Mäusen fehlt das PSD | Jilin Patchkabel-Gruppe

Scientific Reports Band 5, Artikelnummer: 16410 (2015) Diesen Artikel zitieren

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Die Ubiquitinierung von Proteinen hat einen erheblichen Einfluss auf verschiedene Aspekte der neuronalen Entwicklung und Funktion. Dorfin, auch bekannt als Rnf19a, ist eine RING-Finger-E3-Ubiquitin-Ligase, die an Amyotropher Lateralsklerose und der Parkinson-Krankheit beteiligt ist, deren In-vivo-Funktionen jedoch noch nicht erforscht wurden. Wir berichten hier, dass Dorfin ein neuartiger Bindungspartner des erregenden postsynaptischen Gerüstproteins PSD-95 ist. Dorfin-mutierte (Dorfin−/−) Mäuse zeigen eine verringerte adulte Neurogenese und eine verstärkte Langzeitpotenzierung im Gyrus dentatus des Hippocampus, jedoch eine normale Langzeitpotenzierung in der CA1-Region. Verhaltensmäßig zeigen Dorfin-/−-Mäuse eine eingeschränkte kontextuelle Angstkonditionierung, aber normale Niveaus der bedingten Angstkonditionierung, der Angstauslöschung, des räumlichen Lernens und Gedächtnisses, des Objekterkennungsgedächtnisses, des räumlichen Arbeitsgedächtnisses und der Mustertrennung. Mithilfe eines proteomischen Ansatzes identifizieren wir außerdem eine Reihe von Proteinen, deren Ubiquitinierungsniveaus im Dorfin-/−-Gehirn verringert sind. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Dorfin die Neurogenese, die synaptische Plastizität und das kontextuelle Angstgedächtnis bei Erwachsenen regulieren könnte.

Die Protein-Ubiquitinierung reguliert verschiedene Aspekte der neuronalen Entwicklung und Funktion. E3-Ubiquitin-Ligasen, deren Zahl in die Hunderte geht (ca. 400–500 bei Mäusen und Menschen), sind Schlüsselkomponenten des Protein-Ubiquitinierungssystems und spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Substratspezifität. Es ist bekannt, dass die Ubiquitinierung von Proteinen zum Proteinabbau durch das 26S-Proteasom führt. Es häufen sich jedoch Hinweise darauf, dass es auch zusätzliche Funktionen erfüllt, wie etwa die Regulierung der Proteinfunktion, des Proteintransports und der subzellulären Lokalisierung sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Die Protein-Ubiquitinierung im Nervensystem reguliert verschiedene Stadien der neuronalen Entwicklung, einschließlich Neurogenese, Migration, Neuritogenese und Synaptogenese1,2,3,4,5. Darüber hinaus wird angenommen, dass die Ubiquitinierung synaptischer Proteine verschiedene Aspekte der synaptischen Struktur, Funktion und Plastizität reguliert. Zu den bekannten Substraten der synaptischen Ubiquitinierung gehören Gerüst-/Adapterproteine, Rezeptoren und Signalmoleküle. Spezifische Beispiele und verwandte E3-Ligasen umfassen PSD-95–Mdm26, GKAP/SAPAP–Trim37,8, Shank/ProSAP7, SPAR–βTRCP9,10, AKAP79/1507, Homer-1a11, CaMKIIα12, Liprin-α1–APC/C13,14 , Ephexin-5–Ube3A15, Arc–Ube3a/Triad3a16,17, AMPA-Rezeptoren (AMPARs)–Nedd4-1/RNF167/APC/C14,18,19,20,21,22, NMDA-Rezeptoren (NMDARs)–Mib223, mGluR1α –Siah1A24,25, mGluR5–Siah1A25, GABAA-Rezeptoren (γ2-Untereinheit)26,27, Munc13-1–Fbxo4528, RIM1–SCRAPPER29 und Piccolo/Bassoon–Siah1A30.

Dorfin, eine RING-Finger-E3-Ubiquitin-Ligase, wurde ursprünglich als Bestandteil des XY-Körpers von Spermatozyten und Zentrosomen identifiziert31. Dorfin (bei Mäusen 840 Aminosäuren lang) enthält zwei RING-Domänen, die die In-Between-Ring-Domäne (IBR) flankieren, und zwei Transmembrandomänen, obwohl die genaue Membrantopologie des Proteins nicht genau bekannt ist. Frühere Studien haben Dorfin mit familiärer amyotropher Lateralsklerose (ALS) und der Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht32,33,34,35,36,37,38,39,40. Zur Unterstützung einer neuroprotektiven Rolle von Dorfin bei ALS ubiquitiniert Dorfin das ALS-assoziierte mutierte SOD1-Protein (Superoxiddismutase 1)33 und reduziert bei Überexpression in einem Mausmodell der familiären ALS die Menge mutierter SOD1-Proteine und unterdrückt neurologische Phänotypen und motorische Fähigkeiten Neuronentod40. Allerdings ist wenig über die Funktionen von Dorfin im normalen Gehirn bekannt, einschließlich seiner Protein-Protein-Wechselwirkungen, Substratproteine und funktionellen Konsequenzen der Ubiquitinierung von Substratproteinen. Darüber hinaus wurden die In-vivo-Funktionen von Dorfin nicht mithilfe von Gen-Knockout-Ansätzen untersucht.

In der vorliegenden Studie haben wir herausgefunden, dass Dorfin mit dem reichlich vorhandenen erregenden postsynaptischen Gerüstprotein PSD-95 interagiert. Dorfin-/−-Mäuse zeigen eine unterdrückte adulte Neurogenese und eine verstärkte Langzeitpotenzierung (LTP) im Gyrus dentatus (DG) sowie eine beeinträchtigte kontextuelle Angstkonditionierung, was darauf hindeutet, dass Dorfin für die adulte Neurogenese, synaptische Plastizität sowie Lernen und Gedächtnis wichtig ist.

Mithilfe eines Hefe-Zwei-Hybrid-Assays zum Screening einer Maus-Gehirn-cDNA-Bibliothek identifizierten wir Dorfin/Rnf19a als neuen Bindungspartner von PSD-95. Dorfin enthält zwei RING-Domänen, die durch die IBR-Domäne in der N-terminalen Hälfte getrennt sind, gefolgt von zwei mutmaßlichen Transmembrandomänen und einem C-terminalen PDZ-Domänenbindungsmotiv (Abb. 1A). Die letzten sieben Aminosäuren von Dorfin interagierten mit den PDZ1- und PDZ2-Domänen, nicht jedoch mit den PDZ3-Domänen von PSD-95 (Abb. 1B). Dorfin interagierte auch mit PDZ-Domänen von PSD-95-Verwandten (PSD-93/Chapsyn-110, SAP97, SAP102), jedoch nicht mit denen von S-SCAM, GRIP2 oder Shank1. Eine Dorfin-Mutante, bei der der letzte Aminosäurerest mutiert war (I840A), konnte nicht mit PSD-95 interagieren, was auf eine kanonische PDZ-Wechselwirkung hinweist. Diese PDZ-Wechselwirkungen wurden durch GST-Pulldown-Assays verifiziert, die zeigten, dass in heterologen Zellen exprimierte Proteine der PSD-95-Familie voller Länge durch GST-Dorfin heruntergezogen wurden, obwohl PSD-93 und SAP102 im Vergleich zu PSD-95 und schwächere Wechselwirkungen zeigten SAP97 (Abb. 1C). In-vitro-Koimmunpräzipitationsexperimente bestätigten unabhängig voneinander die PDZ-abhängigen Wechselwirkungen von Dorfin mit PSD-95 und SAP97 (Abb. 1D, E).

Dorfin interagiert mit Proteinen der PSD-95-Familie in Hefe-Two-Hybrid-, GST-Pulldown- und Koimmunpräzipitationstests.

(A) Domänenstruktur von Maus-Dorfin. IBR, Zwischenring; TM, Transmembrandomäne; PB, PDZ-Domänenbindungsmotiv. (B) Hefe-Zwei-Hybrid-Wechselwirkungen von Dorfin mit PSD-95. PDZ-Domänen von Proteinen der PSD-95-Familie, S-SCAM und anderen PDZ-Proteinen in pGAD10 (Beutevektor) wurden auf Bindung an Dorfin (aa 834–840; Wildtyp und die I840A-Mutante, in der der letzte Ile-Rest geändert wurde) getestet Ala) in pBHA (Ködervektor) in Hefe-Zwei-Hybrid-Assays. β-Galactosidase (β-Gal)-Aktivität: +++, <45 Min.; ++, 45–90 Min.; +, 90–240 Min.; −, keine signifikante β-Gal-Aktivität. HIS3-Aktivität: +++, >60 %; ++, 30–60 %;, +, 10–30 %; −, kein nennenswertes Wachstum. (C) Herunterziehen von Proteinen der PSD-95-Familie voller Länge und Kontroll-PDZ-Proteine (S-SCAM und GRIP2) durch GST-Dorfin-Fusionsproteine. GST-Dorfin (aa 834–840; WT und I840A) oder GST allein wurde verwendet, um die in HEK293T-Zellen exprimierten angegebenen Proteine zu senken, gefolgt von Immunblotting. (D,E) Koimmunpräzipitation von Dorfin mit PSD-95 oder SAP97. HEK293T-Zellen, die doppelt mit Flag-Dorfin (volle Länge; WT oder Δ3 ohne die letzten drei AA-Reste) und PSD-95 oder SAP97 transfiziert wurden, wurden mit Flag-Antikörpern immunpräzipitiert (IP) und mit den angegebenen Antikörpern immungeblottet.

Um die In-vivo-Funktionen von Dorfin zu untersuchen, haben wir Dorfin-/-Mäuse mithilfe eines Genfallen-Ansatzes erzeugt, bei dem das Intron zwischen den Exons 2 und 3 des Dorfin-Gens angegriffen wurde (Abb. 2A). Das gefangene Allel wurde durch Genotypisierung der Polymerasekettenreaktion (PCR) verifiziert (Abb. 2B). Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR) und quantitative PCR (qPCR) ergaben, dass Dorfin-mRNA sowohl im Kortex als auch im Hippocampus von Dorfin-/−-Mäusen nicht nachweisbar war (Abb. 2C–E).

Generation von Dorfin-/−-Mäusen.

(A) Diagramm, das die Struktur des Dorfin-Gens zeigt und Exons und Introns sowie die Stelle der Genfalleninsertion im Intron zwischen Exon 2 und Exon 3 zeigt. (B) Identifizierung des eingeschlossenen Dorfin-Gens durch PCR-Genotypisierung. (C) Positionen der Primer für RT-PCR und qPCR und einer Sonde für die In-situ-Hybridisierung im Dorfin-Gen der Maus. (D,E) Nicht nachweisbare Expression von Dorfin-mRNA im Dorfin-/−-Gehirn (2 Monate) durch konventionelle RT-PCR und qPCR. (F) Verteilungsmuster von Dorfin-mRNAs in Hirnschnitten von WT- und Dorfin-/-Mäusen (2 Monate), die durch In-situ-Hybridisierung aufgedeckt wurden. CA1- und DG-, CA1- und DG-Regionen des Hippocampus. Maßstabsleiste, 1 mm. (G) Verteilungsmuster von Dorfin-mRNA in Hirnschnitten von WT-Ratten (3 Monate), die durch In-situ-Hybridisierung aufgedeckt wurden. Cb, Kleinhirn; CPu, caudatus-putamen; Ctx, Großhirnrinde; OB, Riechkolben; Grube, Hypophyse. Maßstabsleiste, 5 mm.

In-situ-Hybridisierungsexperimente an Wildtyp- (WT) und Dorfin-/-Gehirnen zeigten, dass Dorfin-mRNA in verschiedenen Gehirnregionen von WT-Mäusen, einschließlich Kortex und Hippocampus, weit verbreitet exprimiert wird, wohingegen im Dorfin-/-Gehirn nahezu keine Signale nachweisbar waren (Abb. 2F). Auch in Rattengehirnen wurden weit verbreitete Dorfin-mRNA-Signale beobachtet (Abb. 2G). Bemerkenswerterweise waren die Dorfin-mRNA-Signale im Hippocampus in der DG-Region stärker als in der CA1-Region, insbesondere im Gehirn der Maus. Unsere Ergebnisse stimmen weitgehend mit Daten aus dem Allen Brain Atlas (http://www.brain-map.org/) für Maus-Dorfin-mRNA überein. Trotz wiederholter Versuche konnten wir die Expressions-/Verteilungsmuster des Dorfin-Proteins nicht charakterisieren, da geeignete Antikörper fehlen.

Die immunhistochemische Färbung von WT- und Dorfin-/−-Gehirnen unter Verwendung von Antikörpern gegen NeuN, einem neuronalen Marker, ergab, dass Dorfin-/−-Gehirne in der 4. und 8. postnatalen Woche eine normale grobe Morphologie aufweisen (Abb. 3A, B). Darüber hinaus zeigte eine Sholl-Analyse von Biocytin-injizierten Neuronen, dass Dorfin-/−-Hauptneuronen in den DG- und CA1-Regionen des Hippocampus eine normale dendritische Morphologie aufweisen (Abb. 3C–G). Dorfin-/−-Mäuse wuchsen in den Wochen 4 bis 8 nach der Geburt normal, wobei sowohl Männchen als auch Weibchen ein Körpergewicht aufwiesen, das mit dem von WT-Mäusen vergleichbar war (Abb. 3H). Darüber hinaus ergaben Immunoblot-Analysen von Hippocampus-Lysaten, der rohen synaptosomalen Hippocampus-Fraktion und mikrodissezierten DG-Lysaten, dass sich die Konzentrationen synaptischer Gerüst- und Rezeptorproteine zwischen den Genotypen nicht unterschieden (Abb. 3I).

Allgemeine Charakterisierung von Dorfin-/−-Mäusen.

(A,B) Normale grobe Morphologie des Dorfin-/−-Gehirns in den postnatalen Wochen 4 und 8, bestimmt durch Anfärbung des neuronalen Markers NeuN in koronalen und sagittalen Schnitten. Maßstabsleiste, 1,0 mm. (C–G) Normale dendritische Morphologie der Hauptneuronen in den CA1- und DG-Regionen des Hippocampus (2 Wochen), wie durch Biocytin-Injektion und Sholl-Analyse gezeigt. Maßstabsbalken, 50 μm. (Sem, CA1 basal, n = 6 Zellen von 4 Mäusen für WT und 7, 5 für KO; CA1 apikal, n = 7, 4 für WT und 7, 5 für KO; DG, n = 7, 5 für WT und 6 , 5 für KO). (H) Normales Körpergewicht männlicher und weiblicher Dorfin-/-Mäuse während der postnatalen Woche 4–8. (Sem, n = 17 für WT-Männer, 19 für KO-Männer, 17 für WT-Frauen und 14 für KO-Frauen). (I) Normale Konzentrationen synaptischer Gerüst- und Rezeptorproteine im Dorfin-/−-Hippocampus (2–3 Monate), wie durch Immunoblot-Analyse ganzer Hippocampus-Lysate, der rohen synaptosomalen (P2) Hippocampus-Fraktion und mikrodissezierter ganzer DG-Lysate gezeigt (sem , n = 3–6 für WT und KO).

Da Dorfin mit PSD-95, einem häufig vorkommenden exzitatorischen synaptischen Gerüstprotein, interagiert, untersuchten wir mögliche Veränderungen der exzitatorischen synaptischen Übertragung bei Dorfin-/-Mäusen. Granulatzellen in der Dorfin-/-DG-Region zeigten im Vergleich zu WT-Neuronen einen Anstieg der Amplitude, jedoch nicht der Frequenz, von erregenden postsynaptischen Miniaturströmen (mEPSCs) (Abb. 4A). Im Gegensatz dazu waren sowohl die Frequenz als auch die Amplitude der miniaturisierten inhibitorischen postsynaptischen Ströme (mIPSCs) in diesen Neuronen normal (Abb. 4B). Darüber hinaus war die Input-Output-Kurve an den Dorfin-/−-Medial-Perforant-Pathway-Synapsen auf DG-Körnerzellen (MPP-DG-Synapsen) normal, gemessen anhand der Steigungen der Feld-EPSPs (fEPSPs), aufgetragen gegen die Fasersalve-Amplituden (Abb. 4C). ). Schließlich waren die Diagramme des Paarimpulsverhältnisses gegenüber den Interstimulusintervallen normal (Abb. 4D), was auf eine unveränderte präsynaptische Freisetzungswahrscheinlichkeit schließen lässt.

Erhöhte LTP in der DG-, aber nicht in der CA1-Region des Dorfin-/−-Hippocampus.

(A) Erhöhte Amplitude, aber normale Frequenz von mEPSCs in Dorfin-/− DG-Körnerzellen (P15–17, sem, n = 19 Zellen von 5 Mäusen für WT und 21, 3 für KO, *p < 0,05, ns, nicht signifikant, Student-t-Test). (B) Normale Häufigkeit und Amplitude von mIPSCs in Dorfin-/− DG-Körnerzellen (P15–17, Sem, n = 17, 4 für WT und 15, 4 für KO, ns, nicht signifikant, Student-t-Test). (C) Normale Input-Output-Kurve, bestimmt durch Auftragen der Steigungen des Feld-EPSP (fEPSP) gegen die Fasersalve-Amplituden an Dorfin-/- MPP-DG-Synapsen (3 Wochen, n = 11 Scheiben von 4 Mäusen für WT und 13, 4 für KO). ). (D) Normales gepaartes Pulsverhältnis, bestimmt durch Auftragen der Verhältnisse zweier aufeinanderfolgender fEPSP-Steigungen gegen Interstimulusintervalle an Dorfin-/− MPP-DG-Synapsen (3 Wochen, n = 11 Scheiben von 4 WT-Mäusen und 13, 4 für KO). ). (E) Verstärktes LTP, induziert durch vier HFS-Züge an Dorfin-/− MPP-DG-Synapsen (4 Wochen, SEM, n = 7 Schnitte von 4 Mäusen für WT und 8, 7 für KO, *p < 0,05, Student's t- prüfen). (F) Normales NMDA/AMPA-Verhältnis an Dorfin-/− MPP-DG-Synapsen, bestimmt durch Vergleich der evozierten fEPSP-Steigungen bei den Haltepotentialen von –70 (AMPA) und +40 (NMDA) mV (3 Wochen, Sem, n = 11). Zellen von 6 Mäusen für WT und 8, 4 für KO, ns, nicht signifikant, Student-t-Test). (G) Normale Häufigkeit und Amplitude von mEPSCs in Dorfin-/− CA1-Pyramidenzellen (P15–17, Sem, n = 14 Zellen von 3 Mäusen für WT und 11, 3 für KO, ns, nicht signifikant, Student-t-Test) . (H) Normale Häufigkeit und Amplitude von mIPSCs in Dorfin-/− CA1-Pyramidenzellen (P15–20, Sem, n = 11, 3 für WT und 13, 4 für KO, ns, nicht signifikant, Student-t-Test). (J) Normales LTP, induziert durch HFS an Dorfin-/− SC-CA1-Synapsen (4 Wochen, n = 10 Scheiben von 6 Mäusen für WT und 8, 5 für KO, ns, nicht signifikant, Student-t-Test).

Interessanterweise war die LTP an MPP-DG-Synapsen, die durch vier Hochfrequenzstimulationszüge (HFS; 100 Hz) induziert wurde, bei Dorfin-/-Mäusen im Vergleich zu WT-Mäusen signifikant erhöht (Abb. 4E). Dies scheint nicht auf eine Zunahme der NMDAR-Funktion zurückzuführen zu sein, da das Verhältnis von NMDAR- und AMPAR-vermittelten Strömen an diesen Synapsen nicht verändert wurde (Abb. 4F), obwohl bekannt ist, dass LTP an MPP-DG-Synapsen von NMDARs abhängt41 ,42.

Da die CA1-Region des Hippocampus auch Dorfin-mRNA exprimiert, wenn auch in geringerem Maße als die DG, haben wir mögliche Veränderungen in mE/IPSCs und LTP in dieser Region getestet. Wir fanden heraus, dass weder mEPSCs noch mIPSCs in Dorfin-/−-CA1-Pyramidenneuronen verändert waren (Abb. 4G, H). Darüber hinaus blieb das durch HFS (100 Hz) induzierte LTP an den Dorfin-/− Schaffer-Kollateral-CA1-Pyramidensynapsen (SC-CA1) unverändert (Abb. 4I). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Deletion von Dorfin zu einer Verstärkung der LTP an MPP-DG-Synapsen, nicht jedoch an SC-CA1-Synapsen führt.

Als nächstes untersuchten wir, ob Dorfin-/−-Mäuse Verhaltensstörungen aufweisen. Dorfin-/−-Mäuse zeigten während der Light-off-Phase in einer vertrauten Umgebung eine erhöhte Bewegungsaktivität, gemessen durch 48-stündige kontinuierliche Überwachung der Bewegungen in einer vertrauten Umgebung, an die sich die Mäuse vor dem Test drei Tage lang gewöhnt hatten (Abb. 5A). ). Im Gegensatz dazu zeigten Dorfin-/-Mäuse eine normale Fortbewegung in einer neuartigen Umgebung, gemessen durch den Freilandtest (Abb. 5B), was darauf hindeutet, dass Dorfin-/-Mäuse in einer vertrauten, aber nicht neuartigen Umgebung hyperaktiv sind.

Dorfin-/−-Mäuse zeigen Hyperaktivität in einer vertrauten, aber nicht in einer neuartigen Umgebung und zeigen ein normales Maß an angstähnlichem Verhalten, Selbstpflege, Anfallsneigung, sozialer Interaktion und motorischer Koordination.

(A) Dorfin-/-Mäuse zeigen eine erhöhte Bewegungsaktivität in einer vertrauten Umgebung, gemessen durch 48-stündige kontinuierliche Überwachung der Mausbewegungen in einer vertrauten Umgebung, gemittelt in einem 24-Stunden-Zyklus (Laboras, n = 9 Mäuse für WT und 11 für KO, Zwei-Wege-ANOVA, Bonferroni-Post-hoc, ***p < 0,001, **p < 0,01, *p < 0,05, Student-t-Test für die gesamte zurückgelegte Distanz). (B) Dorfin-/-Mäuse zeigen im Freilandtest (neue Umgebung) eine normale Bewegungsaktivität. Beachten Sie, dass auch die im Mittelbereich verbrachte Zeit normal ist. (SEM, n = 13 Mäuse für WT und 11 für KO, ns, nicht signifikant, Zwei-Wege-ANOVA, Bonferroni-Post-hoc, Student-t-Test). (C–E) Dorfin-/−-Mäuse zeigen in erhöhten Plus-Labyrinth- (C), Hell-Dunkel-Box- (D) und neuheitsunterdrückten Fütterungstests (E) ein normales Maß an angstähnlichem Verhalten (Sem, n = 8 Mäuse für). WT und KO in erhöhten Plus-Labyrinth- und Hell-Dunkel-Box-Tests und 19 für WT- und KO-Mäuse im Neuheits-unterdrückten Fütterungstest, ns, nicht signifikant, Student-t-Test). (F–I) Dorfin-/−-Mäuse zeigen ein normales Maß an Selbstpflege (F), PTZ-induziertem Anfall (G), sozialer Drei-Kammer-Interaktion (H) und Rotarod-Motorkoordination (I) (sem, n = 8). Mäuse für WT und KO [Selbstpflege], 17 für WT und 14 für KO [Anfall], 8 für WT und KO [Dreikammer] und 12 für WT und KO [Rotarod], ns, nicht signifikant, Student's t- prüfen).

Als nächstes testeten wir mit drei verschiedenen Tests, ob Dorfin-/−-Mäuse angstähnliches Verhalten zeigen. Dorfin-/−-Mäuse verbrachten eine normale Zeitspanne im mittleren Bereich der offenen Feldarena (Abb. 5B), im offenen/geschlossenen Arm des erhöhten Plus-Labyrinths (Abb. 5C) und in der Hell-Dunkel-Kammer der Hell-Dunkel-Box (Abb. 5D). Im neuheitsunterdrückten Fütterungstest zeigten WT- und Dorfin-/−-Mäuse vergleichbare Latenzzeiten, um in einem neuartigen, offenen Feld zu fressen (Abb. 5E). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Dorfin-/−-Mäuse kein angstähnliches Verhalten zeigen.

Schließlich zeigten Dorfin-/−-Mäuse im Dreikammertest ein normales Selbstpflegeverhalten (Abb. 5F), einen durch Pentylentetrazol (PTZ) verursachten Anfall (Abb. 5G), soziale Interaktion und das Erkennen sozialer Neuheiten (Abb. 5H). ) und motorische Koordination im Rotarod-Test (Abb. 5I). Diese Ergebnisse deuten insgesamt darauf hin, dass Dorfin-/-Mäuse in einer vertrauten, aber nicht neuartigen Umgebung einen spezifischen Anstieg der Bewegungsaktivität zeigen, während andere getestete Verhaltensweisen normal sind.

Da Dorfin-/-Mäuse eine erhöhte LTP in der DG-Region des Hippocampus aufweisen, haben wir Dorfin-/-Mäuse einer Reihe von Lern- und Gedächtnisverhaltenstests unterzogen. Im Morris-Wasserlabyrinth-Test, der räumliches Lernen und Gedächtnis misst43, verhielten sich Dorfin-/−-Mäuse während der Lern-, Sonden- und Umkehrphase normal (Abb. 6A). Dorfin-/−-Mäuse zeigten auch in den T-Labyrinth-belohnten Veränderungstests und T-Maze-Spontanveränderungstests, die das räumliche Arbeitsgedächtnis messen, eine normale Leistung44 (Abb. 6B, C). Im neuartigen Objekterkennungstest, der das Objekterkennungsgedächtnis und die Präferenz für neuartige Objekte misst, zeigten WT- und Dorfin-/-Mäuse eine ähnliche Präferenz für das neuartige Objekt (Abb. 6D).

Dorfin-/−-Mäuse weisen ein spezifisches Defizit im kontextuellen Angstgedächtnis auf, nicht jedoch bei anderen Arten von Lern- und Gedächtnisverhalten.

(A) Dorfin-/−-Mäuse zeigen normales räumliches Lernen und Gedächtnis in den Lern-, Sonden- und Umkehrphasen des Morris-Wasserlabyrinthtests (T: Ziel, L: links, R: rechts, O: Gegenteil, Sem, n = 14). Mäuse für WT und 16 für KO, ns, nicht signifikant, Zwei-Wege-ANOVA, Bonferroni-Post-hoc, Student-t-Test). (B,C) Dorfin-/−-Mäuse zeigen ein normales räumliches Arbeitsgedächtnis in den T-Labyrinth-belohnten (B) und spontanen (C) Veränderungstests (8 Versuche über 2 Tage bilden einen Block; sem, belohnt, n = 7 für WT). und 8 für KO; spontan, n = 9 für WT und 11 für KO, ns, nicht signifikant, Zwei-Wege-ANOVA, Bonferroni-Post-hoc, Student-t-Test). (D) Dorfin-/−-Mäuse zeigen eine Präferenz für neuartige Objekte, die mit der von WT-Mäusen vergleichbar ist (sem, n = 8 für WT und 10 für KO, ns, nicht signifikant, Student-t-Test). (E–G) Dorfin-/−-Mäuse zeigen ein reduziertes kontextuelles Angstgedächtnis, aber normale Angstauslöschung und bedingte Angstkonditionierung. (Sem, kontextuelle Angstkonditionierung, n = 16 für WT und KO; kontextuelle Angstauslöschung, n = 16 für WT und KO; bedingte Angstkonditionierung, n = 13 für WT und 15 für KO, ns, nicht signifikant, ***S < 0,001, Zwei-Wege-ANOVA, Bonferroni-Post-hoc, Student-t-Test). (H) Dorfin-/-Mäuse zeigen eine unterdrückte Neurogenese im erwachsenen DG. Hippocampusschnitte von BrdU-injizierten Mäusen (6 Wochen) wurden dreifach für BrdU, Doublecortin (DCX) und DAPI markiert und die Anzahl der BrdU-positiven Zellen sowie der für BrdU und DCX doppelt positiven Zellen, normalisiert auf DAPI-positive Zellen, quantifiziert. Maßstabsbalken, 50 μm. (Sem, n = 3 Mäuse für WT und n = 4 für KO, *p < 0,05, Student-t-Test). (I) Normale Mustertrennung bei Dorfin-/-Mäusen. (Sem, n = 9 Mäuse für WT und n = 7 für KO, ns, nicht signifikant, Student-t-Test, Zwei-Wege-ANOVA, Bonferroni post-hoc).

Im kontextuellen Angstkonditionierungstest zeigten Dorfin-/−-Mäuse 24 Stunden nach der Konditionierung im Vergleich zu WT-Mäusen ein verringertes Gefrieren in derselben Schockkammer (Abb. 6E). Im Gegensatz dazu zeigten Dorfin-/-Mäuse ein kontextuelles Aussterben der Angst und eine konditionierte Angstkonditionierung, die mit denen von WT-Mäusen vergleichbar war (Abb. 6F, G). Diese Ergebnisse deuten insgesamt darauf hin, dass Dorfin-/−-Mäuse ein spezifisches Defizit bei der kontextuellen Angstkonditionierung aufweisen, nicht jedoch bei anderen Arten des Lernens und Gedächtnisses.

Die in der DG-Region von Dorfin-/−-Mäusen beobachteten Anstiege der mEPSC-Amplitude und des LTP könnten mit Veränderungen in der adulten Neurogenese zusammenhängen, von denen bekannt ist, dass sie die synaptische Plastizität im DG45 regulieren. Wenn Zellen im inneren Randbereich der DG-Körnerzellschicht mit BrdU, einem Marker für sich teilende Zellen, markiert wurden, war die Anzahl der BrdU-positiven Zellen im erwachsenen Dorfin-/− DG (6 Wochen) im Vergleich dazu signifikant reduziert bei WT-Mäusen (Abb. 6H). Darüber hinaus war die Anzahl der Zellen, die doppelt positiv für BrdU und Doublecortin, einen Marker für neu erzeugte Neuronen, waren, in der Dorfin-/−-DG signifikant reduziert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Deletion von Dorfin zur Unterdrückung der Neurogenese im erwachsenen DG führt.

Neurogenese im erwachsenen DG wurde neben räumlichem/kontextuellem Lernen und Gedächtnis auch mit der Trennung räumlicher Muster in Verbindung gebracht45,46,47. Daher haben wir Dorfin-/-Mäuse dem Kontextunterscheidungstest unterzogen und festgestellt, dass Dorfin-/-Mäuse normalerweise lernen konnten, zwei ähnliche Kontexte zu unterscheiden, von denen einer mit einem Fußschock verbunden ist (Abb. 6I).

Wenn Dorfin als Ubiquitin-Ligase im Gehirn fungiert, sollten wir in der Lage sein, einen Rückgang der Ubiquitinierungsniveaus von Dorfin-Substratproteinen im Dorfin-/−-Gehirn zu beobachten. Zu diesem Zweck haben wir Hippocampus-Lysate mit einem Antikörper immunpräzipitiert, der auf das K-GG-Peptid in ubiquitinierten Proteinen abzielt, gefolgt von Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrieanalysen (LC-MS/MS) der Präzipitate (Abb. 7A).

Proteomische Identifizierung von Proteinen mit reduzierter Ubiquitinierung im Dorfin-/− Hippocampus.

(A) Verfahren zur Identifizierung von Proteinen mit veränderter Ubiquitinierung im Dorfin-/−-Gehirn. Ubiquitinierte Peptide aus Hippocampus-Lysaten wurden mit dem K-GG-Antikörper immunaffinitätsgereinigt, gefolgt von einer Tandem-Massenspektrometrie-Analyse (LC-MS/MS) zur qualitativen Sequenzierung, Identifizierung der Zielstelle und Quantifizierung. (n = 6 Mäuse für WT und 8 für KO in jeweils einer Probe). (B) Liste der Proteine, deren Ubiquitinierungsniveaus im Dorfin-/−-Hippocampus im Vergleich zu WT-Kontrollen um das > 2,5-fache verringert sind (siehe auch Ergänzungstabelle 1). Grüne Kreise zeigen die Proteine an, deren Expressionsniveaus durch Immunoblot von Hippocampus-Lysaten getestet wurden (siehe auch Abb. 7H). (C–G) Dorfin bildet einen Komplex mit fünf ausgewählten Proteinen aus der Liste in Abb. 7B. HEK293-Zellen, die Myc-Dorfin und die angegebenen Proteine doppelt exprimierten, wurden immunpräzipitiert und mit Myc- oder EGFP-Antikörpern immungeblottet. Rab11b (C), NFM (D), PPP1CA (E), PPP1CB (F) und H2AFZ (G). Eingabe: 5 %. (H) Proteinexpressionsniveaus im Dorfin-/−-Hippocampus (2–3 Monate) im Vergleich zu denen in WT-Kontrollen, bestimmt durch die Immunblot-Analyse ganzer Hippocampus-Lysate, der rohen synaptosomalen (P2) Hippocampus-Fraktion und mikrodissezierter ganzer DG-Lysate . (Sem, n = 3–6 für WT- und KO-Hippocampi).

Wir sortierten positive Proteine in der Reihenfolge der stärkeren Abnahme der Ubiquitinierung und erstellten eine Liste von 24 Proteinen, deren Ubiquitinierungsniveaus im Dorfin-/−-Gehirn im Vergleich zu WT-Kontrollen erheblich verringert waren (>2,5-fach) (Ergänzungstabelle S1). Diese Proteine könnten in mehrere funktionelle Gruppen eingeteilt werden, darunter Adhäsionsmoleküle/extrazelluläre Matrix, Adapter/Gerüste, G-Protein-verwandte Proteine, Phosphatasen, Proteasen, Enzyme und Zellzyklus-/Chromatin-regulatorische Proteine (Abb. 7B).

Mithilfe von Koimmunpräzipitationsexperimenten in heterologen Zellen konnten wir die Assoziation einiger dieser Proteine mit Dorfin verifizieren (Abb. 7C – G). Zu diesen Proteinen gehörten Rab11b (eine kleine GTPase), Neurofilament M, die α- und β-Untereinheiten der PP1-Phosphatase und Histon H2A. Unerwarteterweise wurde festgestellt, dass keines dieser fünf Proteine ubiquitiniert ist, wenn es zusammen mit Dorfin in heterologen Zellen exprimiert wird (ergänzende Abbildung 1). Darüber hinaus waren ihre Proteinspiegel in Dorfin-/-Mäusen unverändert, wie durch Immunoblot-Analyse von Hippocampus-Lysaten, der rohen Synaptosomenfraktion des Hippocampus und mikrodissezierten DG-Lysaten gemessen wurde (Abb. 7H). Darüber hinaus gab es keine Änderungen in den Expressionsniveaus anderer Proteine in der Liste, einschließlich ATP6V1A, Plexin A1/A4, NPEPPS, 14-3-3 η/ζ und Gelsolin (Abb. 7H). Daher scheint die Deletion von Dorfin in vivo keine nachweisbare Verringerung der Konzentrationen der getesteten Proteine zu verursachen.

Unsere Studie zeigt, dass die Deletion von Dorfin bei Mäusen zu einer verringerten Neurogenese im DG, einem erhöhten LTP im MPP-DG-Signalweg und einem spezifischen Verhaltensdefizit bei der kontextuellen Angstkonditionierung führt, jedoch nicht bei anderen Arten des Lernens und Gedächtnisses. Wir haben Dorfin auch als neuen Bindungspartner von PSD-95 identifiziert und eine Reihe von Proteinen identifiziert, deren Ubiquitinierungsniveaus in Dorfin-/-Mäusen verringert sind.

Die funktionelle Bedeutung der Wechselwirkung zwischen Dorfin und PSD-95 wurde in der vorliegenden Studie nicht direkt untersucht. Da PSD-95 jedoch ein häufig vorkommendes Gerüstprotein ist, das an erregenden Synapsen angereichert ist, ist es möglich, dass PSD-95 das synaptische Targeting von Dorfin fördert, wie für viele andere mit PSD-95 interagierende Proteine gezeigt wurde48,49. Da es sich bei PSD-95 um ein Multidomänenprotein handelt, das mit verschiedenen Membran-, Signal- und Gerüst-/Adaptorproteinen49 interagiert, interagieren E3-Ligasen häufig mit Adaptor-/Gerüstproteinen, um das Spektrum der Substratproteine zu erweitern1,2,3,4,5. PSD-95 könnte als Gateway fungieren, über das Dorfin mit verschiedenen Substraten interagiert. Dies erinnert an die Wechselwirkung zwischen dem synaptischen PDZ-Protein CASK/LIN-2 und Parkin50, einer E3-Ubiquitin-Ligase, von der bekannt ist, dass sie die Anzahl und Stärke exzitatorischer Synapsen negativ reguliert51 und postmitotische Neuronen vor Exzitotoxizität schützt52. Ein weiteres Beispiel ist die Wechselwirkung von Piccolo und Bassoon, zwei großen Proteinen der aktiven Zone, die den präsynaptischen Proteinaufbau steuern53, mit Siah1 (einer E3-Ubiquitin-Ligase), von der angenommen wird, dass sie die Aufrechterhaltung der synaptischen Integrität durch Modulation des präsynaptischen Proteinabbaus fördert30.

Dorfin-/-Mäuse zeigten zwei synaptische Phänotypen im Hippocampus: erhöhte mEPSC-Amplitude in DG-Körnerzellen und verstärktes HFS-induziertes LTP an MPP-DG-Synapsen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Dorfin möglicherweise negative Einflüsse auf die synaptischen AMPARs sowie auf LTP hat. Verhaltensmäßig zeigten Dorfin-/−-Mäuse eine spezifische Beeinträchtigung der kontextuellen Angstkonditionierung, jedoch nicht bei anderen Arten des Lernens und Gedächtnisses, einschließlich räumlichem Lernen und Gedächtnis (Morris-Wasserlabyrinth), Gedächtnis für die Erkennung neuartiger Objekte und räumlichem Arbeitsgedächtnis (T-Labyrinth). Angstaussterben, bedingte Angstkonditionierung und Mustertrennung.

Es ist unklar, wie die Dorfin-Deletion zu einem Anstieg der mEPSC-Amplitude und des LTP im DG führt, obwohl sie wahrscheinlich mit einem Anstieg der Anzahl oder Funktion von AMPARs unter Basalbedingungen oder während des LTP einhergehen. Die Phosphorylierung von zwei Stellen auf der GluA1-Untereinheit von AMPARs, S831 und S845, ist an der Regulierung der biophysikalischen Eigenschaften von AMPARs und der AMPAR-vermittelten synaptischen Plastizität beteiligt54,55. Unsere Daten zeigten jedoch, dass die Werte dieser Phosphorylierungen im Dorfin-/−-Gehirn unverändert waren, was diese Möglichkeit ausschließt.

Unsere Daten unterstützen zusätzlich die Annahme, dass E3-Ubiquitin-Ligasen die synaptische Plastizität sowie das Lernen und das Gedächtnis regulieren. Es wurde gezeigt, dass ein mütterlicher Mangel an Ube3A (Ubiquitin-Proteinligase E3A) LTP unterdrückt und die kontextuelle Angstkonditionierung bei Mäusen beeinträchtigt56. Darüber hinaus unterdrückt der Abbau von Praja2 (Praja-Ringfinger 2, E3-Ubiquitin-Proteinligase) bei Ratten das späte LTP57. Spätes LTP und kontextuelle Angstkonditionierung werden bei Mindbomb-1−/−-Mäusen58 und APC/C-Cdh1−/−-Mäusen59,60 unterdrückt. Schließlich werden bei Scrapper−/−- bzw. Scrapper+/−-Mäusen eine erhöhte LTP und eine unterdrückte Angstkonditionierung beobachtet61,62.

Unsere Ergebnisse sind insofern einzigartig, als eine E3-Deletion in der DG-Region (nicht CA1) des Hippocampus LTP sowie Lernen und Gedächtnis verändert. Dies steht im Einklang mit der berichteten Assoziation von Hippocampus-DG-Körnerzellen mit räumlichem Verhalten und kontextueller Angstkonditionierung63,64,65. Darüber hinaus deutet dies darauf hin, dass E3-Ligasen in verschiedenen Gehirnregionen zusätzlich zur Hippocampus-CA1-Region wichtig für die Regulierung der synaptischen Plastizität sind, wie zuvor in der Amygdala von APC/C-Cdh1-/−-Mäusen66, dem Striatum von Parkin-/ − Mäuse67 und visueller Kortex von Ube3am−/p+-Mäusen68.

Ein bemerkenswertes Ergebnis war, dass entgegen unseren Erwartungen eine erhöhte – nicht verringerte – LTP bei Dorfin-/−-Mäusen mit einer beeinträchtigten kontextuellen Angstkonditionierung verbunden war. Frühere Studien an Mäusen, denen beispielsweise Fmr2-, Gα1-, PDE4D-, IRSp53- und SCRAPPER-Proteine fehlen, haben jedoch einen Zusammenhang zwischen verstärkter Hippocampus-LTP im Schaffer-Kollateralweg und verminderter kontextueller Angstkonditionierung ergeben61,62,69,70,71,72,73. Zusammen mit unseren Ergebnissen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass eine Abweichung des Hippocampus-LTP in beide Richtungen in der DG- oder CA1-Region zu ähnlichen Beeinträchtigungen beim Lernen und Gedächtnis führen kann.

Obwohl die Mechanismen, die zu einer erhöhten LTP und einer beeinträchtigten kontextuellen Angstkonditionierung bei Dorfin-/−-Mäusen führen, noch geklärt werden müssen, könnte die Liste der Proteine, deren Ubiquitinierungsniveaus bei Dorfin-/−-Mäusen um mehr als das 2,5-fache reduziert waren, einige Ansatzpunkte liefern. Tatsächlich sind viele dieser Proteine in der postsynaptischen Dichte (PSD) angereichert und an der Regulierung der erregenden synaptischen Übertragung, der synaptischen Plastizität sowie des Lernens und Gedächtnisses beteiligt (Ergänzungstabelle S1). Beispielsweise fördert Rab11a/b die Translokation von Recycling-Endosomen in dendritische Stacheln und die lokale Exozytose von GluA1 während der LTP74,75,76,77. Daher würden Dorfin-abhängige Ubiquitinierung und Abbau von Rab11a/b-Proteinen LTP negativ regulieren. Darüber hinaus zeigen transgene Mäuse, bei denen die Signaladapter 14-3-3η und 14-3-3ζ durch die genetische Expression eines Inhibitorproteins funktionell gehemmt werden, eine Verringerung des synaptischen Inhalts von NMDARs, der NMDAR-vermittelten synaptischen Übertragung, der LTP und der kontextuellen Angstkonditionierung78 , was darauf hindeutet, dass 14-3-3η und 14-3-3ζ die synaptische Plastizität sowie das Lernen und das Gedächtnis positiv regulieren. Daher können diese Funktionen durch den Dorfin-abhängigen 14-3-3-Proteinabbau unterdrückt werden.

Entgegen unserer ursprünglichen Erwartung deuten unsere Daten darauf hin, dass einige der Proteine, die in Dorfin-/−-Mäusen eine verringerte Ubiquitinierung aufwiesen, im mutierten Gehirn in normalem Ausmaß exprimiert wurden, obwohl wir nachgewiesen haben, dass sie in vitro mit Dorfin assoziieren. Es wurde jedoch gezeigt, dass die Protein-Ubiquitinierung andere Funktionen als den Proteinabbau hat, wie z. B. die Modulation der Proteinfunktion, Endozytose und subzelluläre Lokalisierung sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen1,2,3,4,5. Unsere Daten deuten darauf hin, dass mindestens die fünf Proteine, von denen wir gezeigt haben, dass sie mit Dorfin einen Komplex bilden (Rab11b, Neurofilament-M, katalytische PP1-α-Untereinheit, katalytische PP1-β-Untereinheit und Histon H2A.Z), in heterologen Zellen nicht direkt ubiquitiniert sind. Da bei einem unvoreingenommenen Screening festgestellt wurde, dass diese Proteine im Dorfin-/-Hippocampus weniger ubiquitiniert sind, erfordert ihre Ubiquitinierung möglicherweise bestimmte Bedingungen, die nur in neuronalen/Gehirnumgebungen vorkommen, oder einige andere Proteine als diese fünf Proteine können von Dorfin heterolog ubiquitiniert werden Zellen.

Schließlich deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass die Neurogenese im erwachsenen DG von Dorfin unterdrückt wird. Da die adulte Neurogenese im DG mit der Regulierung der synaptischen Plastizität an den DG-Synapsen und Hippocampus-abhängigen Verhaltensweisen, einschließlich Mustertrennung und räumlichem/kontextuellem Lernen und Gedächtnis, in Verbindung gebracht wird, ist die Neurogenese beim Dorfin-/− Erwachsenen reduziert DG könnte mit der erhöhten LTP und der beeinträchtigten kontextuellen Angstkonditionierung bei diesen Mäusen verbunden sein. Da jedoch gezeigt wurde, dass eine verringerte adulte Neurogenese sowohl LTP als auch LTD80 unterdrückt, weichen unsere Ergebnisse, bei denen eine verringerte Neurogenese mit verstärktem (aber nicht unterdrücktem) LTP verbunden war, von den vorherigen Ergebnissen ab. Allerdings wurde in früheren Studien eine verminderte Neurogenese bei erwachsenen DG mit einer verminderten Leistung bei der kontextuellen Angstkonditionierung in Verbindung gebracht45,81, was mit unseren Ergebnissen übereinstimmt.

Zusammenfassend identifiziert unsere Studie die E3-Ubiquitin-Ligase Dorfin als einen neuen Liganden von PSD-95 und liefert In-vivo-Beweise, die die Hypothese stützen, dass Dorfin die Neurogenese bei Erwachsenen, die erregende synaptische Übertragung, die synaptische Plastizität und die kontextuelle Angstkonditionierung regulieren könnte.

Dorfin-cDNA voller Länge wurde durch PCR aus einer Rattenhirn-cDNA-Bibliothek amplifiziert und in GW1 (British Biotechnology) subkloniert. Für Flag-Dorfin wurde Ratten-Dorfin in GW1 PCR-amplifiziert und in den Vektor p3XFLAG-CMV-7.1 (Sigma) subkloniert. Für Myc-Dorfin wurde Ratten-Dorfin in voller Länge in pGW1-Myc subkloniert. Es wurden PSD-95, EGFP-PSD-93, EGFP-SAP97, EGFP-SAP102, EGFP-S-SCAM und Myc-GRIP2 in voller Länge für GST-Pulldown beschrieben82. pCFP-Rab11b in voller Länge war ein freundliches Geschenk von Dr. Wondo Heo von KAIST. pEGFP-mNFM, pEGFP-PP1α, pEGFP-PP1β und pRK5-HA-Ub in voller Länge wurden von Addgene erhalten (ID # 32909, 44224, 44223 bzw. 17608). pEGFP-H2Afz wurde durch PCR aus einer Maushirn-cDNA-Bibliothek amplifiziert und in pEGFP-N1 subkloniert.

Die folgenden Antikörper wurden beschrieben: EGFP83, PSD-93, SAP97, SAP102, S-SCAM84 und GluA185. Die folgenden Antikörper wurden aus kommerziellen Quellen erworben: monoklonaler Maus-PSD-95 K28/43, GluN2B N59/36 (UC Davis/NIH NeuroMab Facility), NR1/GluN1 (BD Pharmingen), GluN2A, NPEPPS, NeuN (Millipore), pGluR1 S831 und S845 (Zellsignalisierung), GluA2, polyklonales Kaninchen- und monoklonales Maus-Myc, ATP6V1A, Rab11, 14-3-3η, 14-3-3ζ, PP1, Ubiquitin (Santa Cruz Biotechnology), monoklonales Maus-HA (Roche Molecular Biochemicals), Maus monoklonaler Flag M2 (Sigma), α-Tubulin (Sigma), GABARα1 (SySy), Doublecortin, Plexin A1 und A4, Gelsolin (Abcam), BrdU (Novus Biologicals). Immunoblot-Assays wurden mit Odyssey Fc (LI-COR Biosciences) durchgeführt.

Die letzten 7 Aminosäuren von Maus-Dorfin (AA 834–840, WT und I840A) wurden durch Annealing von Oligonukleotiden und deren Subklonierung in pBHA erzeugt. Die PDZ-Domänen verschiedener Proteine wurden wie zuvor beschrieben in pGAD10 (ein Beutevektor: Clontech) subkloniert86. Hefe-Zwei-Hybrid-Tests wurden wie zuvor beschrieben durchgeführt87.

Zum Herunterziehen wurden die letzten sieben Aminosäuren von Maus-Dorfin (aa 834–840, WT und I840A) durch Annealing von Oligonukleotiden und deren Subklonierung in pGEX-4T-1 (Amersham Pharmacia Biotech) erzeugt. Zum Pulldown wurden HEK293T-Zellen mit PSD-95, EGFP-SAP97, EGFP-PSD-93, EGFP-SAP102, EGFP-S-SCAM und Myc-GRIP2 transfiziert. Die abgezogenen Niederschläge wurden durch Immunblotting mit PSD-95-, EGFP- und Myc-Antikörpern analysiert.

Die In-situ-Hybridisierung wurde wie zuvor beschrieben82 durchgeführt. Hybridisierungssonden für Maus-Dorfin-mRNA wurden unter Verwendung von nt 2161–2820 von Maus-Dorfin (NM_013923.2) hergestellt und in den pGEM-7Zf-Vektor subkloniert. Hybridisierungssonden für Ratten-Dorfin-mRNA wurden unter Verwendung von nt 2609–3187 von Ratten-Dorfin (NM_001130560.1) hergestellt und in den pGEM-7Zf-Vektor subkloniert.

Myc-Dorfin und HA-Ubiquitin wurden dreifach oder zweifach (ohne Dorfin) mit EGFP-Rab11b, EGFP-NFM, EGFP-PPP1CA, PPP1CB-EGFP oder H2Afz-EGFP in HEK293-Zellen transfiziert. Zelllysate (2 % SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl), verdünnt mit einem Verdünnungspuffer (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 % Triton X-100), wurden mit EGFP-Antikörpern inkubiert. gefolgt von Immunpräzipitations- und Immunblot-Analysen.

Dorfin-/-Mäuse wurden aus Mäusesperma erzeugt, wobei die Genfallenkassette in das Intron zwischen Exon 2 und Exon 3 des Dorfin-Gens eingefügt wurde, erhalten von TIGM (OST244733). Mäuse mit dem genetischen Hintergrund von 129/SvEv wurden über mehr als fünf Generationen mit C57BL6-Mäusen rückgekreuzt. Mäuse für Experimente wurden durch Paarung männlicher und weiblicher heterozygoter Mäuse gewonnen. Die Mäuse wurden gemäß den Anforderungen der Tierforschung am KAIST gehalten und alle Verfahren wurden vom Ausschuss für Tierforschung am KAIST genehmigt (KA2012-19). Alle Experimente mit Mäusen wurden gemäß den einschlägigen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Die Mäuse wurden in einer Standardkäfigumgebung mit 12-stündigen Licht- und Dunkelzyklen gehalten.

Primer für die Genotypisierungs-PCR waren 5′-CGG-GCT-GGG-TTT-ACA-TAG-AA-3′ (WT 5′), 5′-GAC-CCA-AAT-GTC-CAT-CAA-CC-3′ ( WT 3′) und 5′-CAA-AAT-GGC-GTT-ACT-TAA-GC-3′ (Falle 5′). Die Primer für die RT-PCR bestanden aus 4 Sätzen. Dorfin 1: 5′-ACT-GAA-CGG-TTT-AAT-CCT-C-3′ und 5′-CTG-TTC-CAC-AGC-CTT-CTC-3′. Dorfin 2: 5′-TGT-TTC-AAC-AGG-TTG-GAA-GTA-3′ und 5′-GCG-TTA-TCA-CTA-ACT-GTT-CCC-AAG-3′. Dorfin 3: 5′-ATC-AAG-GGA-GCT-CAA-TGG-TGG-3′ und 5′-GCA-TCA-CAG-GTC-TGG-TTT-GG-3′Dorfin 4: 5′-GCA- AGA-TGG-TGG-CAG-TTT-TT-3′ und 5′-CTA-ATG-GGA-CCG-TCT-TCT-GC-3′. Primer für qPCR waren 5′-ACT-GAA-CGG-TTT-AAT-CCT-C-3′ und 5′-CTG-TTC-CAC-AGC-CTT-CTC-3′.

Von Mäusen wurden im Alter von 4 und 8 Wochen Gehirnschnitte hergestellt. Gehirnschnitte (50 μm) wurden 30 Minuten lang mit 0,5 % TritonX-100 permeabliert und mit dem NeuN-Antikörper angefärbt. Nach 24 Stunden wurden die Schnitte zwei Stunden lang mit sekundären Antikörpern gefärbt, gefolgt von der Bildaufnahme mit einem konfokalen Mikroskop (LSM780, Carl Zeiss).

5-Brom-2′-desoxyuridin (BrdU, Sigma) wurde Mäusen 3 Tage lang intraperitoneal (50 mg/kg) injiziert (6 Wochen). Fünf Tage nach der letzten Injektion wurden die Mäuse mit 4 % Paraformaldehyd perfundiert. Mit dem Vibratom erhaltene fixierte Hirnschnitte (50 μm) wurden 10 Minuten lang in 1 N HCl auf Eis inkubiert, gefolgt von 10 Minuten lang 2 N HCl bei RT, bevor sie 20 Minuten lang in einen Inkubator mit 37 ° C gebracht wurden. Boratpuffer (0,1 M) wurde 12 Minuten lang bei RT zu den Scheiben gegeben. Anschließend wurden die Schnitte 12 Stunden lang bei 4 °C mit BrdU- und DCX-Antikörpern inkubiert, gefolgt von einer Sekundärantikörperfärbung und -montage unter Verwendung von Vectashield und DAPI. Schnittbilder wurden durch konfokale Mikroskopie (LSM780, Zeiss) aufgenommen.

Pyramidenneuronen in der CA1-Region und Körnerzellen in der DG-Region des Hippocampus wurden zufällig ausgewählt und 5 Minuten lang mit Biocytin (0,5 %) infundiert. Nach der Injektion wurden die Schnitte gesammelt und 24 Stunden lang mit 4 % Paraformaldehyd fixiert. Die Schnitte wurden mit Streptavidin-Antikörper gefärbt. Die Bilder wurden mit 20-fach-Objektiven (LSM 780, Carl Zeiss) aufgenommen. Die Schnittpunkte dendritischer Zweige wurden blind manuell analysiert.

Die rohe synaptosomale (P2) Fraktion von Hippocampi erwachsener Mäuse (2–3 Monate) wurde wie zuvor beschrieben88 hergestellt. Ganze Hippocampus/DG-Lysate wurden unter Verwendung von Homogenisierungspuffer (0,32 M Saccharose, 10 mM HEPES, 2 mM EDTA) hergestellt. Für die DG-Mikrodissektion verwendeten wir ein Vibratom, um Hirnscheiben (400 μm) zu schneiden und DG zu präparieren.

Hippocampusgewebe wurden in flüssigem Stickstoff eingefroren, gefolgt von der Ubiscan-Analyse (Zellsignalisierung) mittels K-GG-Peptid-Immunpräzipitation und LC-MS/MS (LTQ-Orbitrap-Velos und ESI-CID). MS/MS-Spektren wurden mit SEQUEST 3G und der SORCERER 2-Plattform von Sage-N Research (Version 4.0, Milpitas CA) analysiert.

Sagittale Schnitte des Hippocampus (300 μm für Ganzzellaufnahmen, 400 μm für Feldaufnahmen) wurden mit einem Vibratom (VT1200S, Leica) in eiskaltem Schnittpuffer (212 mM Saccharose, 25 mM NaHCO3, 5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM D-Glucose, 2 mM Natriumpyruvat, 1,2 mM Natriumascorbat, 3,5 mM MgCl2 und 0,5 mM CaCl2, durchgeperlt mit 95 % O2/5 % CO2) und bei 32 °C in aCSF (125 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 10 mM D-Glucose, 1,3 mM MgCl2 und 2,5 mM CaCl2). Nach 30 Minuten wurden die Scheiben bei Raumtemperatur gehalten. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufzeichnungen und Feldpotentialaufzeichnungen wurden wie zuvor beschrieben72 durchgeführt. Die Aufnahmen wurden mit dem Verstärker Multiclamp 700B und dem Axopatch 200B durchgeführt. Die Daten wurden mit Clampfit 10.2 (Molecular Devices) analysiert.

Ganzzellaufzeichnungen für mEPSCs und das NMDA/AMPA-Verhältnis wurden mit Aufzeichnungspipetten (3–5 MΩ) durchgeführt, die mit interner Lösung (117 mM CsMeSO4, 10 mM TEA-Cl, 8 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM QX-314) gefüllt waren -Cl, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP und 10 mM EGTA). Für mIPSC-Messungen wurden Pipetten mit einer Lösung gefüllt, die 115 mM CsCl, 10 mM TEA-Cl, 8 mM NaCl, 10 mM HEPES, 5 mM QX-314-Cl, 4 mM Mg-ATP, 0,3 mM Na-GTP enthielt. 10 mM EGTA. Alle internen Lösungen wurden auf einen pH-Wert von 7,3 und 290–300 mOsm eingestellt. Die Signale wurden bei 1,0 kHz für mEPSCs und mIPSCs und bei 2,0 kHz für NMDA/AMPA-Verhältnisexperimente gefiltert. Für mEPSCs wurden Picrotoxin (50 μM) und TTX (0,5 μM) zu aCSF hinzugefügt. Für die mIPSC-Aufzeichnung wurden Picrotoxin (50 μM), NBQX (10 μM) und AP5 (25 μM) hinzugefügt. Für Experimente zum NMDA/AMPA-Verhältnis wurde Picrotoxin (100 μM) hinzugefügt. mEPSC- und mIPSC-Aufzeichnungen wurden 2 Minuten lang bei einem Haltepotential von –70 mV durchgeführt. Für Experimente zum NMDA/AMPA-Verhältnis wurden EPSCs mit einer Glaspipette hervorgerufen, die aCSF enthielt und im MPP-DG-Weg positioniert war. AMPA EPSCs wurden bei –70 mV aufgezeichnet. Nachdem 25–30 stabile Spuren erhalten wurden, wurde das Haltepotential auf +40 mV geändert, um NMDA-EPSCs (20 Spuren) aufzuzeichnen. Für das NMDA/AMPA-Verhältnis wurden NMDA-EPSCs 50 ms nach der Stimulation verwendet.

Feldpotenzialaufzeichnungen wurden mit mit aCSF gefüllten Aufzeichnungspipetten durchgeführt. Für Eingabe/Ausgabe- und gepaarte Pulsverhältnisaufzeichnungen wurden vor Beginn der Hauptexperimente 10 Minuten lang stabile fEPEPs aufgezeichnet. Für Eingabe-/Ausgabeaufzeichnungen wurden die Reize schrittweise erhöht, um Fasersalve-Amplituden von 0,05–0,3 mV/ms zu induzieren, und es wurden 3 Spuren pro Reiz aufgezeichnet. Bei gepaarten Pulsverhältnisaufzeichnungen betrugen die Intervalle zwischen den Reizen 25, 50, 100, 200 und 300 ms. Die Aufnahmen wurden dreimal wiederholt. Für die Hochfrequenzstimulations-LTP wurde dem aCSF Picrotoxin (100 μM) zugesetzt. Nachdem 20 Minuten lang stabile Grundreaktionen erhalten wurden, wurde ein einzelner Stimulus von 100 Hz (1 Sek.) an den SC-CA1-Signalweg gegeben, und es wurden vier Züge von 100-Hz-Stimuli (jeweils 1 Sek.; 20-Sek.-Intervall zwischen den Zügen) gegeben der MPP-DG-Weg. Die Antworten wurden eine Stunde lang aufgezeichnet.

Zur langfristigen kontinuierlichen Überwachung der Mausbewegungen verwendeten wir das LABORASTM-System (Metris), das darauf ausgelegt ist, Vibrationen zu erkennen, die von den Bewegungen einer Maus im Käfig herrühren. Die Mäuse wurden einzeln isoliert und 3 Tage lang in LABORAS-Käfigen im Aufnahmeraum untergebracht. Nach der Gewöhnung wurde der LABORAS-Käfig mit einer Maus 72 Stunden lang auf eine vibrationsempfindliche Aufnahmeplattform gestellt. Die Daten der letzten 48 Stunden wurden analysiert und zu 24-Stunden-Zyklen gemittelt.

Die Mäuse wurden in eine 40 × 40 × 40 cm große Box gelegt und ihre horizontale Bewegungsaktivität eine Stunde lang bei völliger Dunkelheit (~ 0 Lux) aufgezeichnet. Die Mittelzonenlinie war 10 cm vom Rand entfernt. Die Bewegungen wurden mit Ethovision XT 10 (Noldus) analysiert.

Das auf eine Höhe von 50 cm über dem Boden stehende Labyrinth bestand aus zwei offenen Armen, zwei geschlossenen Armen und einer Mittelzone. Mäuse, die in der Mittelzone platziert wurden, wurden 7 Minuten lang in ihren Bewegungen aufgezeichnet und die Zeit, die sie in geschlossenen oder offenen Armen verbrachten, manuell analysiert.

Die Box hatte eine Abmessung von 12 × 30 × 20 cm für die Lichtkammer (~250–300 Lux) und 14 × 13 × 20 cm für die Dunkelkammer (~0–5 Lux). Eine Maus wurde in der Mitte der Lichtkammer platziert, gefolgt von einer 10-minütigen Bewegungsüberwachung. Die in der hellen oder dunklen Kammer verbrachte Zeit wurde manuell analysiert.

Die Mäuse wurden 24 Stunden lang ausgehungert und dann in eine 40 × 40 × 40 cm große Box gegeben. Ein Futterpellet wurde in die Mitte der Box gelegt und die Latenzzeit bis zur Annäherung an das Futter und zum Essen wurde gemessen.

Die Mäuse wurden in einen leeren Heimkäfig gesetzt und ihr Selbstpflegeverhalten 10 Minuten lang aufgezeichnet. Selbstpflegeverhalten wurde als Streicheln oder Kratzen von Gesicht, Kopf oder Körperbereichen mit den Vorderbeinen oder das Lecken von Körperteilen definiert. Die Zeit der Selbstpflege wurde blind gemessen.

Den Mäusen wurden 50 μg/Gewicht (g) Pentylentetrazol (PTZ) in die intraperitoneale Höhle injiziert und 10 Minuten lang Anfälle aufgezeichnet. Anfälle wurden als konvulsive Bewegungen einschließlich klonischer und/oder tonisch-klonischer Anfälle beim Liegen auf der Seite und/oder beim wilden Springen definiert.

Dieser Test wurde durchgeführt, um die soziale Interaktion und die Erkennung sozialer Neuheiten zu messen89. Die Apparatur bestand aus 3 Kammern mit den Abmessungen 12 × 20 × 26 cm für die Mittelkammer und 14 × 20 × 26 cm für die Seitenkammern. In beiden Seitenkammern befanden sich in den Ecken Plastikkäfige, in denen Gegenstände oder Mäuse untergebracht werden konnten. Das Experiment bestand aus 4 Sitzungen, einschließlich Gewöhnung an die mittlere Kammer (10 Min.), Gewöhnung an alle Kammern (10 Min.), Objekt-/Maus-Erkundung (10 Min.) und alte/neue Maus-Erkundung (10 Min.). In der dritten Sitzung wurde eine WT-fremde Maus vorsichtig in einen Plastikkäfig eingesperrt und ein unbelebter Gegenstand in den gegenüberliegenden Plastikkäfig gelegt. Den Mäusen wurde erlaubt, sich frei zu bewegen und zu erkunden. Für die Analyse der sozialen Interaktion wurden Schnüffel- und Kammerzeiten gemessen. Als Schnüffeln wurde definiert, dass die Nase der Maus auf das Zielobjekt oder die Maus gerichtet ist und sich diesem nähert. In der letzten Sitzung wurde das Objekt durch eine neue WT-Fremdmaus ersetzt. Die Positionen von Objekt und Fremder 1 wurden zufällig abgewechselt, um eine Seitenpräferenz zu verhindern.

Die Mäuse wurden vorsichtig auf den rotierenden Stab des Rotarod-Geräts (Stoelting) gesetzt, gefolgt von einer Erhöhung der Geschwindigkeit des Stabes von 4 auf 40 U/min über 5 Minuten. Die Experimente wurden an fünf aufeinanderfolgenden Tagen durchgeführt, wobei die Latenzzeit bis zum Sturz vom Stab gemessen wurde.

Mäuse in einem runden Tank (100 cm Durchmesser), gefüllt mit weißem, undurchsichtigem Wasser (22–24 °C), wurden darauf trainiert, eine versteckte Plattform (10 cm Durchmesser) zu finden. Die Lernphase bestand aus 3 Versuchen pro Tag über 5 Tage. Für den Sondentest (1 Minute) wurde die Plattform entfernt und die Zeit gemessen, die eine Maus damit verbrachte, jeden Quadranten zu erkunden. Beim Umkehrtest (3 Tage) wurde die Plattform in die gegenüberliegende Quadrantenposition verschoben. Mausbewegungen wurden mit EthoVision XT 10 (Noldus) analysiert.

Dieser Test wurde wie zuvor beschrieben44 durchgeführt. Kurz gesagt, unterernährte Mäuse mit einem Körpergewicht von 80–85 % des Normalbereichs wurden 2 Tage lang für 5 Minuten an die T-Labyrinth-Arena gewöhnt, gefolgt von einem Training mit 20 μl 70 % Milchbelohnung für 10 Tage.

Am Startpunkt platzierte Mäuse durften die beiden Arme des Labyrinths frei erkunden. Wenn eine Maus in einen der beiden Arme eindringt, wird sie für die nächste Runde, die zehnmal wiederholt wird, zum Startpunkt zurückgebracht, nachdem sie 5 Sekunden im Arm verbracht hat.

Mäusen, die am ersten Tag 60 Minuten lang an eine Freilandbox gewöhnt waren, wurden am zweiten Tag 11 Minuten lang zwei identische Objekte präsentiert. Am dritten Tag wurde eines der Objekte durch ein neuartiges ersetzt. Die Objekterkennung wurde anhand der Zeitspanne gemessen, in der die Nase der Maus auf das Objekt zeigte.

Am ersten Tag wurden die Mäuse 5 Minuten lang an die Schockkammer (Coulbourn Instruments) gewöhnt. Am zweiten Tag verbrachte eine Maus 3 Minuten in der Kammer, bevor sie zu den Zeitpunkten 3, 4 und 5 Minuten Fußschocks (0,8 mA) erhielt und die Gefriergrade während 3–6 Minuten quantifiziert wurden. Am dritten Tag wurden die Mäuse erneut 5 Minuten lang ohne Fußschock der Kammer ausgesetzt und die Gefriergrade während dieser 5 Minuten wurden quantifiziert. Das Gefrierverhalten wurde mit der FreezeFrame 3-Software (Coulbourn Instruments) analysiert. Zur kontextuellen Auslöschung der Angst wurden Mäuse an 10 aufeinanderfolgenden Tagen jeweils 5 Minuten lang derselben Schockkammer ausgesetzt.

Mäuse ohne Gewöhnung verbrachten 3 Minuten in der Kontext-A-Schockkammer, bevor sie 30 Sekunden lang einen akustischen Hinweis (4 kHz, 75 dB) erhielten, der mit einem 2 Sekunden langen Fußschock (0,8 mA) endete. Diese Konditionierung wurde dreimal im Abstand von einer Minute wiederholt. Vierundzwanzig Stunden später wurde eine Maus in Kontext B platziert, wo sie sich drei Minuten lang aufhielt, bevor sie drei Minuten lang denselben akustischen Hinweis erhielt. Das Gefrierverhalten während dieses 3-minütigen Zeitraums wurde analysiert.

Wir haben Mäuse einem kontextuellen Angstkonditionierungstest unterzogen, wobei wir ein weniger eindeutiges Kontextpaar (A und B) verwendeten, das einen identischen Metallgitterboden hatte, aber einzigartige Tapeten, Bodenfarben und Beleuchtung aufwies. In diesem Protokoll erfolgte die Angstkonditionierung schrittweise über mehrere Tage, um die Auswirkungen wiederholter Erfahrungen zu untersuchen. Die Experimente wurden unter den gleichen Zeit-, Temperatur- und Luftfeuchtigkeitsbedingungen durchgeführt: 14–21 Uhr, 20–22 °C und 45 %. Jeder Versuch wurde nach Gewöhnung an den Käfig für 30–60 Minuten und zweimal täglich durchgeführt. An den Tagen 1–3 des Experiments wurden die Mäuse für 180 s in eine Schockkammer gesetzt, ihnen 2 s lang ein einzelner Fußschock von 0,8 mA verabreicht und nach 60 s wieder herausgenommen. An den Tagen 4 und 5 wurden Mäuse jedes Genotyps zur Verallgemeinerung in zwei Gruppen eingeteilt, eine besuchte Kammer A und die andere besuchte Kammer B (ein Versuch/Tag) für 4 Minuten am Tag 4 und besuchte die nicht besuchten Kammern am Tag 5. Mäuse erhielten während der Generalisierung keinen Fußschock, und das Einfrieren wurde beurteilt. An den Tagen 6–13 besuchten die Mäuse zum Diskriminierungstraining 8 Tage lang jeden Tag die beiden Kammern und erhielten immer einen Fußschock (0,8 mA für 2 s) alle 180 s, nachdem sie in Kammer A, aber nicht in Kammer B platziert wurden, gefolgt von 1 mehr Mindestaufenthalt. Das Einfrieren während der ersten 3-minütigen Exposition in jeder Kammer wurde zur Berechnung des täglichen Diskriminierungsverhältnisses verwendet.

Alle Verhaltensergebnisse wurden blind analysiert.

Zitierweise für diesen Artikel: Park, H. et al. Mäuse, denen die PSD-95-interagierende E3-Ligase Dorfin/Rnf19a fehlt, zeigen eine verminderte adulte Neurogenese, eine verstärkte Langzeitpotenzierung und eine beeinträchtigte kontextuelle Angstkonditionierung. Wissenschaft. Rep. 5, 16410; doi: 10.1038/srep16410 (2015).

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Diese Arbeit wurde vom Brain Research Program der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, finanziert vom Ministerium für Wissenschaft, IKT und Zukunftsplanung (2014047939 an HK) und dem Institute for Basic Science (IBS) (IBS-R002-D1). zu EK).

Graduate School of Medical Science and Engineering, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), Daejeon, 305-701, Korea

Hanwool Park

Abteilung für Biowissenschaften, KAIST, Daejeon, 305-701, Korea

Jinhee Yang, Ryunhee Kim, Chungwoo Lee, Jongil Park & Eunjoon Kim

Zentrum für synaptische Hirnstörungen, Institut für Grundlagenwissenschaften (IBS), Daejeon, 305-701, Korea

Yan Li, Yeunkum Lee und Eunjoon Kim

Abteilung für Anatomie und Abteilung des Gehirns Korea 21. Biomedizinische Wissenschaft, College of Medicine, Korea University, Seoul, 136-704, Korea

Dongmin Lee und Hyun Kim

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JY führte Y2H-, Pulldown- und einen Teil von Koimmunpräzipitationsexperimenten durch; RK führte einen Teil elektrophysiologischer Experimente und Experimente zur Neurogenese bei Erwachsenen durch; YL führte Experimente zur Neurogenese bei Erwachsenen durch; YL führte In-vitro-Ubiquitinierungstests durch; JP und CL führten einen Teil der Verhaltensexperimente durch; DL führte In-situ-Hybridisierungsexperimente durch; HP führte alle anderen Experimente durch; EK und HK haben das Manuskript geschrieben.

Die Autoren geben an, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Park, H., Yang, J., Kim, R. et al. Mäuse, denen die PSD-95-interagierende E3-Ligase Dorfin/Rnf19a fehlt, zeigen eine verminderte adulte Neurogenese, eine verstärkte Langzeitpotenzierung und eine beeinträchtigte kontextuelle Angstkonditionierung. Sci Rep 5, 16410 (2015). https://doi.org/10.1038/srep16410

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Eingegangen: 01. Juni 2015

Angenommen: 14. Oktober 2015

Veröffentlicht: 10. November 2015

DOI: https://doi.org/10.1038/srep16410

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