regionen wie der hier beschriebenen ist von entscheidender Bedeutung, um natürliche Reaktionen auf Bedrohungsreize zu verstehen. Wichtig ist, dass der hier identifizierte Weg auf die Induktion des unbedingten Einfrierens beschränkt war und keine aversive Gedächtnisbildung hervorrief. Darüber hinaus könnte uns das Verständnis der synaptischen und zellulären Anpassungen dieser Schaltkreise dabei helfen, die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen, die zu den Symptomen pathologischer Erkrankungen beitragen. Zukünftige Studien müssen die molekularen Aktoren identifizieren, die die (Fehl-)Anpassungen dieser Schaltkreise antreiben, um sie mit klassischen pharmakologischen Medikamenten angreifen zu können. Alternativ könnten künftige Therapieansätze mit Gehirnmodulationstechniken von den vorliegenden Erkenntnissen profitieren.

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Referenzen herunterladen

Wir danken EJ Kremer und der Plateforme de Vectorologie de Montpellier für die Bereitstellung von CAV-2-Cre. Wir danken Jean-Charles Paterna und Melanie Rauch sowie der Zurich Vector Core-Einrichtung für die Bereitstellung mehrerer Flippase-abhängiger Viren. Wir danken Dr. Massimo Mantegazza für die Bereitstellung von vGAT-Cre-Mäusen. Wir danken allen Mitarbeitern der Tierhaltung für die technische Unterstützung.

Diese Arbeit wurde vom Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), der Université Côte d'Azur, dem Labex Signalife, der Fédération pour la Recherche sur le Cerveau und Rotary – Espoir en Tête, der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM) unterstützt DEQ20180339159) und Agence Nationale de la Recherche (ANR-20-CE37-0017) an JB. LB ist Empfänger eines Ph.D. Stipendium des FRM sowie einen Ph.D. im vierten Jahr. Stipendium des FRM (FDT201904007874). TC ist ein Doktorand im vierten Jahr. Stipendium des FRM (FDT202106012968). LR ist Empfänger eines Ph.D. Stipendium des FRM.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Loïc Broussot, Thomas Contesse.

Diese Autoren haben diese Arbeit gemeinsam betreut: Sebastian P. Fernandez, Jacques Barik.

Universität der französischen Riviera, Nizza, Frankreich

Loïc Broussot, Thomas Contesse, Renan Costa-Campos, Leah Royon, Hugo Fofo, Sebastian P. Fernandez und Jacques Barik

CNRS UMR7275, Institut für Molekular- und Zellpharmakologie, Valbonne, Frankreich

Loïc Broussot, Thomas Contesse, Renan Costa-Campos, Leah Royon, Hugo Fofo, Thomas Lorivel, Sebastian P. Fernandez und Jacques Barik

CNRS, IMN, UMR 5293, Universität Bordeaux, Bordeaux, Frankreich

Christelle Glangetas und Francois Georges

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LB, TC und LR führten Verhaltensexperimente durch. LB, TC und HF führten Mikroskopie durch. SPF und RCC führten Ex-vivo-Aufzeichnungen durch. CG und FG führten elektrophysiologische In-vivo-Aufzeichnungen durch. TL leistete technische Unterstützung für Verhaltensanalysen. LB, SPF und JB haben das Projekt entworfen und die Arbeit geschrieben. Alle Autoren gaben Feedback zum Verfassen der Arbeit.

Korrespondenz mit Sebastian P. Fernandez oder Jacques Barik.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Broussot, L., Contesse, T., Costa-Campos, R. et al. Ein nicht-kanonischer GABAerger Weg zum VTA fördert das unbedingte Einfrieren. Mol Psychiatry 27, 4905–4917 (2022). https://doi.org/10.1038/s41380-022-01765-7

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Eingegangen: 31. Mai 2021

Überarbeitet: 09. August 2022

Angenommen: 22. August 2022

Veröffentlicht: 20. September 2022

Ausgabedatum: Dezember 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41380-022-01765-7

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