Konservierte subkortikale Verarbeitung im visuellen Bereich

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 4699 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die Blickstabilisierung gleicht Bewegungen des Kopfes oder der äußeren Umgebung aus, um Bildunschärfen zu minimieren. Multisensorische Informationen stabilisieren die Szene auf der Netzhaut über die vestibulookularen (VOR) und optokinetischen (OKR) Reflexe. Während die Organisation der dem VOR zugrunde liegenden neuronalen Schaltkreise bei allen Wirbeltieren gut beschrieben ist, ist über den Beitrag und die Entwicklung des OKR und die Grundstrukturen, die die visuell-vestibuläre Integration ermöglichen, weniger bekannt. Um diese neuronalen Bahnen zu analysieren, die der visuell-vestibulären Integration zugrunde liegen, haben wir einen Aufbau entwickelt, der ein Neunauge-Auge-Gehirn-Labyrinth-Präparat verwendet, das die Koordinierung elektrophysiologischer Aufzeichnungen, der Vestibularstimulation mit einer beweglichen Plattform und der visuellen Stimulation über Bildschirme ermöglicht. Neunaugen weisen eine robuste visuell-vestibuläre Integration auf, wobei optokinetische Informationen im Prätektum verarbeitet werden, die vom Tektum herunterreguliert werden können. Visuelle und vestibuläre Eingaben werden auf mehreren subkortikalen Ebenen integriert. Zusätzlich treten Sakkaden in Form eines Nystagmus auf. Somit waren alle grundlegenden Komponenten der visuell-vestibulären Blickkontrolle bereits zu Beginn der Wirbeltierentwicklung vorhanden.

Das Erscheinen bildgebender Augen ermöglichte es Tieren, das Sehvermögen für fortgeschrittene Verhaltensrepertoires zu nutzen, die Mechanismen zur Stabilisierung der Welt in der Netzhaut erforderten, um eine Verschlechterung des Bildes zu verhindern1. Bei Wirbeltieren wird die visuelle Stabilisierung durch zwei Reflexe erreicht, von denen angenommen wird, dass sie sich parallel entwickelt haben1,2. Kopfbewegungen rufen kompensatorische Verschiebungen der Augen hervor, die durch vestibuläre Signale über den Vestibulookularreflex (VOR) vermittelt werden. Beim optokinetischen Reflex (OKR) wird der optische Fluss der Netzhaut an die Augenmuskeln zurückgekoppelt und erzeugt so Ausgleichsbewegungen zur Stabilisierung des Bildes. Komplementäre somatosensorische Eingaben tragen ebenfalls zur Bildstabilisierung bei3,4. Darüber hinaus ermöglichen Folgeentladungen dem Gehirn, passive von aktiv erzeugten Kopfbewegungen zu unterscheiden5. VOR und OKR wirken zusammen, um die durch Kopfbewegungen verursachten Störungen zu kompensieren und zu einer robusten Kontrolle der Augenbewegungen beizutragen. Mit zunehmender Geschwindigkeit der Kopfbewegung wird der vestibuläre Beitrag dominant6,7.

Trotz des Einflusses, den die visuelle Bewegung auf die Blickstabilisierung hat, wurde der Beitrag dieses Systems im Vergleich zum Vestibularsystem am wenigsten untersucht. Das neuronale Substrat von OKR liegt im prätektalen Bereich/akzessorischen optischen System der untersuchten Wirbeltiere8,9, aber die neuronalen Mechanismen, durch die visuelle Großfeldbewegungen das OKR erzeugen, und sein evolutionärer Ursprung sind kaum verstanden. Der VOR trat dagegen schon sehr früh während der Evolution der Wirbeltiere auf, und obwohl es unterschiedliche artspezifische Konfigurationen geben kann, ist der disynaptische Schaltkreis, der Vestibularinformationen in die entsprechende kompensatorische Augenbewegung umwandelt, bei allen Wirbeltieren vorhanden10.

Die Blickstabilisierung stellt einen grundlegenden motorischen Befehl dar, jedoch haben sich nur wenige Studien mit dem Beitrag befasst, der sich aus VOR- und OKR-Interaktionen ergibt. Die visuell-vestibuläre Integration wurde hauptsächlich auf der Ebene des Kortex und des Kleinhirns analysiert11, anstatt sich auf die subkortikale Verarbeitung zu konzentrieren, die für VOR/OKR von grundlegender Bedeutung ist. Wir analysieren hier stabilisierende Augenbewegungen beim Neunauge, dem ältesten lebenden Wirbeltier, und die neuronalen Bahnen, die für die multisensorische Integration verantwortlich sind. Obwohl sich die Netzhautorganisation im Vergleich zu Gnathostomen nur geringfügig unterscheidet12, verfügen Neunaugen über gut entwickelte bildgebende Kameraaugen, und die Organisation der Augenmuskeln und motorischen Kerne ist denen anderer Wirbeltiere bemerkenswert ähnlich1,13,14,15. Sie weisen VOR16 und ein gut entwickeltes Vestibularsystem auf, das ein Labyrinth mit zwei halbkreisförmigen Kanälen (anterior und posterior) aufweist, die als homolog zu ihren Gnathostom-Gegenstücken gelten, während ihnen ein seitlicher horizontaler Kanal fehlt17,18,19. Allerdings verfügen Neunaugen über ein horizontales Kanalsystem, das auch in der Gierebene Informationen über den Vestibulärbereich liefert, das sich offenbar parallel zum horizontalen Kanal des Gnathostoms entwickelt hat17,18,19. Das Neunauge-Labyrinth ist daher in der Lage, kompensatorische Augen- und Körperbewegungen in der Gierebene zu erzeugen, indem es dieselbe Gehirnschaltkreisarchitektur nutzt, die für Roll- und Nickrotationen verantwortlich ist20. Ob Neunaugen optokinetische Augenbewegungen haben, ist noch unklar. Die Tatsache, dass sie sowohl im Tektum als auch im visuellen Kortex eine retinotopische Darstellung haben und die Augenbewegungen vom Tektum aus präzise gesteuert werden können, legt nahe, dass das Sehen zur Blickstabilisierung beitragen kann21,22,23,24,25,26.

Zusätzlich zur kompensatorischen langsamen Augenbewegung beinhalten VOR/OKR-Reaktionen Nystagmusschläge, eine schnelle Neueinstellung der Augenposition, die stattfindet, wenn die Augen die Grenze ihrer Reichweite innerhalb der Augenhöhle erreichen. Diese schnellen Reset-Bewegungen gelten als Ursprung von Sakkaden und bilden zusammen mit VOR und OKR den Bauplan, aus dem sich alle Arten von Augenbewegungen ableiten1,27. Obwohl Augenbewegungen durch elektrische Stimulation des Optic tectum oder des motorischen Bereichs im Pallium sowie durch die Präsentation visueller Reize hervorgerufen werden können21,24,28, ist noch nicht bekannt, ob Sakkaden vorhanden sind oder nicht.

In dieser Studie zeigen wir, dass das OKR im Neunauge vorhanden ist und dass seine primäre visuelle Verarbeitung im Prätektum stattfindet, das Informationen an die Okulomotorik- und Vestibulariskerne weiterleitet. Darüber hinaus war der bei Säugetieren berichtete starke additive Effekt zwischen OKR und VOR bereits beim Neunauge vorhanden, und visuelle und vestibuläre Signale werden auf mehreren subkortikalen Ebenen integriert, was jedoch darauf hindeutet, dass die visuo-vestibuläre Blickstabilisierung keine kortikale oder zerebelläre Verarbeitung erfordert kann durch Tectum herunterreguliert werden. Auch das Neunauge weist deutliche Nystagmusschläge auf, was zeigt, dass alle stabilisierenden Augenbewegungen bereits vorhanden waren, als das Neunauge von der Evolutionslinie abwich, die zu Säugetieren führte.

Um zu bestätigen, dass Neunaugen VOR16,29 aufweisen, führten wir Verhaltensexperimente durch und verfolgten die Augenbewegungen als Reaktion auf die Vestibularstimulation per Video. Intakte Tiere wurden in ein transparentes, mit kaltem Wasser gefülltes Röhrchen gegeben (Abb. 1a). Augenbewegungen wurden mit der DeepLabCut-Software30 verfolgt (Abb. 1b). Die Vestibularstimulation führte zu ausgeprägten kompensatorischen Augenbewegungen in den drei Ebenen (Rollen, Nicken und Gieren; N = 9; Abb. 1b – d; Zusatzfilme 1–3). Um den Gewinn des Auges im Verhältnis zur Kopfbewegung zu untersuchen, wurde ein Beschleunigungsmesser an der transparenten Röhre angebracht (N = 3). Das Rohr wurde dann in den drei Ebenen manuell mit Geschwindigkeiten zwischen 60 und 200 Grad/s manövriert, während das Neunaugenauge verfolgt wurde. Anschließend wurden die Augen- und Kopfpositionen aufgezeichnet (Abb. 1b – d) und hinsichtlich ihrer räumlichen und zeitlichen Ausrichtung verglichen (ergänzende Abb. 1a). Der dynamische Gewinn wurde durch Vergleich der Augen-Kopf-Geschwindigkeiten berechnet (siehe Methoden). Die Verstärkung betrug 0,77 ± 0,19 für die Rollbewegung, 0,6 ± 0,23 für die Nickbewegung und 0,69 ± 0,13 für die Gierbewegung. Der Positionsgewinn wurde durch Vergleich der Fläche unter der Kurve (AUC) zwischen Auge und Kopf während der aktiven Bewegung ermittelt. Die Verstärkungswerte betrugen 0,67 ± 0,16 für Roll, 0,45 ± 0,16 für Nick und 0,64 ± 0,25 für Gier.

Eine schematische Darstellung des Aufbaus zur Überwachung von VOR-Augenbewegungen. b–d (oben) Repräsentative Bilder vor (links) und auf dem Höhepunkt der Stimulation (rechts) als Reaktion auf Drehungen in den Ebenen Roll (a), Gier (b) und Nick (c) (Maßstabsbalken = 1 mm) . Die rot gestrichelte Linie zeigt die Augenposition vor der Stimulation und die grün gepunktete Linie die Position auf dem Höhepunkt der vestibulären Stimulation. Die farbigen Punkte in den Bildern stellen die Beschriftungen dar, die das Trackingsystem zur Berechnung der Augenbahn verwendet. (Unten) Spuren, die die Augenposition (schwarz) im Verhältnis zur Kopfposition während mehrerer Drehungen in den Roll- (grün), Gier- (rot) und Nick-Ebenen (blau) darstellen. e–g Schematische Darstellungen der Neunauge-Kippplattform. Das System wird über Matlab gesteuert und ermöglicht synchronisierte visuelle und vestibuläre Stimulationen über eine Arduino-Controllerplatine, die auch einen Digitalisierer für elektrophysiologische Aufzeichnungen aktiviert. Die Plattform wird mit einem Servomotor bewegt, der von einem anderen Arduino-Board gesteuert wird und die transparente Kammer dreht, die das Präparat zusammen mit den Aufzeichnungselektroden enthält. Eine transparente Kammer (die ein Auge-Labyrinth-Gehirn-Präparat enthält), die mit einer Kippplattform verbunden ist, wird von vorne (e) und von der Seite (f) aus gesehen zwischen zwei Bildschirmen platziert. Eine Gesamtdarstellung der Plattform ist in g dargestellt. h Schematische Darstellung des Präparats zur Aufzeichnung der Aktivität der Augenmuskulatur oder verschiedener Gehirnbereiche. Die roten Quadrate zeigen die Lage der Ohrkapseln an, in denen sich die Vestibularorgane befinden. Links ist eine repräsentative Kurve dargestellt, die die Aktivität zeigt, die als Reaktion auf eine Neigung der Plattform um 22,7° mit einer Winkelgeschwindigkeit von 112,94°/s in Kombination mit einer koordinierten visuellen Stimulation hervorgerufen wurde. Rechts sind ähnliche Aufnahmen zu sehen, die durch eine optokinetische Stimulation mit 48,71°/s (oben) und eine vestibuläre Stimulation in der Dunkelheit mit derselben Geschwindigkeit und einer Amplitude von 5,8° (unten) hervorgerufen wurden. Der blaue Bereich zeigt die Dauer der Rollbewegung an, gelb die Dauer der statischen Neigung und das gepunktete Rechteck zeigt die laufende optokinetische Stimulation an. Abkürzungen: RR Rektus rostral, DR Rektus dorsale, CR Rektus kaudal, aCSF künstliche Liquor cerebrospinalis.

Bei intakten Tieren konnten wir das VOR-Verhalten untersuchen, aber die Analyse des Beitrags visueller und vestibulärer Informationen, die lange Experimente erforderte, war bei intakten Tieren nicht möglich (siehe Methoden). Um die Interaktion zwischen visuellen und vestibulären Eingaben zu untersuchen, wurde daher ein Aufbau entwickelt, der koordinierte visuelle und vestibuläre Reize über eine Kippplattform ermöglicht und gleichzeitig elektrophysiologische Aufzeichnungen in einem isolierten Präparat des Neunauge-Gehirns und des rostralen Rückenmarks mit den Augen und Vestibularorganen (otisch) durchführt Kapseln) (Abb. 1e–g, Zusatzfilm 4). Visuelle Reize bestanden aus horizontalen Balken, die sich entlang der vertikalen Achse in entgegengesetzte Richtungen bewegten (dh wenn sich Balken für das rechte Auge nach oben bewegten, bewegten sich die Balken für das linke Auge nach unten), was visuelle Eingaben während einer Körperdrehung widerspiegelte. Das okulo-vestibuläre Gehirnpräparat wurde auf die rotierende Plattform ausgerichtet, um eine vestibuläre Stimulation in der Rollebene zu erzeugen.

Um die Lebensfähigkeit des Präparats zu überprüfen, wurde vorne eine Videokamera angebracht, die zeigt, dass VOR-Augenbewegungen als Reaktion auf die Rollstimulation hervorgerufen werden (ergänzende Abbildung 1b). Um VOR während der gesamten Studie zuverlässig zu quantifizieren, führten wir EMG-Aufzeichnungen des extraokularen Muskels des dorsalen Rektus (DR; Abb. 1h) durch. Dieser Muskel wurde durch die Abwärtsrollstimulation konsistent aktiviert, in Übereinstimmung mit einer kompensatorischen Augenbewegung in die entgegengesetzte Richtung der vestibulären Stimulation. Abbildung 1h (grüne Kurve) zeigt eine repräsentative Reaktion auf eine kombinierte visuelle und vestibuläre Stimulation (siehe auch Zusatzfilm 5). Zuverlässige Reaktionen wurden durch isolierte optokinetische (Abb. 1h, blaue Kurve) oder vestibuläre Stimulation (Abb. 1h, orangefarbene Kurve) induziert. Als die Plattform wieder in eine horizontale Position zurückkehrte, wurde keine Aktivität hervorgerufen (Abb. 1h, grüne Linie, rotes Sternchen), was darauf hindeutet, dass die Muskelaktivierung einem VOR in dieser Ebene entspricht. Um sicherzustellen, dass die in den Extraokularmuskeln aufgezeichnete EMG-Aktivität zuverlässig den Augenbewegungen entsprach, führten wir elektrische Stimulationen mit zunehmender Intensität im vorderen Oktavmotorkern (AON; einer der an VOR beteiligten Vestibularkerne, siehe unten) durch, während wir die EMG-Aktivität aufzeichneten des dorsalen Rektus und gleichzeitige Videoaufzeichnung der Augenbewegungen (Ergänzende Abbildung 1c; N = 2). Die EMG-Aktivität nahm parallel zur Amplitude der Augenbewegungen zu (Ergänzungsabbildung 1c – e; Ergänzungsfilm 6) und kann somit zur indirekten Messung von Augenbewegungen verwendet werden.

Mit dieser experimentellen Plattform konnten wir Augenbewegungen überwachen und extrazelluläre Aktivitäten in verschiedenen Gehirnbereichen als Reaktion auf eine vestibuläre und/oder visuelle Stimulation aufzeichnen.

Obwohl gezeigt wurde, dass visuelle Reize (drohende Punkte und Balken, die einem Auge präsentiert werden) Augen- und Orientierungs-/Ausweichbewegungen hervorrufen24,25, wurde beim Neunauge kein OKR nachgewiesen. Um dies zu testen, verwendeten wir ein Gitter aus Stäben, die sich in den drei Hauptachsen (Rollen, Nicken und Gieren) mit zunehmender Geschwindigkeit bewegten, und überwachten die EMG-Aktivität im dorsalen Rektus (für Roll- und Nickstimulation) oder im kaudalen Rectus (für Gieren). Stimulation).

Als Reaktion auf eine Erhöhung der Rollgeschwindigkeit kam es zu einem signifikanten Anstieg der Amplitude und der Spitzenzahlen der EMG-Aktivität (n = 18 von sechs Neunaugen). Die Diagramme in Abb. 2a zeigen, dass die Reaktionen in Bezug auf EMG-Amplituden (links) und Spitzen (rechts) parallel zur Geschwindigkeit der Stimulation zunehmen (siehe repräsentative Kurven in Abb. 2b). In Abb. 2e sind die kombinierten Daten von sechs Tieren dargestellt. Das Gleiche galt für die in der Nickebene hervorgerufene Aktivität (n = 15 von fünf Neunaugen, Abb. 2f). Sowohl die EMG-Amplituden (Abb. 2c, links) als auch die Anzahl der Spitzen (Abb. 2c, rechts; siehe repräsentative Kurven in Abb. 2d) nahmen mit der Stimulationsgeschwindigkeit zu. Überraschenderweise wurde kein signifikanter Effekt für Stimulationen in der Gierebene festgestellt, denen das Neunauge während jedes Schwimmzyklus ausgesetzt ist (Abb. 1g, h; N = 10). Obwohl visuelle Reaktionen hervorgerufen werden konnten, waren sie sehr unzuverlässig und es wurde kein offensichtlicher Anstieg parallel zur visuellen Reizgeschwindigkeit beobachtet (Abb. 2g, h). Dieselben Tiere zeigten zuverlässige OKR sowohl in der Roll- als auch in der Nickebene (Abb. 2i, ergänzende Abb. 2a, b). Auf diese Weise wurden eindeutige optokinetische Reaktionen in der Nick- und Rollebene ermittelt, die auf kompensatorische Augenbewegungen als Reaktion auf visuelle Bewegungen der gesamten Szene hinweisen.

a Grafische Darstellung der normalisierten EMG-Amplituden (links) und der Anzahl der Spitzen (rechts) der hervorgerufenen EMG-Aktivität im dorsalen Rektus eines Tieres während optokinetischer Stimulationen in der Rollebene über einen Geschwindigkeitsbereich hinweg. b Repräsentative Spuren bei drei verschiedenen Geschwindigkeiten während Rollstimulationen. Das gepunktete Rechteck gibt die Dauer der optokinetischen Stimulation an. c Diagramme, die die EMG-Aktivität im dorsalen Rektus eines Tieres während optokinetischer Stimulationen in der Nickebene über einen Geschwindigkeitsbereich hinweg zeigen. d Repräsentative Spuren bei drei verschiedenen Geschwindigkeiten während Tonhöhenstimulationen. e, f Mittlere EMG-Amplituden und -Spitzen, die die EMG-Aktivität im dorsalen Rektus als Reaktion auf optokinetische Stimulation in den Ebenen Roll (e) und Nick (f) widerspiegeln, wobei die Daten von sechs Tieren für Roll und fünf für Nick kombiniert werden. Eine ANOVA mit wiederholten Messungen zeigte signifikante Auswirkungen der Stimulationsgeschwindigkeit auf EMG-Amplituden (F[3, 51] = 7,858, p < 0,001) und Spitzen (F[3, 51] = 3,366, p = 0,026) auch in der Rollebene als EMG-Amplituden (F[4, 56] = 5,057, p = 0,001) in der Pitch-Ebene. g Diagramm, das zeigt, dass die EMG-Aktivität nicht parallel zur Geschwindigkeit der optokinetischen Stimulation in der Gierebene zunimmt. Repräsentative Spuren sind in h dargestellt. Zuverlässige optokinetische Reaktionen in der Rollebene wurden jedoch bei Tieren beobachtet, denen eine Reaktion in der Gierebene fehlte. Für alle Analysen wurden Holm-Korrekturen durchgeführt. Die schattierten Bereiche in den Diagrammen bezeichnen Fehlerbänder. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt. Die Rollebenenanalyse wurde an n = 52 unabhängigen Proben von drei Tieren durchgeführt, während die Nickebenenanalyse an n = 57 unabhängigen Proben von drei Tieren durchgeführt wurde.

Angesichts der Tatsache, dass sowohl visuelle als auch vestibuläre Eingaben zur Blickstabilisierung beitragen, war die nächste Frage, wie sich eine Kombination dieser beiden sensorischen Modalitäten auf die kompensatorischen Augenbewegungen auswirkt. Um dies zu testen, wurde die Aktivität des dorsalen Rektus als Reaktion auf visuelle (VIS), vestibuläre (VES) und visuovestibuläre (VISVES) Stimulation (Abb. 3a) unter vier unterschiedlichen Parametern in der Rollebene aufgezeichnet: niedrige Amplitude – niedrige Geschwindigkeit ( 5,8°; 48,7°/s; n = 24 von acht Neunaugen), niedrige Amplitude – hohe Geschwindigkeit (5,8°; 112,94°/s; n = 37 von 13 Neunaugen), hohe Amplitude – niedrige Geschwindigkeit (22,7°; 48,7°/ s; n = 24 von acht Neunaugen) und hohe Amplitude – hohe Geschwindigkeit (22,7°; 112,94°/s; n = 29 von zehn Neunaugen). Eine kontinuierliche optokinetische Stimulation wurde vorgestellt, um eine bessere Kontrolle über die hervorgerufenen Reaktionen und eine ganzheitliche Bewertung der visuell-vestibulären Integration zu ermöglichen. Die Analyse sowohl der anfänglichen dynamischen visuell-vestibulären Stimulation als auch der nachfolgenden Reaktionen, bei denen einem statischen Vestibularsignal nur eine dynamische visuelle Komponente auferlegt wurde, ermöglichte zeitliche Überlegungen und eine differenzierte Perspektive auf die Blickstabilität. Da zwischen den Tieren Unterschiede in der Signalstärke beobachtet wurden, wurden die Reaktionen bei jedem Tier auf die maximale Intensität normalisiert, was uns ermöglichte, die in den verschiedenen Präparaten erzielten Ergebnisse zu vergleichen und das Verhältnis zwischen sensorischen Modalitäten zu ermitteln.

a Eine schematische Darstellung der drei implementierten experimentellen Paradigmen: visuell (oben), vestibulär (Mitte) und visuovestibulär (unten). Pfeile zeigen die Bewegungsrichtung der Reize sowohl für die visuelle (grün) als auch für die vestibuläre Stimulation (schwarz) an. Eine Aufzeichnungselektrode wurde im rechten dorsalen Rektusmuskel platziert. b–e Diagramme, die die EMG-Aktivität in Bezug auf die Anzahl der Spikes als Reaktion auf visuelle (VIS), vestibuläre (VES) und visuovestibuläre (VISVES) Stimulationen während vier verschiedener Stimulationsprotokolle in Bezug auf Amplitude und Geschwindigkeit zeigen. Die Amplitude bezieht sich auf den maximalen Neigungswinkel der Plattform und die Geschwindigkeit auf die Bewegungsgeschwindigkeit der Plattform oder des visuellen Reizes. Die Signifikanz zwischen den Modalitäten wird durch Sterne in jedem Diagramm dargestellt und wurde durch gepaarte T-Tests ermittelt: Niedrige Amplitude, niedrige Geschwindigkeit (VES zu VISVES t(23) = −4,802, p < 0,001; n = 24 Aufzeichnungen von acht Tieren), niedrige Amplitude hohe Geschwindigkeit (VIS zu VES t(36) = −3,346, p = 0,002 p = 0,002 und VES zu VISVES t(38) = −2,930, p = 0,006 p = 0,006; n = 37 Aufnahmen von 13 Tieren), hohe Amplitude niedrige Geschwindigkeit (VIS zu VES t(22) = −11,559, p < 0,001, p < 0,001; n = 24 Aufnahmen von acht Tieren), hohe Amplitude, hohe Geschwindigkeit (VIS zu VES t(27) = −13,808, p < 0,001 ; n = 29 Aufnahmen von zehn Tieren). f–i Diagramme, die die EMG-Aktivität in Bezug auf maximale Amplituden als Reaktion auf VIS-, VES- und VISVES-Stimulationen während vier verschiedener Stimulationsprotokolle zeigen ((g) VES bis VISVES t(38) = −2,475, p = 0,018, n = 37 Aufzeichnungen von 13 Tiere; (h) VIS zu VES t(23) = −6,315, p < 0,001, n = 24 Aufnahmen von acht Tieren; VES zu VISVES t(22) = −2,614, p = 0,016 und (i) VIS zu VES t(28) = −15,457, p < 0,001, n = 29 Aufnahmen von zehn Tieren). j, k Repräsentative Antworten für die niedrigste (j) und die höchste Intensität (k). Der blaue Bereich zeigt die Dauer der Rollbewegung an, gelb die Dauer der statischen Neigung und das rot gepunktete Rechteck zeigt die laufende optokinetische Stimulation an. Alle T-Tests waren zweiseitig und ohne Korrekturen. In der gesamten Abbildung werden die Daten als Mittelwerte ± SD dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Die einzelnen VIS- und VES-Reaktionen waren ähnlich, aber bei gemeinsamer Anwendung war die VISVES-Aktivität viel größer und verstärkten sich somit gegenseitig (Abb. 3b, f, j). Gepaarte T-Tests ergaben einen signifikanten Unterschied in der Anzahl der hervorgerufenen Spitzen zwischen VES und VISVES (Abb. 3b, j), jedoch nicht in der EMG-Amplitude (Abb. 3f).

Visuelle und vestibuläre Reaktionen verstärken sich auch unter diesen Bedingungen gegenseitig, wie aus den signifikanten Unterschieden zwischen VES und VISVES hinsichtlich der Anzahl der hervorgerufenen Spitzen hervorgeht (Abb. 3c, ergänzende Abb. 3a), und die maximale EMG-Amplitude stieg zwischen VES und signifikant an VISVES (Abb. 3g). Die VES-Anzahl der Spikes war signifikant größer als die VIS-Anzahl, was auf einen größeren Beitrag der vestibulären sensorischen Informationen hinweist (Abb. 3c, ergänzende Abb. 3a).

Die vestibuläre Reaktion war viel größer als die VIS-Reaktion, und die Zugabe von VIS trug nicht wesentlich zur VISVES-Reaktion bei, wenn man die Anzahl der Spitzen vergleicht (Abb. 3d, ergänzende Abb. 3b), aber wenn man die EMG-Amplitude berücksichtigt (Abb. 3h). ) VIS wurde deutlich zu VES hinzugefügt.

In diesem Fall dominierte die vestibuläre Reaktion und es gab keine signifikante visuelle Ergänzung der kombinierten VISVES-Reaktion (Abb. 3e, i, k).

Die obigen Ergebnisse zeigen, dass gemeinsame visuell-vestibuläre Stimulationen die Reaktionen verstärken, die visuelle Wirkung jedoch bei Bewegungen mit geringer Amplitude relevanter ist. Zusammen mit der Tatsache, dass überschwellige VIS-Reaktionen nur zu Beginn der visuellen Stimulation hervorgerufen werden, legt dies nahe, dass ihre Rolle zu Beginn der kompensatorischen Augenbewegungen wichtiger ist. Das Sehvermögen trägt dazu bei, indem es die Anzahl der hervorgerufenen Spitzen erhöht (Abb. 3b – e), wohingegen die EMG-Amplituden des integrierten Signals nur während der Bedingungen mit niedriger Amplitude – hoher Geschwindigkeit und hoher Amplitude – niedriger Geschwindigkeit signifikant beeinträchtigt wurden (Abb. 3f – i). Dieser Unterschied lässt sich erklären, wenn man den Zeitpunkt berücksichtigt, zu dem die maximale EMG-Amplitude für jede sensorische Modalität erreicht wird. Bei Bedingungen mit geringer Amplitude erschien der visuelle Höhepunkt später als der vestibuläre (Abb. 4a–d), und diese Fehlausrichtung führt zu einer geringeren Auswirkung des Sehvermögens in Bezug auf die EMG-Reaktionsamplitude. Die Spitzen-EMG-Amplituden von VISVES waren, wie zuvor beschrieben, bei der Hälfte der Erkrankungen größer als die von VES (Abb. 3f – i), obwohl sie bei allen Erkrankungen in Richtung des Zeitpunkts des visuellen Höhepunkts verschoben waren (Abb. 4a – d).

a–d Diagramme, die die durchschnittliche Zeit zeigen, die benötigt wird, um die maximale EMG-Amplitude für jede Modalität während der verschiedenen Paradigmen zu erreichen. Gepaarte T-Tests ergaben Signifikanzergebnisse für: Niedrige Amplitude, niedrige Geschwindigkeit (VIS zu VES t(16) = 5,506, p < 0,001, n = 17 Aufnahmen von acht Tieren), niedrige Amplitude, hohe Geschwindigkeit (VIS zu VES t(23) = 10,871, p < 0,001, n = 24 Aufnahmen von elf Tieren und VES zu VISVES t(30) = −3,411, p = 0,002, n = 31 Aufnahmen von elf Tieren), Hohe Amplitude, hohe Geschwindigkeit (VES zu VISVES t(28) = 2,818, p = 0,009, n = 29 Aufnahmen von zwölf Tieren). e Wärmekarten, die die Spitzenaktivität während vier verschiedener Paradigmen für ein repräsentatives Tier veranschaulichen. Die Werte wurden auf den Cluster mit der höchsten Dichte normiert. Dunkelblau bedeutet keine Spitzen, während Gelb die größte Anzahl an Spitzen anzeigt. Jedes Segment zeigt die Spitzenaktivität in einem 100-ms-Fenster und kombiniert die gemittelten Daten aus drei verschiedenen Versuchen. Alle T-Tests waren zweiseitig und ohne Korrekturen. In der gesamten Abbildung werden die Daten als Mittelwerte ± SD dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Um die Dynamik des visuellen Beitrags über das gesamte Ausmaß der Stimulation zu erfassen, haben wir die Anzahl der unter jeder der drei Bedingungen (VIS, VES und VISVES) hervorgerufenen Spitzen in Fenstern von 100 ms analysiert, wie in den Heatmaps von Abb. 4e dargestellt. Ein klarer Effekt bestand darin, dass die VISVES-Reaktionen im Vergleich zu nur VES verlängert waren (siehe auch Kurven in Abb. 3j, k und ergänzende Abb. 3a, b). Beim Vergleich von VISVES mit VES-Studien kam es zu einem Anstieg der Anzahl hervorgerufener Spitzen, noch bevor eine Aktivität auftrat, die nur durch visuelle Stimulation hervorgerufen wurde. Somit wurde durch VIS ein unterschwelliger Anstieg der Erregbarkeit hervorgerufen, der die vestibulären Reaktionen verstärken konnte (siehe auch Abb. 3j, k und ergänzende Abb. 3a, b). Obwohl die ersten visuellen Spitzen im Vergleich zu den vestibulären Reaktionen spät auftreten (Abb. 4a–d), wirkt sich das Sehvermögen frühzeitig aus, wenn beide Sinnesmodalitäten kombiniert werden, und sein Beitrag verlängert die hervorgerufenen Reaktionen. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass gemeinsame visuell-vestibuläre Stimulationen die Reaktionen verstärken, die visuelle Wirkung jedoch bei Bewegungen mit geringer Amplitude größer ist. Dieser Befund und die Tatsache, dass überschwellige VIS-Reaktionen nur zu Beginn der visuellen Stimulation hervorgerufen werden, legen nahe, dass ihre Rolle zu Beginn der kompensatorischen Augenbewegungen besonders wichtig ist.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Interaktion zwischen visuellen und vestibulären Eingaben die Augenbewegungen bestimmt, die der Blickstabilisierung zugrunde liegen. Um die verschiedenen Gehirnregionen zu identifizieren, die zu visuellen und/oder vestibulären Informationen zur Blickstabilisierung beitragen, haben wir die Eingaben in den Nucleus oculomotorius (nIII) ​​analysiert, der den dorsalen Rektus innerviert und das letzte Integrationsrelais vor der Bewegungsinitiierung der vestibulären Stimulation darstellt ( Die Verbindungen sind in der ergänzenden Abbildung 4a – h zusammengefasst. Einige der an VOR beteiligten Signalwege wurden in Neunaugenlarven analysiert17,20,31, es liegen jedoch keine Daten für Erwachsene vor.

Neurobiotin-Injektionen in den nIII (N = 4; Abb. 5a-Einschub) zeigten, dass sich die am weitesten rostral zu diesem Kern projizierende Population im ipsilateralen Thalamus befindet (Abb. 5a). Einige Neuronen wurden auch im kontralateralen Thalamus gefunden (nicht gezeigt). Zahlreiche Neuronen wurden retrograd im ipsilateralen Prätektum markiert (Abb. 5b), einige auch kontralateral. Injektionen in das Prätektum (N = 2) zeigten zahlreiche Terminals im Okulomotorikkern (nicht gezeigt), was die direkten prätektalen Projektionen auf diesen Kern bestätigte. Projektionen wurden auch vom Kern des medialen Längsfasciculus (nMLF; Abb. 5c) und des SNc32 (Abb. 5c) beobachtet. Im optischen Tectum wurden keine retrograd markierten Neuronen beobachtet, was darauf hindeutet, dass die von diesem Bereich aus gesteuerten Augenbewegungen21 wie bei anderen Wirbeltieren über Relaiskerne (vermutete Blickzentren) vermittelt werden33. Rhombenzephalische Projektionen zum nIII entstehen durch kleine Neuronen, die sich im Bereich der motorischen Kerne des Trochlea (nIV, Abb. 5d) und des Abducens (nVI, Abb. 5e) befinden31. Die auffälligste Markierung wurde im kontralateralen vorderen Oktavmotorkern gefunden, wo große retrograd markierte Neuronen gefunden wurden (Abb. 5f; siehe auch Lit. 17 und 20). Es konnte beobachtet werden, dass sich grobe Fasern, die aus diesem Kern stammen, auf verschiedenen Ebenen kreuzen, ebenso wie einige Neuronen auf der ipsilateralen Seite (nicht gezeigt). Diese Ergebnisse zeigen, dass nIII Informationen vom Prätektum bzw. vom Vestibulariskern erhält.

Ein Neurobiotin wurde in den Okulomotorikkern (Einschub) injiziert, der ipsilaterale Projektionen vom Thalamus zeigte. b Im Prätektum wurden zahlreiche retrograd markierte Zellen gefunden, die eine Population bildeten, die zum ipsilateralen Okulomotorikkern projizierte. c Retrograde Neuronen im Bereich des nMLF. Einige retrograd markierte Neuronen wurden auch im SNc beobachtet (Pfeile). d, e Projektionen wurden auch von den beiden anderen Hirnnervenkernen gefunden, die für die extraokulare Muskelinnervation verantwortlich sind, hier dargestellt durch eine Zellpopulation im Trochlea-Kern (d) und im kontralateralen Abducens-Kern (e). Retrograd markierte Neuronen wurden auch im ventralen Teil der Isthmusregion gefunden, in der Nähe der dicken Axone, die vom AON aus markiert wurden. (d Pfeile). Eine starke Projektion wurde vom AON bestätigt17,20 und retrograd markierte Neuronen wurden auch in den dorsalen Aspekten des OLA gefunden. Abkürzungen: Th Thalamus, Hyp Hypothalamus, pc hintere Kommissur, PT Pretectum, ot Optic Tract, nMLF Nucleus of the Medial Longitudinal Fasciculus, SNc, Substantia Nigra Pars Compacta, nIV Trochlear Motor Nucleus, AON Anterior Octavomotor Nucleus, OLA Octavolateral Area, ION Intermediate Oktavmotorischer Kern, nVI Abducens-Motorkern. Maßstabsbalken = 250 µm in a (und Einschub) und e; 100 µm in b und c; 150 µm in d und f.

Die anatomischen Ergebnisse und Daten bei anderen Wirbeltieren legen nahe, dass Pretectum den Hauptbeitrag zu visuellen Informationen für OKR8,9 leistet. Allerdings spielt Tectum eine Schlüsselrolle bei der visuellen Verarbeitung21,22,23,25 und deshalb wollten wir herausfinden, welche Region den Hauptbeitrag leistet. Wir ergänzten die Tracer-Injektionen durch eine akute Inaktivierung dieser beiden Gehirnbereiche, um die Auswirkungen der optokinetischen Stimulation auf die Aktivität des dorsalen Rektus zu sehen.

Bei Inaktivierung des Tectums (N = 5) blieb die OKR-Reaktion intakt (Abb. 6a, rote Kurve). Im Gegensatz dazu wurden die OKR-Reaktionen abgeschafft, wenn Pretectum entweder durch eine Läsion (N = 3; Abb. 6a, blaue Spur) oder eine Injektion des Glutamatrezeptor-Antagonisten Kynurensäure (KA; N = 3; Abb. 6b, rote Spur, Reaktionen) inaktiviert wurde Erholung nach dem Auswaschen, grüne Spur), auch wenn das Tectum intakt war. Das Diagramm in Abb. 6c zeigt, dass es nach der KA-Injektion in Pretectum zu einer signifikanten Verringerung des OKR kommt (t(6) = 2,633, p = 0,036) und dass sich das OKR nach dem Auswaschen deutlich erholt (t(3) = −3,703, p = 0,034).

a EMG-Reaktionen im dorsalen Rektus auf optokinetische Stimulation in einem intakten Gehirn (schwarze Kurve) und nach präziser Inaktivierung des visuellen Inputs für Tectum (rote Kurve) und Prätektum (blaue Kurve). b EMG-Reaktionen im dorsalen Rektus auf einen visuellen Reiz in einem intakten Gehirn (schwarze Kurve) und nach präziser pharmakologischer Inaktivierung mit Kynurensäure von Pretectum, die zur Aufhebung des optokinetischen Reflexes führen (rote Kurve), der nach einem Auswaschen wieder zurückkehrte (grüne Kurve). ). Das rot gepunktete Rechteck zeigt die Dauer der visuellen Stimulation an. c Diagramm, das die signifikante Verringerung der dorsalen Rektusaktivität als Reaktion auf optokinetische Stimulation nach prätektaler Inaktivierung mit Kynurensäure (KA; t(6) = 2,633, p = 0,039, n = 7 Aufzeichnungen von drei Tieren) und die signifikante Erholung nach dem Auswaschen zeigt (t(3) = −3,703, p = 0,034, n = 4 Aufnahmen von drei Tieren). Der schattierte Bereich kennzeichnet Fehlerbänder. d Diagramme, die die normalisierten EMG-Amplituden (links) und Spitzen (rechts) für visuelle (VIS), vestibuläre (VES) und visuovestibuläre (VISVES) Stimulationen in der Rollebene nach tektaler Inaktivierung zeigen. Gepaarte T-Tests zeigten signifikante Unterschiede in der Anzahl der hervorgerufenen Spitzen zwischen VIS und VES (t(13) = –3,277, p = 0,006, n = 14 Aufzeichnungen von fünf Tieren) und VES und VISVES (t(14) = –2,740). , p = 0,016, n = 15 Aufnahmen von 5 Tieren) sowie in maximalen EMG-Amplituden (VIS zu VES t(14) = −3,717, p = 0,002; und VES zu VISVES t(14) = −2,917, p = 0,011; n = 15 Aufnahmen von fünf Tieren für beide). e Neunauge-Augenbewegungsreaktionen auf VIS-, VES- und VISVES-Stimulationen in der Rollebene während der tektalen Inaktivierung, wie durch repräsentative EMG-Aufzeichnungen im dorsalen Rektus widergespiegelt. f VISVES-Antworten waren nach tektaler Inaktivierung sowohl für Amplituden (t(14) = −3,005, p = 0,009, n = 15 Aufzeichnungen von fünf Tieren) als auch für Spitzen (t(13) = −2,469, p = 0,028, n =) signifikant größer 14 Aufnahmen von fünf Tieren). Alle T-Tests wurden ohne Korrekturen mit einem T-Tail versehen. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Im Pallium des Neunauges ist ein Homolog des visuellen Kortex vorhanden, dessen Sehvermögen retinotopisch dargestellt wird26, und die elektrische Stimulation dieser Region erzeugt Augenbewegungen28. Es wurde kein signifikanter Einfluss auf die durch optokinetische Stimulation hervorgerufenen visuellen Reaktionen nach einer Läsion des visuellen Bereichs beobachtet, was darauf hinweist, dass das Pallium nicht direkt an der Erzeugung von OKR beteiligt ist (ergänzende Abbildung 4i; n = 12 von vier Neunaugen).

Anschließend analysierten wir die Veränderungen der visuell-vestibulären Integration nach der Läsion des Tectums, um zu sehen, ob visuelle Informationen aus dem Pretectum immer noch einen Einfluss auf die vestibulären Reaktionen hatten. Die VISVES-Antworten waren immer noch deutlich größer als nur die VES-Antworten (Abb. 6d, e), was darauf hindeutet, dass diese Verstärkung nicht vom Tectum abhängt. Das Prätektum scheint daher eine Schlüsselrolle bei der Weiterleitung visueller Informationen an nachgeschaltete subkortikale Strukturen zu spielen und so die visuell-vestibuläre Integration zur Blickstabilisierung zu ermöglichen. Im Gegensatz zur prätektalen Läsion erhöhte die Inaktivierung des Tectums die Augenmuskelaktivität bei visuellen Reizen (Abb. 6a, rote Kurve). Dies zeigte sich in deutlich größeren EMG-Amplituden während VISVES-Versuchen nach der Läsion (Abb. 6f) und darin, dass dieser Peak früher erreicht wurde (reduziert von 0,23 ± 0,05 s auf 0,19 ± 0,02 s, t [12] = 2,881; p = 0,014). ). Folglich verbesserte die tektale Inaktivierung die visuovestibuläre Integration, was zu größeren EMG-Amplituden und kürzeren Reaktionszeiten führte.

Bei anderen Wirbeltieren beeinflusst das Sehen die Vestibulariskerne unabhängig von der Projektion auf die Okulomotorikkerne34,35,36. Wir haben untersucht, ob dies auch beim Neunauge zutrifft. Das Homolog der Vestibulariskerne wird in anteriore (AON), intermediäre (ION) und posteriore octavomotorische Kerne (PON) unterteilt. Die vestibulären Eingänge zum Nucleus oculomotorius, der den dorsalen Rektus innerviert, kommen von AON und ION (vorliegende Arbeit, 20). Wir führten daher extrazelluläre Aufnahmen in diesen beiden Kernen durch (Abb. 7a; n = 39 von 13 Neunaugen). In beiden Kernen löste die Gesichtsfeldrotationsstimulation Reaktionen aus (Abb. 7a; schwarze Kurve). Diese Reaktionen wurden durch die Inaktivierung von Pretectum (n = 9 von drei Neunaugen; ergänzende Abbildung 5a), jedoch nicht durch die Inaktivierung von Tectum (n = 9 von drei Neunaugen; Abb. 7a; rote Spur) und Pallium (n = 15 von) aufgehoben fünf Neunaugen; nicht abgebildet). Dies weist darauf hin, dass nur das Prätektum den Vestibulariskernen optokinetische Informationen liefert.

a (links) Aufzeichnungen im AON als Reaktion auf optokynetische Stimulation unter normalen Bedingungen (schwarze Kurve) und nach tektaler Läsion (rote Kurve). Das rot gepunktete Rechteck zeigt die Dauer der visuellen Stimulation an. b Anterograd markierte Fasern, die im kontralateralen nIII enden, nach einer Neurobiotin-Injektion in AON (Einschub). Markierte Fasern verlaufen auch weiter kaudal in Richtung des nMLF (gestricheltes Oval; siehe e). c Retrograd markierte Zellen wurden im ipsilateralen Thalamus gefunden. d Retrograd markierte Zellen sind im Prätektum (rechts) mit Dendriten zu sehen, die bis in den Tractus opticus reichen. e Terminals im ipsilateralen nMLF. f Kontralaterale Projektionen auf Höhe der Injektionsstelle, die eine deutliche Wechselwirkung zwischen den Vestibularbereichen erkennen lassen. g Eine schematische Darstellung des dicken Abschnitts des Neunaugenhirns, der für intrazelluläre Patch-Clamp-Aufzeichnungen verwendet wird, wobei das Prätektum erhalten bleibt und AON für Ganzzellaufzeichnungen freigelegt wird. Zuvor wurde eine Tracer-Injektion in den Trakt vom AON zum nIII auf Höhe des Isthmus durchgeführt, um die Projektionsneuronen im AON für Ganzzellaufzeichnungen sichtbar zu machen. h Erregende (unten, rote Kurve) Reaktionen einer repräsentativen Zelle in einem vormarkierten AON-Neuron während einer Stimulation mit vier Impulsen (10 Hz). Es wurde kein Aufhören der Spitzen beobachtet, was auf hemmende Eingaben hinweist, wenn Neuronen depolarisiert wurden (oben, blaue Kurve). i Spannungsreaktionen auf hyperpolarisierende und depolarisierende 500-ms-Stromschritte von 10 pA pro Schritt, hervorgerufen aus dem Ruhezustand bei –68 mV, mit Darstellung der Schwellenreaktion (blaue Kurve) und der Reaktion oberhalb der Schwelle (rote Kurve). j Quantifizierung der Amplituden des exzitatorischen postsynaptischen Potenzials (EPSP) in AON-Zellen, die auf nIII projizieren, hervorgerufen durch anhaltende Stimulation (10 Impulse bei 10 Hz) des Prätektums/Tractus opticus, aufgezeichnet im Stromklemmenmodus. Die Werte werden auf den ersten EPSP normalisiert. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Abkürzungen: AON Anterior Octavomotor Nucleus, nIII Oculomotor Nucleus, Th Thalamus, pc hintere Kommissur, PT Pretectum, ot Optic Tractus, nMLF Nucleus of the Medial Longitudinal Fasciculus, SNc Substantia Nigra Pars Compacta, OLA Octavolateral Area. Maßstabsbalken = 150 µm in b; 250 µm im B-Einsatz; 100 µm in c–f. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Anschließend führten wir Neurobiotin-Injektionen in AON (N = 4) und ION (N = 4) durch, um den Ursprung der visuellen Informationen zu kartieren, die diese Vestibulariskerne erreichen. Sowohl AON als auch ION erhalten die gleichen Eingaben und daher gelten die beschriebenen Ergebnisse für beide Kerne. Injektionen in AON und ION (Abb. 7b, Einschub) bestätigten Projektionen zum Okulomotorikkern (Abb. 7b), und beide zeigten ipsilaterale Projektionen, die im nMLF endeten (Abb. 7b, e). Die rostralste Population, die auf diese Kerne abzielt, wurde im selben Thalamusbereich gefunden, der Projektionen an den Okulomotorikkern sendet (Abb. 7c; siehe oben), was darauf hindeutet, dass diese Region an der Blickstabilisierung beteiligt ist. Im Tectum wurden keine retrograden Neuronen beobachtet. Wie aufgrund der elektrophysiologischen Experimente (siehe oben) zu erwarten war, wurde jedoch eine Markierung im Prätektum gefunden, die die Annahme bestätigt, dass die visuelle Information aus dem Prätektum stammt (Abb. 7d). Obwohl einige Neuronen in medialen Aspekten des Prätektums beobachtet wurden, befanden sich die meisten retrograd markierten Neuronen in der Nähe des ipsilateralen Tractus opticus, wo sich ihre Dendriten erstreckten (Abb. 7d). Im kontralateralen AON (und ION für Injektionen in diesen Kern) wurden zahlreiche retrograd markierte Neuronen beobachtet, was darauf hindeutet, dass sich die Vestibulariskerne auf beiden Seiten gegenseitig beeinflussen (Abb. 7f).

Um zu bestätigen, dass sich visuelle Informationen auf das Vestibularis auswirken, verwendeten wir ein Präparat, das die AON-Neuronen für Patch-Clamp-Aufzeichnungen freilegte, während das Prätektum (Abb. 7g) und der Sehtrakt erhalten blieben. Dann wurden Dextran-Rhodamin-Injektionen in den AON-Trakt durchgeführt, um die AON-Neuronen retrograd für Patch-Clamp-Aufzeichnungen zu markieren und zu identifizieren (Abb. 7g; n = 8). Neuronen zeigten erregende Reaktionen auf prätektale Stimulation (10 Hz; Abb. 7h, rote Kurve; n = 7), wobei alle hervorgerufenen EPSPs ähnliche Amplituden aufwiesen (leicht dämpfend; Abb. 7j). Es wurde keine Hemmung festgestellt, wenn die Neuronen auf einem stärker depolarisierten Niveau gehalten wurden (Abb. 7h, blaue Kurve). Das Fehlen hemmender Reaktionen wurde durch intrazelluläre Blockierung von Natriumkanälen mit QX314 (n = 2) bestätigt, die eine Depolarisation auf –20 mV ermöglichten (ergänzende Abbildung 5b). Neuronen, die zum okulomotorischen Kern projizierten, zeigten eine geringe Anpassung (Abb. 7i) und Nachhyperpolarisation (Abb. 7i, blaue Spur). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass die visuovestibuläre Integration auf der Ebene der Vestibulariskerne stattfindet und dass visuelle Informationen im Prätektum entstehen. Wenn die AON-Neuronen nicht vormarkiert waren, wurden EPSPs nur in einigen Neuronen in der Region des AON (4/23 aufgezeichnete Neuronen) und IPSPs nur in einem Neuron (nicht gezeigt) hervorgerufen, was darauf schließen lässt, dass nur ein Teil der Neuronen innerhalb des AON liegt Die Region interagiert mit dem Prätektum.

Wie oben beschrieben, verfügen Neunaugen über ein gut entwickeltes visuelles System mit Augenbewegungen, die durch nicht-optokinetische visuelle Reize hervorgerufen werden können24. Dies deutet darauf hin, dass sie möglicherweise in der Lage sind, zielgerichtete Sakkaden auszuführen, und wenn dies zutrifft, könnte durch vestibuläre Stimulation nicht nur die langsame, sondern auch die schnelle Rücksetzphase des Nystagmus hervorgerufen werden37. Um Nystagmus zu analysieren, haben wir eine Plattform entwickelt, die eine vollständige Rotation intakter Neunaugen ermöglicht und gleichzeitig die Augenbewegungen per Video verfolgt (Abb. 8a). Rotationen riefen kompensatorische Augenbewegungen (VOR) hervor, aber auch Rückstellbewegungen in die entgegengesetzte Richtung (Abb. 8b – c; Zusatzfilm 7). Um zu untersuchen, ob das Neunaugen-VOR Nystagmus-Augenbewegungen aufweist, haben wir 180°-Rotationen bei drei verschiedenen Geschwindigkeiten (27,4, 68,5 und 137 °/s) angewendet und die Dauer jeder Augenbewegungsepisode gemessen (N = 3). In Übereinstimmung mit den nystagmischen Bewegungen änderten sich Dauer und Geschwindigkeit der langsam kompensatorischen Augenbewegungen mit der Rotationsgeschwindigkeit (Abb. 8d), während die Dauer der Rücksetzphase über verschiedene Stimulationsgeschwindigkeiten hinweg sehr ähnliche Dauern (0,024 ± 0,009 s) ergab eine Art und Weise, die für eine schnelle nystagmische Augenbewegung typisch ist (Abb. 8d), was zeigt, dass beim Neunauge Bewegungen sakkadischer Natur vorhanden sind. Die Analyse der Dynamik dieser zurücksetzenden Augenbewegungen ergab, dass ihre Geschwindigkeit 77,06 ± 30,30 Grad/s und die Amplitude 1,72 ± 0,73° betrug, ohne signifikante Unterschiede beim Vergleich schneller Phasen, die bei unterschiedlichen Stimulationsgeschwindigkeiten hervorgerufen wurden.

a Unsere im Labor gebaute Plattform ermöglichte kontrollierte Rotationen intakter Neunaugen in der Gierebene. Die Tiere wurden in einen transparenten Plastikschlauch eingeschlossen, der mit kaltem Süßwasser gefüllt war. Der Durchmesser des Zylinders ermöglichte das Atmen, schränkte jedoch die Bewegungsfreiheit des Tieres ein. An der Plattform war eine Kamera angebracht, um ein Auge während der Stimulation zu filmen, die aus 180°-Rotationen mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bestand. b Die Augenpositionen des Neunauges wurden mit DeepLabCut quantifiziert, was die Identifizierung von Bewegungen der Pupille (vier Etiketten wurden zur Mittelung verwendet, angegeben in Orange, Blau, Lila und Rosa) in Bezug auf den Kopf (Gelb) ermöglichte. Die rote gestrichelte Linie stellt die Augenposition zu Beginn der Gierstimulation (statische Position) dar, während die grüne Linie die Endposition der langsamen (kompensatorischen) Phase als Ergebnis einer Bewegung in entgegengesetzter Richtung zur Kopfbewegung anzeigt. Die blaue Linie zeigt die Endposition des Auges nach der folgenden schnellen Phase (Rückstellung) Augenbewegung in die gleiche Richtung wie die Kopfbewegung. c Mit dem zuvor beschriebenen Eye-Tracker konnte die Augenposition im Laufe der Zeit in Winkelgrade übersetzt werden, was ein klares Sägezahnmuster ergab, das auf ein VOR mit Nystagmus hinweist. d Die Dauer der langsamen Phasen der Augenbewegung (schwarz) und der schnellen Phasen (rot) wurde für die Dauer der rotierenden Gierbewegung aufgetragen. Die Dauer wurde auf Grundlage einer Bild-für-Bild-Analyse der Videoaufzeichnung berechnet. (27,4, 68,5, 137°/s). Wie aus der Grafik hervorgeht, hatten die schnellen Augenbewegungen (rot) über alle Versuche hinweg durchweg die gleiche allgemeine Dauer wie die langsamen Augenbewegungen (schwarz), die auch eine höhere Variabilität zwischen verschiedenen Versuchen bei gleicher Geschwindigkeit aufwiesen, wie sich in widerspiegelt ihre größeren Standardabweichungen im Vergleich zu schnellen Augenbewegungen. Die Daten werden als Mittelwerte ± SD dargestellt. Die schattierten Bereiche bezeichnen Fehlerbänder. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der Mangel an zuverlässigen OKR-Antworten in der Gierebene warf die Frage auf, ob andere Mechanismen außer VOR die Kopfbewegungen in dieser Ebene kompensieren. Zuerst haben wir getestet, ob der Kopf beim Schwimmen stabilisiert wird, indem wir frei bewegliche Tiere beobachten (Zusatzfilm 8), aber Kopfbewegungen gingen mit Schwimmwellen einher, was darauf hindeutet, dass die Fixierung der visuellen Szene nicht durch Kopfstabilisierung erreicht wird. Eine weitere bei anderen Wirbeltieren nachgewiesene Möglichkeit38,39,40 besteht darin, dass Bewegungsnetzwerke durch eine Efferenzkopie kompensierende Augenbewegungen in der Gierebene steuern. Um dies am Neunauge zu testen, verwendeten wir ein halbintaktes Präparat21 (Abb. 9a). Wir haben zunächst den Kopf des Präparats immobilisiert, um zu überwachen, ob kompensatorische Augenbewegungen auftreten, indem wir eine oben angebrachte Videokamera zur Überwachung von Schwanz- und Augenbewegungen verwendet haben (Abb. 9a). Bei einem von sechs Tieren wurden koordinierte Augenbewegungen erzeugt, die mit der Schwimmfrequenz koordiniert waren (Abb. 9b – f; Zusatzfilm 9). Obwohl diese Bewegungen reduziert waren, blieben sie bestehen, als die Labyrinthe entfernt und die Sehnerven durchtrennt wurden (Abb. 9d, g), was darauf hindeutet, dass sie von Folgeentladungen herrühren.

a Schematische Darstellung des halbintakten Neunauge-Präparats zur Überwachung von Körper- und Augenbewegungen. Der rostrale Abschnitt bis zum Rückenmark wird nach den gleichen Prinzipien wie bei der Ex-vivo-Präparation präpariert, wodurch das Gehirn und die Augen freigelegt werden. Der Rest des Körpers und des Schwanzes blieb intakt, um die Fortbewegung zu ermöglichen. Eine mit einem Mikroskop gekoppelte Videokamera wurde platziert, um das Präparat von oben zu filmen. b Entweder die spontane oder taktil induzierte Fortbewegung (durch sanftes Kneifen des Schwanzes) wurde aufgezeichnet und Augen- und Körperbewegungen im Zeitverlauf analysiert. Es wurden Augenbewegungen beobachtet, die mit der Schwimmaktivität synchronisiert waren. Bilder zeigen zwei unterschiedliche Positionen der Augen und des Schwanzes während einer Schwimmepisode. c Flugbahnen des Schwanzes (schwarz) und der Augen (grün, rechtes Auge; lila, linkes Auge), die zeigen, dass koordinierte Bewegungen beider Augen zusammen mit Schwanzbewegungen auftreten. d Obwohl diese Bewegungen weniger konsistent waren, blieben sie nach visueller und vestibulärer Inaktivierung erhalten. e Diagramm, das die positive Korrelation (Korrelationsanalyse nach Pearson, r (1166) = 0,707, p < 0,001) zwischen dem rechten und dem linken Auge zeigt und deren Synchronisation anzeigt. f, g Diagramme, die zeigen, dass Schwanz- und Augenbewegungen sowohl vor (f; Pearson-Korrelationsanalyse, r (1160) = −0,553, p < 0,001) als auch nach (g) visuovestibulärer Inaktivierung (r (1582) = −0,450) korrelieren. p < 0,001), was darauf hinweist, dass die beobachteten gekoppelten Augenbewegungen durch Folgeentladungen der Fortbewegung erzeugt werden. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Da deutliche, mit der Fortbewegung koordinierte, kompensatorische Augenbewegungen beobachtet wurden, wenn auch nur bei einem Tier, untersuchten wir, ob eine geringfügige Aktivierung der extraokularen Augenmuskeln, die nicht zu wahrnehmbaren Augenbewegungen führte, über EMGs aufgezeichnet werden konnte. Da gezeigt wurde, dass schwimmende Folgeentladungen auf der Ebene des Rückenmarks entstehen38, führten wir EMG-Aufzeichnungen in den rostralen und kaudalen Rektusmuskeln durch (die bei den Kompensationsbewegungen der Gierebene aktiviert werden sollten) und zeichneten gleichzeitig in einem Paar ventraler Wurzeln in der Wirbelsäule auf Schnur (Ergänzende Abb. 6a; N = 4). Die Aufnahmen wurden in einer geteilten Kammer durchgeführt und D-Glutamat (750 µM) wurde auf das Rückenmark aufgetragen, ohne das Gehirn zu beeinträchtigen (Abb. 6a). D-Glutamat rief eine fiktive Fortbewegung hervor, wie in den ventralen Wurzeln aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 6b, obere Spuren). In den Augenmuskeln wurden jedoch keine kompensatorischen Reaktionen hervorgerufen (ergänzende Abbildung 6b, untere Spuren). Insgesamt zeigen diese Ergebnisse, dass Folgeentladungen kompensatorische Augenbewegungen erzeugen können, was nur bei einem Tier eindeutig beobachtet wurde, obwohl ihr Beitrag in den meisten Fällen unterhalb der Schwelle liegt oder fehlt und ihr Ursprung noch bestimmt werden muss.

Unsere Ergebnisse zeigen, dass bei Neunaugen nicht nur VOR, sondern auch OKR und sakkadische Augenbewegungen in Form von Nystagmus vorhanden sind. Mithilfe einer Plattform, die eine kombinierte visuovestibuläre Stimulation mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen ermöglicht, zeigen wir, dass der Einfluss der visuovestibulären Integration auf Augenbewegungen ähnlich ist wie bei Säugetieren, und zeigen, dass für die multisensorische Integration, die den verbesserten Augenbewegungen zugrunde liegt, weder kortikale noch zerebelläre Einflüsse erforderlich sind. Wir zeigen, dass blickstabilisierende Augenbewegungen, einschließlich Nystagmus, auf einigen grundlegenden subkortikalen Strukturen beruhen (Abb. 10a).

a Eine schematische Darstellung des Flusses visueller (vom Auge) und vestibulärer (vom Labyrinth) Informationen bei der Erzeugung blickstabilisierender Augenbewegungen (gelb schattiert) und des wahrscheinlichen Weges, der zielgerichteten Augenbewegungen zugrunde liegt (rot schattiert). Gehirnbereiche, die nur visuelle Informationen verarbeiten, werden orange, der Vestibularbereich blau und der Visuovestibularbereich grün hervorgehoben. Beachten Sie, dass visuelle Informationen, wie bei Säugetieren, bereits einen Einfluss auf die vestibulären Eingaben haben, sobald sie in das Gehirn gelangen, und dass alle visuovestibulären Regionen unabhängig voneinander durch visuelle oder vestibuläre Eingaben aktiviert werden können. Die Motoneuronen der okulomotorischen Kerne initiieren den VOR/OKR, indem sie im letzten Schritt der sensomotorischen Integration die relevanten extraokularen Muskeln rekrutieren. b Ein phylogenetischer Baum mit den sieben Hauptklassen von Wirbeltieren und den ihnen zur Verfügung stehenden Augenbewegungen58,66. Beachten Sie, dass dieses Diagramm das Vorhandensein eines Augenbewegungstyps innerhalb jeder Klasse anzeigt, was bedeutet, dass nicht alle Mitgliedsarten notwendigerweise über diesen verfügen. Sanfte Augenbewegungen (in Rot) sind nur bei Primaten vorhanden. Die Äste des Baumes sind nicht maßstabsgetreu. Abkürzungen: PT pretectum, OT optic tectum nMLF Kern des Fasciculus longitudinalis medialis, VA Vestibularbereich.

Frühere Studien haben ergeben, dass die OKR zuerst bei Chondrichthyes auftrat1; Unsere Ergebnisse verschieben den Beginn der visuell gesteuerten Blickstabilisierung in einem aktualisierten phylogenetischen Baum der Augenbewegungen von Wirbeltieren weiter nach hinten (Abb. 10b). Wir zeigen auch, dass die Augenbewegungen die Kopfrotation eindeutig kompensieren und dass eine durch Fortbewegung hervorgerufene Blickstabilität vorhanden ist, wie bei einer Reihe von Wirbeltierarten. Insgesamt stellt diese Studie eine Reihe wichtiger Bezugspunkte für die Entwicklung der Augenbewegungskontrolle vor und geht auf ihre grundlegenden Mechanismen ein.

Der VOR beim Neunauge kompensiert zuverlässig Kopfbewegungen in allen drei Ebenen, wobei die Amplituden der Augenbewegungen die dynamischen Eigenschaften des okulomotorischen Systems des Neunauges, seine sensomotorische Integration und das Vorhandensein einer Blickstabilisierung bei frühen Wirbeltieren widerspiegeln. Der Dynamikgewinn betrug etwa 0,7, während der Positionsgewinn etwa 0,6 betrug. Diese Werte stimmen weitgehend mit früheren Studien zu Teleosten überein42, obwohl weitere Versuche erforderlich sind, um den VOR-Gewinn des Neunauges weiter zu untersuchen. VOR kann auch in Ex-vivo-Präparaten beobachtet werden, was hochkontrollierte visuovestibuläre Experimente ermöglicht. Hier bestätigen wir, dass sich der Grundschaltkreis, der VOR über disynaptische Wege zugrunde liegt, bereits bei Neunaugen entwickelt hatte und danach während der gesamten Wirbeltierentwicklung beibehalten wurde, wenn auch mit artspezifischen Modifikationen 10, 17, 20, und dass neben nIII auch die visuovestibuläre Integration in den Vestibularkernen stattfindet und nMLF. Die verfügbaren Daten legen nahe, dass der dem VOR zugrunde liegende disynaptische Bogen bei frühen Wirbeltieren auftrat, der von den vorderen und hinteren Bogengängen getragen wurde, und dass er in allen Wirbeltiergruppen weitgehend erhalten blieb10. Das Auftreten eines seitlichen horizontalen Kanals in Gnathostomen, der von Otx abhängt17,43, führte zu einigen Schaltkreisanordnungen17. Es wird nämlich angenommen, dass die sechs Extraokularmuskeln des Neunauges denen von Knochenfischen und Tetrapoden homolog sind13,17, allerdings mit einigen Unterschieden in der Innervation ihrer motorischen Kerne im Vergleich zu Gnathostomen. Drei Muskeln werden vom Nucleus oculomotorius (nIII), einer vom Nucleus trochlearis (nIV) und zwei vom M. abducens (nVI) innerviert. In Elasmobranchen werden vier Muskeln vom nIII innerviert, während einer vom nIV und einer vom nVI innerviert wird. Bei Knochenfischen und Tetrapoden werden vier Muskeln vom nIII, einer vom nIV und mindestens einer vom nVI17,44 innerviert. Allerdings wurde das gleiche Rechenschema beibehalten, das auch bei Neunaugen vorhanden ist. Interessanterweise weisen Neunaugen ein Gesamtmuster von Vestibularprojektionen zweiter Ordnung auf, das dem von Säugetieren sehr ähnlich ist17. Das Vestibularsystem weist somit hochkonservierte Elemente sowie Variationen im Zusammenhang mit spezifischen Funktionsvariationen auf10,45.

Beim Auslösen des OKR stellten wir sicher, dass die visuelle Stimulation das gesamte Gesichtsfeld abdeckte, stellten jedoch fest, dass die Reaktionen verschwanden, wenn derselbe Reiz aus größerer Entfernung angewendet wurde, was die optokinetische Natur weiter unterstützt. OKR wurde zuverlässig in den Roll- und Nickebenen beobachtet, mit einem starken und sofortigen Anstieg sowohl der Spitzen- als auch der EMG-Amplitude, als die Gittergeschwindigkeit zunahm, bevor sie sich einpendelte, was im Einklang mit erhöhten Geschwindigkeiten steht, die das visuelle Einklemmen schwieriger machen46. Unsere Experimente zeigen, dass die OKR auf prätektaler Aktivität beruht, wie bei Haien, Knochenfischen, Amphibien, Reptilien, Vögeln und Säugetieren9. Dementsprechend führt die tektale Inaktivierung, wie auch bei anderen Wirbeltieren47, nicht zur Abschaffung von OKR.

Die klare Verbindung zwischen prätektalen, vestibulären und okulomotorischen Kernen stützt auch die Annahme, dass sowohl OKR als auch VOR subkortikalen Ursprungs sind, was auf eine zentrale Rolle subkortikaler Mechanismen hinweist, die wahrscheinlich bei Säugetieren aufgrund der phylogenetischen Erhaltung des visuellen Systems erhalten geblieben ist15, 23,25,26. Das Fehlen eines funktionsfähigen Kleinhirns bei Neunaugen zeigt, dass für die OKR keine Kleinhirnbahnen erforderlich sind. Prätektale Informationen erreichen auch die Vestibulariskerne des Neunauges, was darauf hindeutet, dass der prätekto-vestibuläre Weg bereits bei frühen Wirbeltieren vorhanden war48. Die Reaktionen des Neunauges auf rotierende Sehbewegungen deuten angesichts der seitlichen Position der Augen auf eine prätektale Binokularität hin49, obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen der visuellen Verarbeitung des gesamten Feldes noch untersucht werden müssen50.

Überraschenderweise wurde in der Gierebene, in der die meiste Bewegung bei jedem Schwimmzyklus stattfindet, kein OKR beobachtet. Obwohl unsere Ergebnisse zeigen, dass Folgeentladungen allein in den meisten Fällen keine kompensatorischen Augenbewegungen erzeugen, scheinen sie einen Beitrag unterhalb des Schwellenwerts zu liefern, der den Mangel an OKR in dieser Ebene kompensieren würde (Abb. 9).

OKR und VOR verstärken sich gegenseitig, aber bei höheren Geschwindigkeiten nimmt der relative Beitrag der vestibulären Reaktion zu. Die vestibuläre Stimulation erzeugte spürbar eine starke, langanhaltende Augenbewegung, als ob das Auge die Kopfverschiebung ausgleichen würde. Es ist daher klar, dass zusätzlicher visueller Input den Gewinn an Augenbewegungen sowohl bei Neunaugen als auch beim Menschen deutlich erhöht, was einen weiteren Beweis dafür liefert, dass die zugrunde liegenden Mechanismen erhalten bleiben6,7,51. Visuelle Eingaben vom Prätektum verstärken auch die vestibulären Reaktionen, die die Körperhaltung bei Neunaugen steuern52,53, was darauf hindeutet, dass das Prätektum eine Schlüsselrolle bei der Stabilisierung von Blick- und Haltungsreaktionen spielt54.

Neunaugen zeigen auch Nystagmus, charakterisiert durch schnellphasige, ballistische Augenbewegungen mit fester Dauer in der entgegengesetzten Richtung der langsamen VOR-Phase55. Bisher ging man davon aus, dass das Neunauge keinen Nystagmus aufweist16, aber unsere Ergebnisse zeigen eine klare schnelle Phase, in der die Augenbewegungen als Teil des VOR zurückgesetzt werden, mit ähnlicher Dauer, unabhängig von der Stimulationsgeschwindigkeit oder der Amplitude der Augenbewegung. Augenbewegungen, die während Rotationen auftreten, erzeugen intermittierende schnelle und langsame Phasen, die das Sägezahnmuster bilden, das ein typisches VOR im gesamten Wirbeltierspektrum charakterisiert56,57,58. Die Geschwindigkeit sakkadischer Bewegungen bei Fischen liegt zwischen hundert und einigen hundert Grad pro Sekunde59,60,61. Daher sind sakkadische Augenbewegungen bei Neunaugen etwas langsamer. Beim Neunauge hat sich kein funktionsfähiges Kleinhirn entwickelt, und der VOR kann daher nicht über den komplementären Kleinhirnkreislauf verfügen, der bei anderen Wirbeltieren zur Feinabstimmung des VOR verwendet wird.

Es wird angenommen, dass sich aus Nystagmus Sakkaden entwickelt haben, die auf bestimmte Objekte gerichtet sind. Neunaugen verfügen über ein gut entwickeltes visuelles System und Augenbewegungen werden durch nicht-optokinetische visuelle Reize hervorgerufen24. Daher sind bei diesen Tieren wahrscheinlich zielorientierte Sakkaden vorhanden. Unsere Ergebnisse und die großen Ähnlichkeiten des Neunaugen-Tectums mit dem Superior Colliculus von Säugetieren21,22,23,25 deuten darauf hin, dass das Pretectum in erster Linie die Blick-/Haltungsstabilisierung steuert,54 während das Tectum zielgerichtete Augenbewegungen steuert (Abb. 10a). Zusammen mit einem ursprünglichen visuellen Kortex26 ist es wahrscheinlich, dass die Hauptschaltkreise, die die Augenbewegungen steuern, bereits vorhanden waren, bevor Neunaugen von der Hauptlinie der Wirbeltiere abwichen.

Zusammenfassend haben wir das älteste Beispiel von OKR bei Wirbeltieren identifiziert, das in VOR integriert ist und zu verbesserten Augenbewegungsreaktionen führt, ähnlich wie bei Säugetieren. Pretectum ist der Integrator der ersten Ebene der visuellen Bewegung und projiziert anschließend wie bei Säugetieren auf die Vestibular- und Okulomotorikkerne. Wir zeigen, dass die Blickstabilisierung grundsätzlich subkortikal gesteuert wird, was VOR-OKR-Interaktionen in Abwesenheit von Kortex oder Kleinhirn sowie eine durch Fortbewegung unterstützte Blickstabilität ermöglicht. Durch die Beschreibung des Nystagmus bei Neunaugen enthüllt diese Studie die alten Ursprünge ballistischer, zielorientierter Augenbewegungen und zeigt, dass Tectum wahrscheinlich blickstabilisierende Reflexe zugunsten solcher Befehle herunterreguliert. Alle Augenbewegungen basieren auf zwei Grundtypen, langsam und schnell, die hier beide bei Neunaugen vorkommen. Somit war die neuronale Schablone, aus der alle Augenbewegungen hervorgingen, bereits zu Beginn der Wirbeltierentwicklung vorhanden.

Die Experimente wurden an 50 erwachsenen Flussneunaugen (Lampetra fluviatilis) und 6 jungen erwachsenen Meerneunaugen (Petromyzon marinus) beiderlei Geschlechts durchgeführt. Die experimentellen Verfahren wurden von der örtlichen Ethikkommission (Stockholms Norra Djurförsöksetiska Nämnd) und der Xunta de Galicia unter der Aufsicht des Ausschusses für die Verwendung von Tieren im Labor der Universität Vigo gemäß der Richtlinie 2010/63/EU des Europäischen Parlaments genehmigt die spanische Verordnung RD 53/2013 zum Schutz der Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke. Die Tiere wurden in Aquarien mit einer angereicherten Umgebung und kontinuierlich belüftetem und gefiltertem Wasser gehalten. Es wurden alle Anstrengungen unternommen, um das Leid zu minimieren und die Anzahl der verwendeten Tiere zu reduzieren.

Um die kompensatorischen Augenbewegungen zu analysieren, die durch Vestibularstimulation (VOR) bei intakten Tieren (N = 9) hervorgerufen werden, verwendeten wir eine transparente Kammer mit einer Videokamera, die an einem Metallarm befestigt war, der das Gesichtsfeld des Tieres nicht beeinträchtigte (Grasshopper3, GS3-U3-23S6M-C, FLIR Systems, Wilsonville). Der Durchmesser der Kammer war groß genug, damit das Tier normal atmen konnte, aber schmal genug, um das Schwimmen zu verhindern. Die Größe der Kammer basierte auf durchschnittlichen Größendaten mehrerer Tiere und die für diese Experimente verwendeten wurden aufgrund ihrer Größe ausgewählt, um unter die zuvor beschriebenen Bedingungen in dieser Kammer zu passen. Das Röhrchen wurde mit kohlensäurehaltigem kaltem Wasser gefüllt und die Tiere leicht mit einer Dosis Tricainmethansulfonat (MS-222; 80 mg/L; Sigma-Aldrich) betäubt, um ihre Platzierung im Röhrchen zu erleichtern und ihren Stress zu minimieren. Nachdem sich das Tier von der Narkose erholt hatte, wurden in der Dunkelheit eine Reihe schneller Vestibularstimulationen in der Roll-, Nick- und Gierebene durchgeführt, während die hervorgerufenen VOR-Augenbewegungen aufgezeichnet wurden. Die Gesamtdauer der Experimente betrug 2–3 Minuten, um den Stress zu minimieren, und die Tiere wurden anschließend in ihre Aquarien zurückgebracht. In einigen dieser Experimente (N = 3) wurde ein Beschleunigungsmesser an der Kammer angebracht, die auf die Vestibularorgane ausgerichtet war, so dass die Kinematik der Vestibularstimulation abgerufen und zur Berechnung des Verstärkungsfaktors der von den Neunaugenaugen durchgeführten Kompensation verwendet werden konnte. Zu diesem Zweck wurde ein ADXL335-Beschleunigungsmesser (Arduino, Sommerville, MA) an der rotierenden Plattform angebracht. Dadurch konnten wir jederzeit die genaue Position des Neunauges ermitteln und so die Kopf- und Augenposition vergleichen.

Um Augenbewegungen zu verfolgen, verwendeten wir DeepLabCut 2.251, ein Python-Softwarepaket, das eine Bewegungserfassung basierend auf Transfer-Learning mit tiefen neuronalen Netzen durchführt, und die erhaltenen Daten wurden mit benutzerdefinierten Matlab R2020b-Skripten analysiert. Um die Videos zu analysieren, wurden zunächst vier Markierungen in 20 zufällig aus jedem Video ausgewählten Bildern im aufgezeichneten Auge platziert, damit die abgeleiteten Flugbahnen gemittelt werden konnten, um Fehler zu minimieren. Außerdem wurden Markierungen im Körper angebracht, um die kleinen Bewegungen zu subtrahieren, die von der Atmung und als Reaktion auf die Vestibularstimulation ausgehen. Anschließend wurde das Netzwerk trainiert und nach der Auswertung des Trainings wurden die Videos analysiert, um die Trajektorien der Etiketten und damit des Auges zu extrahieren. Anhand dieser Daten wurden die tatsächlichen Amplituden der Augenbewegungen ermittelt und der Durchmesser des Neunaugenauges in der Die mit der Kamera erfassten Augenbewegungsamplituden wurden daraufhin in Millimeter umgerechnet. Nachdem der Durchmesser des Neunaugenauges ermittelt wurde, konnte die Winkelverschiebung der VOR- und OKR-Bewegungen anhand trigonometrischer Funktionen ermittelt werden.

Wenn Tiere in eine transparente Kammer gebracht wurden, befestigten sie in der Regel instinktiv ihr Maul an der Kammerwand, stabilisierten ihren Kopf und ermöglichten es uns, VOR und Nystagmus verhaltensmäßig zu testen. Die Analyse des relativen Beitrags visueller und vestibulärer Informationen erforderte jedoch die Anwendung mehrerer experimenteller Paradigmen und konnte nicht an intakten Tieren durchgeführt werden. Daher entschieden wir uns für eine isolierte Präparation des Gehirns und des rostralen Rückenmarks des Neunauges mit den Augen und Vestibularorganen. Dies ermöglichte es uns, Augenbewegungen über EMG-Aufzeichnungen der extraokularen Muskeln zu überwachen, um die visuovestibuläre Integration zu testen sowie verschiedene Gehirnregionen aufzuzeichnen und zu inaktivieren. Dazu haben wir zunächst den Kopf von Tieren durchtrennt, die mit MS-222 (100 mg L−1; Sigma) tief anästhesiert waren, und ihn dann in eine eisgekühlte Lösung aus künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (aCSF) getaucht, die Folgendes enthielt (in mM): 125 NaCl, 2,5 KCl, 2 CaCl2, 1 MgCl2, 10 Glucose und 25 NaHCO3, gesättigt mit 95 % (Vol./Vol.) O2/5 % CO2. Die Rückenhaut und der Knorpel wurden entfernt, um das Gehirn freizulegen, und die Eingeweide und alle Muskeln außer den Extraokularmuskeln wurden entfernt, um Bewegungen zu vermeiden und die Augen und Ohrkapseln (wo sich die Vestibularorgane befinden) intakt zu halten. Um sicherzustellen, dass normale Augenbewegungen im Präparat erhalten blieben und dass die aufgezeichneten EMGs in den Extraokularmuskeln den tatsächlichen Augenbewegungen entsprachen, führten wir eine elektrische Stimulation im AON mit zunehmender Intensität durch, überwachten die Augenbewegungen und zeichneten gleichzeitig im dorsalen Rektus auf (ergänzende Abbildung). . 1).

Um extrazelluläre und EMG-Aufzeichnungen als Reaktion auf koordinierte visuelle und vestibuläre Reize zu ermöglichen, bauten wir ein Kippgerät, das die vestibuläre Stimulation eines Auge-Gehirn-Labyrinth-Präparats (siehe oben) in der Rollebene ermöglichte und zwischen zwei Bildschirmen platziert wurde, die die koordinierte Präsentation ermöglichten visueller Reize. Die Plattform wurde über einen Servomotor bewegt und Winkel und Geschwindigkeit mit einer Mikrocontrollerplatine (Arduino Uno) gesteuert. Visuelle Reize wurden in Matlab R2020b unter Verwendung der Psychophysics Toolbox Version 3-Erweiterungen geschrieben62,63 und ein weiteres Mikrocontroller-Board wurde Matlab untergeordnet, sodass seine Ausgänge zur Koordinierung der visuellen Reize, der Kippplattform und der elektrophysiologischen Aufzeichnungen verwendet wurden. Das oben beschriebene Präparat wurde in einer transparenten Kühlkammer befestigt, die kontinuierlich mit aCSF bei 6–8 °C durchströmt wurde, und auf der Kippplattform platziert, die in einem Metallzylinder eingesetzt war, der mit einer Peltier-Platte verbunden war, um die Temperatur der Kammer aufrechtzuerhalten. Das Präparat wurde mit der Rotationsachse der Plattform so ausgerichtet, dass die vestibuläre Stimulation in der Rollebene erfolgte, Translationsbewegungen vermieden wurden und auf die Mitte von zwei Bildschirmen gerichtet war, die auf beiden Seiten in einem Abstand von 9 cm zwischen Präparation und Bildschirm angebracht waren, um sicherzustellen, dass die präsentierten Reize abgedeckt wurden das gesamte Gesichtsfeld.

Alle Experimente wurden im Dunkeln durchgeführt, so dass die einzige Lichtquelle die visuelle Stimulation war. Visuelle Reize bestanden aus horizontalen Balken, die sich auf jedem Bildschirm in entgegengesetzter Richtung entlang der vertikalen Achse bewegten (d. h. wenn sich die dem rechten Auge präsentierten Balken von oben nach unten bewegten, bewegten sich die Balken vor dem linken Auge von unten nach oben). Die Richtung der Balken wurde ebenfalls angepasst, um die OKR-Reaktionen auf Gier und Nick zu analysieren.

Um die visuovestibuläre Integration zu analysieren, verwendeten wir nur eine vestibuläre Stimulation in der Rollebene (bei ausgeschalteten Bildschirmen), nur eine visuelle (Vorbereitung horizontal gehalten) und eine visuovestibuläre Stimulation (Neigung der Plattform und kombinierte visuelle Stimulation). Diese Paradigmen wurden unter vier verschiedenen Bedingungen getestet: niedrige Amplitude – niedrige Geschwindigkeit (5,8°; 48,7°/s), niedrige Amplitude – hohe Geschwindigkeit (5,8°; 112,94°/s), hohe Amplitude – niedrige Geschwindigkeit (22,7°; 48,7°). /s) und hohe Amplitude – hohe Geschwindigkeit (22,7°; 112,94°/s). Der Winkel bezieht sich auf die maximale Neigung der Plattform und die Winkelgeschwindigkeit auf die Geschwindigkeit dieser Neigung und/oder die Geschwindigkeit der optokinetischen Stimulation. Jedes der Paradigmen (VIS, VES und VISVES) wurde dreimal auf jedes Tier unter jeder Bedingung angewendet (niedrige Amplitude – niedrige Geschwindigkeit, niedrige Amplitude – hohe Geschwindigkeit, hohe Amplitude – niedrige Geschwindigkeit und hohe Amplitude – hohe Geschwindigkeit). Die mittleren Beschleunigungen der VES- und VISVES-Protokolle betrugen 305,75 ± 112,79 Grad/s2 für die niedrige Geschwindigkeit und 915,73 ± 324,58 Grad/s2 für die hohe Geschwindigkeit. Dies wurde berechnet, indem der in den Verhaltensstudien verwendete Beschleunigungsmesser an der Plattform befestigt und seine Bewegungsdynamik abgerufen wurde. Die Aufzeichnungselektrode wurde für Roll- und Nickaufzeichnungen im dorsalen Rektus und für die Gierebene im kaudalen Rektus platziert und bis zum Ende des Experiments aufbewahrt. Nach der Platzierung der Elektrode ließ man das Präparat mindestens 30 Minuten lang an einen weißen Bildschirm anpassen, der als Hintergrund für alle applizierten Reize diente. Zwischen den Versuchen und der Präsentation von VIS-, VES- und VISVES-Stimulationen lagen 2 Minuten, die randomisiert wurden, um die Anpassung zu minimieren und mögliche Änderungen in der Erregbarkeit des Präparats auszugleichen. Die Anzahl der an jedem Tier durchgeführten Wiederholungen wurde gewählt, um die Dauer des Experiments zu minimieren und gleichzeitig ausreichende Daten zu sammeln, um die Lebensfähigkeit des Präparats basierend auf unseren Erfahrungen in früheren Studien mit ähnlichen isolierten Präparaten sicherzustellen25,26,27. Die EMG-Reaktionen auf die spezifischen Protokolle zeigten im Allgemeinen bei jedem Tier eine ähnliche Dynamik. Dadurch konnten wir Versuche identifizieren, bei denen die neuronale Integrität des Präparats in irgendeiner Weise beschädigt war und das Experiment in diesem Fall abgebrochen wurde.

Um Muskel- und/oder neuronale Aktivität aufzuzeichnen, verwendeten wir Wolfram-Mikroelektroden (~1–5 MΩ), die an einen Differential-Wechselstromverstärker, Modell 1700 (AM-Systeme), angeschlossen waren. Die Signale wurden mit der Software pClamp (Version 10.2) bei 20 kHz digitalisiert. Wolfram-Mikroelektroden wurden mit einem Mikromanipulator platziert, der fest an der Kippplattform befestigt war, so dass er sich zusammen mit dem Präparat drehte und Vibrationen vermeidete. In einigen Fällen haben wir auch eine Videokamera an der Plattform angebracht, um die Augenbewegungen des Präparats zu überwachen.

Um gleichzeitige Aufnahmen der kaudalen und rostralen extrazellulären Augenmuskeln und eines Paares ventraler Wurzeln durchzuführen, um die Blickstabilisierung während der Fortbewegung zu beurteilen, verwendeten wir ein Präparat, das das Gehirn zusammen mit den Augen und einem großen Abschnitt des Rückenmarks freilegte. Dazu betäubten wir die Tiere tief mit MS-222 (100 mgL−1; Sigma) und durchtrennten den Körper 50–60 mm kaudal zur zweiten Kiemenöffnung (ungefähr vom Ort des Obex). Dann wurden, eingetaucht in eisgekühlte künstliche Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit (aCSF), die Rückenhaut und der Knorpel entfernt, um das Gehirn und das Rückenmark freizulegen, und die Eingeweide und alle Muskeln wurden entfernt. Die Sehnerven wurden durchtrennt und die Labyrinthe entfernt, um visuelle und vestibuläre Einflüsse zu vermeiden. Wolfram-Mikroelektroden (~1–5 MΩ) wurden zur Aufzeichnung der Muskelaktivität verwendet, während Saugelektroden aus Borosilikatglas (HilgenbergGmbH) unter Verwendung eines mit aCSF gefüllten vertikalen Abziehers (Modell PP-830; Narishige) zur Aufzeichnung der bilateralen Aktivität im Ventralbereich verwendet wurden Wurzeln des Rückenmarks. Die Saugelektroden wurden an einen Differential-Wechselstromverstärker, Modell 1700 (AM-Systeme), angeschlossen.

Gezielte Läsionen wurden durchgeführt, um den primären Übertragungspunkt für visuelle Informationen zwischen dem Auge und den extraokularen Muskelkernen zu identifizieren, die für die Durchführung der OKR verantwortlich sind. Um das Tektum zu inaktivieren, wurde der Tractus opticus direkt kaudal des Prätektums durchtrennt, wodurch der retinale Eingang zu dieser Struktur eliminiert wurde. Um sicherzustellen, dass das Tektum frei von Netzhautfasern war, wurden am Ende der Experimente Neurobiotin-Injektionen in den Sehtrakt auf der Ebene des Prätektums durchgeführt und die Gehirne wurden wie unten beschrieben für die anatomische Traktverfolgung verarbeitet. Die Markierung im Chiasma opticum diente als Referenz, um zu bestätigen, dass die Injektion im Tractus opticus durchgeführt wurde. Prätektale Läsionen wurden durch akute Schnitte durchgeführt und die gleiche Strategie wurde zur Inaktivierung von Pallium angewendet. Eine pharmakologische Inaktivierung wurde ebenfalls durchgeführt, um das Prätektum zu inaktivieren und gleichzeitig die tektale Integrität aufrechtzuerhalten (siehe unten).

Neunaugen wurden mit MS-222 tief betäubt und dann auf Höhe der siebten Kieme durchtrennt. Der Kopf wurde in eine CSF-Lösung getaucht und die Injektionen erfolgten mit Glasmikropipetten (Borosilikat; Außendurchmesser = 1,5 mm, Innendurchmesser = 1,17 mm; Hilgenberg) mit einem Spitzendurchmesser von 10–20 μm. Mikropipetten wurden an einem Halter befestigt, der an eine Luftversorgung und einen Mikromanipulator (Modell M-3333, Narishige) angeschlossen war, und 50–200 nL Neurobiotin 20 % (Gew./Vol.) in aCSF mit Fast Green (Vector Laboratories), um die Visualisierung zu erleichtern Der Tracer wurde durch Druck in den Okulomotorikkern oder den vorderen/mittleren Oktavmotorkern injiziert. Nach den Injektionen wurden die Gehirne 24 Stunden lang im Dunkeln bei 4 °C in aCSF getaucht, um den Transport der Tracer zu ermöglichen. Anschließend wurden die Gehirne herauspräpariert und in 4 % Formaldehyd und 14 % gesättigter Pikrinsäure in 0,1 M Phosphatpuffer fixiert ( PB), pH 7,4, für 12–24 Stunden und kryogeschützt in 20 % (Gew./Vol.) Saccharose in PB für 3–12 Stunden. Mit einem Kryostat wurden Querschnitte (20 μm dick) angefertigt und auf mit Gelatine beschichteten Objektträgern gesammelt. Zum Nachweis von Neurobiotin wurde Cy2-konjugiertes Streptavidin (1:1000; Jackson ImmunoResearch) zusammen mit einer tiefroten Nissl-Färbung (1:500; Molecular Probes) verwendet, verdünnt in 1 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,3 % Triton X- 100 in 0,1 Mio. PB. Die Schnitte wurden mit Glycerin mit 2,5 % Diazabicyclooctan (Sigma-Aldrich) befestigt.

Um für Patch-Clamp-Experimente AON-Neuronen zu markieren, die zum okulomotorischen Kern projizieren, wurde Dextranamin-Tetramethylrhodamin (3 kDa; 12 % in Kochsalzlösung; Molecular Probes) einseitig in den AON-Trakt, der zum nIII projiziert, auf Höhe des Isthmusbereichs unter Druck injiziert . Hierzu wurden die Tiere mit in Süßwasser verdünntem MS-222 (100 mg·L−1) tief betäubt und während der Operation und der Injektionen wurde das gesamte Tier in aCSF getaucht, das MS-222 (80 mg·L−1) enthielt ), um sicherzustellen, dass das Tier betäubt blieb. Dann wurde ein Einschnitt in die Haut und die Muskeln direkt über dem rostralen Hirnstamm vorgenommen und der Knorpel geöffnet, um das Gehirn freizulegen. Nach den Injektionen wurde die Rückenhaut vernäht und das Tier für 48–72 Stunden in sein Aquarium zurückgebracht, um den Transport des Tracers zu ermöglichen. Anschließend wurden die Gehirne herausgeschnitten und für Patch-Clamp-Aufzeichnungen verarbeitet (siehe unten).

Ganzzellige Current-Clamp-Aufzeichnungen wurden in dicken Schnitten durchgeführt, wobei das Prätektum für die Stimulation erhalten blieb und AON-Neuronen für die Aufzeichnung freigelegt wurden. Dazu wurde das gesamte Gehirn in Agar (4 % in aCSF) eingebettet, der Agarblock mit dem Gehirn auf eine Metallplatte geklebt, schnell in eiskaltes aCSF überführt und mit einem Vibrationsmikrotom (Microm HM 650) in Scheiben geschnitten V; Thermo Scientific). Anschließend wurde der Agarblock in einer untergetauchten Aufnahmekammer montiert.

Stromklemmenaufzeichnungen für ganze Zellen wurden mit Patchpipetten aus Borosilikatglas (Hilgenberg GmbH) durchgeführt und mit einem Vertikalzieher (Modell PP-830; Narishige) durchgeführt. Der Widerstand der Aufnahmepipetten betrug 7–10 MΩ, wenn sie mit einer intrazellulären Lösung mit der folgenden Zusammensetzung (in mM) gefüllt waren: 130 Kaliumgluconat, 5 KCl, 10 Phosphokreatin-Dinatriumsalz, 10 HEPES, 4 Mg-ATP, 0,3 Na-GTP ; (Osmolarität 265–275 mOsmol). In einigen Fällen enthielt die Elektrodenlösung 2 mM Triethylammoniumbromid (QX314; Sigma-Aldrich), um Aktionspotentiale zu blockieren. Brückenbalance und Pipettenkapazitätskompensation wurden für die Verwendung eines MultiClamp 700B-Patchverstärkers und eines Digidata 1322-Analog-Digital-Wandlers unter Softwaresteuerung „PClamp 10.2“ (Molecular Devices) angepasst. Das Präparat wurde konstant mit aCSF bei 6–8° perfundiert.

Die Stimulation des Prätektums/Tractus opticus wurde mit denselben Borosilikatglas-Mikrokapillaren durchgeführt, die für Patch-Aufzeichnungen verwendet wurden, verbunden mit einer Reizisolationseinheit (MI401; Zoologisches Institut, Universität zu Köln). Die Stimulationsintensität wurde auf das Ein- bis Zweifache der Schwellenwertstärke (typischerweise 10–100 μA) eingestellt, um PSPs hervorzurufen.

Um die Augenbewegungen als Reaktion auf das Schwimmen ohne visuelle und vestibuläre Einflüsse zu analysieren, verwendeten wir ein halbintaktes Präparat, bei dem Gehirn und Augen freigelegt wurden, während der Rest des Körpers intakt blieb. Dazu wurden die Tiere mit in Süßwasser verdünntem MS-222 (100 mg·L−1) anästhesiert und am Kopf des Tieres die Rückenhaut, Muskeln und Knorpel entfernt, so dass das Gehirn, die Gehörkapseln usw. erhalten blieben Die Augen wurden freigelegt, um die Präparation der Sehnerven und Labyrinthe sowie die Überwachung der Augen zu ermöglichen. Man ließ das Präparat sich erholen und spontane und hervorgerufene Schwimmepisoden (durch leichtes Zusammendrücken des Schwanzes mit einer Pinzette) wurden zusammen mit Augenbewegungen mit einer an das Mikroskop gekoppelten Videokamera aufgezeichnet. Um sicherzustellen, dass das okulomotorische System intakt war, wurden die Augenbewegungen bei allen Präparaten überwacht, sowohl spontan als auch durch elektrische Stimulation des Sehtrakts hervorgerufen. Augen- und Schwanzbewegungen wurden mit DeepLabCut wie oben beschrieben verfolgt. An jedem Auge wurden vier Markierungen angebracht, und am rostralen Körper des Tieres wurden zwei Markierungen angebracht, um Daten zu mitteln und so Fehler in den abgeleiteten Flugbahnen des Auges und des Körpers zu minimieren.

Um vestibuläre Stimulationen mit großer Amplitude in der Gierebene anzuwenden, haben wir eine Plattform entwickelt, die von einem über Arduino gesteuerten Servomotor bewegt wird, sodass Geschwindigkeit und Amplitude gesteuert werden können. Bei VOR-Aufzeichnungen (siehe oben) wurde auf der rotierenden Plattform eine transparente Kammer mit geeigneter Größe befestigt, die mit belüftetem kaltem Wasser gefüllt war, um zu verhindern, dass das Tier schwimmen konnte. Der Kopf des Tieres wurde auf die Rotationsachse ausgerichtet, um Translationsbewegungen zu vermeiden, und eine Videokamera (Grasshopper3, GS3-U3-23S6M-C, FLIR Systems) wurde gegenüber einem der Augen platziert. 180°- oder 360°-Rotationen wurden mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten angewendet, und die Augenbewegungen wurden mit DeepLabCut verfolgt und mit benutzerdefinierten Matlab-Skripten analysiert.

Um die Rolle des Prätektums bei der Vermittlung von OKR und der Aufrechterhaltung der tektalen Integrität während EMG-Aufzeichnungen zu testen, wurde der Glutamatrezeptor-Antagonist Kynurensäure (4 mM; Sigma-Aldrich) durch Druckinjektion durch eine an einem Halter befestigte Mikropipette (mit Fast Green) lokal in das Prätektum aufgetragen um die Visualisierung der Injektionsausbreitung zu erleichtern), das an ein Picospritzer-II-Mikroinjektionsabgabesystem (Parker) angeschlossen war. Der Halter war mit einem Mikromanipulator verbunden, um die Position der Pipette zu überwachen und präzise Medikamenteninjektionen sicherzustellen. Um eine fiktive Fortbewegung hervorzurufen und gleichzeitig die Augenbewegungen anhand von EMG-Aufzeichnungen zu überwachen, verwendeten wir eine geteilte Kammer, die das freiliegende Rückenmark vom Gehirn trennte, und badeten den N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor-Agonisten D-Glutamat (0,75 mM, Sigma-Aldrich). auf das Rückenmark aufgetragen.

Mikrofotografien wurden mit einer Digitalkamera (Olympus XM10) aufgenommen, die an einem Olympus BX51-Fluoreszenzmikroskop montiert war. Die Illustrationen wurden mit Adobe Illustrator CC 2019 und GIMP 2.1 (GNU-Bildbearbeitungsprogramm) erstellt. Die Bilder wurden lediglich hinsichtlich Helligkeit und Kontrast angepasst. Konfokale Z-Stapel optischer Schnitte wurden mit einem Zeiss Laser-Scanning-Mikroskop 510 erstellt und die Projektionsbilder wurden mit der Zeiss LSM-Software ImageJ 1.53k und GIMP 2.1 verarbeitet.

Für alle elektrophysiologischen Aufzeichnungen wurde die Datenanalyse mithilfe benutzerdefinierter geschriebener Funktionen in Matlab durchgeführt. Für Videoaufnahmen wurden Positionen mit DeepLabCut30 extrahiert. Zur Berechnung der Verstärkung während der VOR-Stimulation wurden zwei verschiedene Strategien verwendet. Einerseits wurde der Positionsgewinn als Verhältnis der Flächen unter der Kurve der Kopf- und Augenpositionen für ein bestimmtes Zeitintervall berechnet. Für den dynamischen Gewinn wurden die Verhältnisse zwischen Augen- und Kopfgeschwindigkeiten zwischen zwei verschiedenen Punkten berechnet64. In beiden Fällen wurde die Verstärkung während der langsamen Phase des VOR berechnet, um nystagmische Bewegungen in der schnellen Phase zu vermeiden. Um die Dauer der schnellen und langsamen Nystagmusphasen zu quantifizieren, wurde die Analyse Bild für Bild mit Adobe Premiere durchgeführt. Dies ermöglichte es uns, die genaue Start- und Endposition jeder Augenbewegung mit einem hohen Maß an Genauigkeit zu identifizieren, wobei die Zeitpunkte aufgezeichnet wurden, um die Dauer zu berechnen, und die Amplituden in Pixeln gemessen und dann wie oben dargestellt in Grad umgerechnet wurden. Die Amplituden wurden berechnet, indem die Entfernung in Pixeln gemessen wurde, die das Auge zwischen diesen Schlüsselbildern zurücklegte, und dann wie oben gezeigt in Winkel umgewandelt.

Für EMGs und extrazelluläre Aufzeichnungen wurde die Anzahl der Spikes quantifiziert, um sie nach verschiedenen Bedingungen zu vergleichen. Es wurden auch maximale Amplituden gemessen: Die Signale wurden vollständig gleichgerichtet und der Abstand von der Grundlinie zu den Spitzen berechnet, um die Amplituden zu messen. Angesichts der Tatsache, dass in EMGs, die als Reaktion auf eine elektrische Stimulation des Auges erhalten wurden, keine isolierten Einheiten extrahiert werden können, wurde das Integral unter den Kurven nach vollständiger Gleichrichtung der Signale mithilfe einer trapezförmigen numerischen Integration („trapz“-Funktion) verglichen, um die Amplitude und zu integrieren Dauer der Signale. Für die gesamte Aufzeichnungsanalyse wurden die PSP-Amplituden gemessen, nachdem der synaptische Zerfall durch eine Exponentialkurve angepasst wurde, um korrekte Amplituden zu extrahieren, da nachfolgende PSPs oft in der Abklingphase früherer Reaktionen begannen. Die bei jedem Tier aufgezeichneten Reaktionen waren zwischen allen angewendeten Wiederholungen jedes Paradigmas (VIS, VES oder VISVES) sehr konsistent. Es wurden jedoch Unterschiede zwischen den Tieren aufgrund der Position der Elektrode und der Erregbarkeit des Präparats beobachtet. Daher wurden die Daten normalisiert, indem alle Werte durch die maximale Reaktion bei jedem Tier und für jede Modalität dividiert wurden. Auf diese Weise wurde das Verhältnis für jede Sinnesmodalität für jedes Tier und jede Versuchsbedingung (niedrige Amplitude – niedrige Geschwindigkeit, niedrige Amplitude – hohe Geschwindigkeit, hohe Amplitude – niedrige Geschwindigkeit und hohe Amplitude – hohe Geschwindigkeit) ermittelt. Anschließend wurden die Daten unter den Tieren gemittelt, um den mittleren Beitrag jeder in den Diagrammen dargestellten Sinnesmodalität zu ermitteln.

Zur statistischen Analyse wurden alle Spuren für jede abhängige und unabhängige Variable zusammengefasst. Die Analyse erfolgte mit SPSS 25 und JASP 0.16. In einigen Fällen wurden unmittelbar vor oder nach der Stimulation spontane Augenbewegungen erzeugt, die die analysierten Reaktionen deutlich beeinflussten. Nach der visuellen Prüfung mutmaßlicher Ausreißer wurde ein Grubb-Test verwendet, um signifikante Ausreißer zu identifizieren, und Datenpunkte außerhalb des 95 %-Konfidenzintervalls wurden vor der Durchführung der statistischen Analyse entfernt. Gepaarte T-Tests wurden verwendet, um Signalamplituden und die Anzahl der Spitzen zwischen den Modalitäten bei α = 0,05 zu vergleichen. In allen Abbildungen werden die Stichprobenstatistiken als Mittelwerte ± SD ausgedrückt. Werte, die außerhalb des 95 %-Konfidenzintervalls gemäß Grubbs Test liegen, wurden für Diagramme ausgeschlossen. Zur Analyse der visuellen Rampen von Roll- und Nickebenen wurde eine ANOVA mit wiederholten Messungen mit den jeweiligen Stimulationsinkrementen als Faktoren implementiert. Für die Verhaltensversuche wurden lineare Regressionsanalysen verwendet, bei denen der Pearson-Kohärenzkoeffizient ermittelt wurde, um die Konjugation zwischen den beiden Augen sowie zwischen den durchschnittlichen Augenbewegungen und denen des Schwanzes zu testen. Bei letzterem wurden die Augenpositionen zeitlich um sieben Bilder nach vorne versetzt, um mit dem Beginn der Schwanzbewegung übereinzustimmen. Die Anzahl der durchgeführten Experimente, für die repräsentative Beispiele gezeigt werden, ist wie folgt: Zur Gewinnanalyse (Abb. 1b–d) wurde bei drei Tieren eine Vestibularstimulation in den drei Ebenen angewendet. Pro Tier wurden drei Wiederholungen für jede Ebenenstimulation analysiert. Neurobiotin-Injektionen wurden im nIII von drei Tieren (Abb. 5) und im AON von vier Tieren (Abb. 7b – f) durchgeführt. Nystagmus-Experimente wurden an drei Tieren durchgeführt (Abb. 8). Die Experimente zur Analyse des Vorhandenseins von durch Fortbewegung hervorgerufenen Augenbewegungen in einem halbintakten Präparat wurden an sechs Tieren durchgeführt (Abb. 9). Die statistische Signifikanz wird wie folgt dargestellt: *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Quelldaten werden mit diesem Papier bereitgestellt und können unter dem folgenden Link (https://doi.org/10.5281/zenodo.6628365) zusammen mit zusätzlichen Rohdaten heruntergeladen werden65. Weitere Informationen und Anfragen richten Sie bitte an den entsprechenden Autor.

Der zur Analyse und Darstellung der visuellen und vestibulären Reize in Koordination mit elektrophysiologischen Aufzeichnungen verwendete Code kann unter folgendem Link heruntergeladen werden: (https://doi.org/10.5281/zenodo.6628365)65. Weitere Informationen und Anfragen richten Sie bitte an den jeweiligen Autor.

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Referenzen herunterladen

Wir danken Professor Abdel El Manira und Dr. Brita Robertson für wertvolle Kommentare zum Manuskript, Roberto de la Torre für die Videokamera und Roi Carrera Boo für die Einrichtung von DeepLabCut. Diese Arbeit wurde vom Swedish Medical Research Council (VR-M-K2013-62X-03026, VR-M-2015-02816, VR-M-2018-02453 an SG und VR-M-2019-01854 an JP) unterstützt. F.), Proyectos I + D + i PID2020-113646GA-I00, finanziert durch MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 und durch „EFRE A way of making Europe“ (an JP-F.), das Ramón y Cajal-Stipendium RYC2018-024053 -I finanziert durch MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 und durch „ESF Investing in your Future“ (an JP-F.), Xunta de Galicia (ED431B 2021/04 an JP-F.), EU/FP7 Moving Beyond Grant ITN -Nr. 316639, Siebtes Rahmenprogramm der Europäischen Union (FP7/2007-2013) gemäß Finanzhilfevereinbarung Nr. 604102 (HBP), EU/Horizon 2020 Nr. 720270 (HBP SGA1), Nr. 785907 (HBP SGA2) und Nr. 945539 (HBP SGA3) an SG, das CINBIO, die Gösta Fraenckel Foundation for Medical Research FS-2020:0004 (an TW), die Sigvard and Marianne Bernadotte Research Foundation for Children's Eye Care und das Karolinska Institutet.

Die Abteilung für Neurowissenschaften, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden

Tobias Wibble, Sten Grillner und Juan Pérez-Fernández

Die Abteilung für klinische Neurowissenschaften, Marianne Bernadotte Centrum, St: Erik's Eye Hospital, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden

Tobias Wibble & Tony Pansell

CINBIO, Universität Vigo, Neuroschaltungsgruppe, Campus der Universität Lagoas, Marcosende, 36310, Vigo, Spanien

Juan Perez-Fernandez

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TW und JP-F. konzipierte die Studie und konzipierte und führte die Experimente durch. SG trug zum theoretischen Rahmen bei, gab kritisches Feedback und stellte Ausrüstung und Materialien zur Verfügung. TP leistete finanzielle Unterstützung und Betreuung. JP-F. entwarf die Figuren mit Unterstützung von TWTW und JP-F. führte die Analyse durch, interpretierte die Ergebnisse und verfasste das Manuskript unter Einbeziehung aller Autoren.

Korrespondenz mit Juan Pérez-Fernández.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Bernd Fritzsch und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Wibble, T., Pansell, T., Grillner, S. et al. Konservierte subkortikale Verarbeitung bei der visuell-vestibulären Blickkontrolle. Nat Commun 13, 4699 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32379-w

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Eingegangen: 10. August 2021

Angenommen: 27. Juli 2022

Veröffentlicht: 10. August 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32379-w

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